國科金申請范例

1、題目：腎素血管緊張素系統(tǒng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制及其對腫瘤免疫的作用摘要：腫瘤通過免疫逃避機(jī)制引起T淋巴細(xì)胞凋亡和增生受抑，而組織腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)對多種組織細(xì)胞的增生和凋亡有重要的調(diào)節(jié)作用。本課題從時間動力學(xué)角度，以T細(xì)胞激活誘導(dǎo)的凋亡（AICD）為重點，分析RAS在細(xì)胞免疫中的表達(dá)變化、RAS對細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制，隨之初步探討干預(yù)RAS抑制腫瘤細(xì)胞引起的T淋巴細(xì)胞AICD的可能性。為細(xì)胞免疫和腫瘤免疫的調(diào)節(jié)提供新的思路。研究意義腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和消退取決于與機(jī)體免疫系統(tǒng)的相互作用，研究腫瘤免疫的機(jī)制和影響因素，對于明確腫瘤的發(fā)生，和發(fā)展合理的免疫治療方案均有重要意義。本項目旨在對

2、于腎素血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system, RAS）這一調(diào)節(jié)包括細(xì)胞增生和凋亡等多種重要功能的系統(tǒng)，研究其免疫調(diào)節(jié)作用和機(jī)制，并初步研究RAS對于腫瘤免疫的作用。本項目的思路如圖：機(jī)體對腫瘤的免疫反應(yīng)主要是T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，雖然多種腫瘤特異和腫瘤相關(guān)抗原已經(jīng)分離鑒定，腫瘤免疫反應(yīng)的先決條件已經(jīng)具備，但在大多數(shù)情況下，機(jī)體對腫瘤的免疫反應(yīng)是無效和微弱的。主要原因是腫瘤在與機(jī)體的對抗和選擇過程中發(fā)展的免疫逃避和免疫抑制機(jī)制：1）腫瘤低表達(dá)MHC I，不表達(dá)MHC II和共刺激分子配基如B7; 2)腫瘤抗原的喪失和遮蔽；3)腫瘤分泌免疫抑制因子如TGF-beta

3、,IL-6和IL-10；4）腫瘤誘導(dǎo)免疫耐受；5）腫瘤或者通過表達(dá)FasL，直接殺傷激活的T淋巴細(xì)胞，或者通過重定向細(xì)胞免疫（TH1-TH2）、激活NK1.1+/CD3+細(xì)胞等機(jī)制間接誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞通過AICD凋亡。雖然腫瘤的免疫豁免機(jī)制復(fù)雜多樣，最終結(jié)果是腫瘤特異性的T淋巴細(xì)胞的增生受抑和凋亡，從而導(dǎo)致對腫瘤的免疫無反應(yīng)性1。調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增生凋亡是調(diào)節(jié)腫瘤免疫的一個重要靶點。腎素血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system, RAS）是機(jī)體進(jìn)化過程中高度保守的內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)，其對血壓和水鈉儲留調(diào)節(jié)的傳統(tǒng)的生物學(xué)功能已為人們所熟知，但愈來愈多的研究表明RAS具有廣泛的生物學(xué)功能

4、，而“組織”RAS在局部表達(dá)通過自分泌和旁分泌作用，對細(xì)胞分化、增殖和凋亡的調(diào)節(jié)作用成為研究熱點2。RAS的促進(jìn)增殖和凋亡的作用已在包括心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及多種上皮來源細(xì)胞如血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞等細(xì)胞組織證實3。在細(xì)胞免疫中，T淋巴細(xì)胞已證實表達(dá)RAS的各組成成分，組織RAS起作用的先決條件已經(jīng)具備；血管緊張素II促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞自發(fā)增殖和在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中增殖4，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑卡托普利抑制T淋巴細(xì)胞AICD和Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡, 在一些免疫介導(dǎo)的炎癥中起保護(hù)作用5，提示RAS對T淋巴細(xì)胞的增生和凋亡這兩種看起來截然相反的過程均有重要的促進(jìn)作用。在

5、細(xì)胞免疫中，機(jī)體對免疫細(xì)胞的增生和凋亡的調(diào)節(jié)體現(xiàn)在克隆選擇和時間動力學(xué)控制上。正常的免疫反應(yīng)是一個多階段的過程，在免疫反應(yīng)中，T細(xì)胞通過抗原識別和TCR/CD3信號，通過JAK/STAT、calcineurin/NFAT、MAPK等多種信號傳導(dǎo)途徑，引起T淋巴細(xì)胞激活、增生和細(xì)胞因子分泌；同時，F(xiàn)as/FasL，CTLA-4等表達(dá)增加，Bcl2/Bax、FLIP等凋亡抑制因子下調(diào)，凋3亡敏感性逐步增加，使激活的T細(xì)胞發(fā)生凋亡6。在細(xì)胞周期中，TCR/CD3信號引起細(xì)胞周期的進(jìn)展和細(xì)胞激活增生，而進(jìn)入G1A但不能通過G1/S調(diào)定點的細(xì)胞將通過AICD凋亡7。機(jī)體通過對信號傳導(dǎo)通路和細(xì)胞周期的調(diào)控

6、，使細(xì)胞的表型和細(xì)胞因子分泌、關(guān)鍵細(xì)胞蛋白發(fā)生有序變化，從而實現(xiàn)免疫細(xì)胞增生和凋亡的精確調(diào)控，既保證免疫反應(yīng)，又避免免疫反應(yīng)過度，保持免疫穩(wěn)態(tài)。(如圖：)： RAS能通過多條信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用，在T淋巴細(xì)胞可能影響calcineurin/NFAT途徑4。RAS信號傳導(dǎo)與TCR/CD3信號的相互作用（拮抗和協(xié)同/相加）和其作用時T細(xì)胞所處的狀態(tài)，將決定RAS調(diào)節(jié)凋亡和增生的方向。我們設(shè)想RAS對免疫的調(diào)節(jié)作用，不在于它能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增生還是凋亡，而在于RAS調(diào)節(jié)增生和凋亡作用是否和正常免疫反應(yīng)的動力學(xué)相吻合，從而決定RAS起促進(jìn)或抑制作用。當(dāng)然，此設(shè)想過于簡化，但是，從時間動力學(xué)角度，分析R

7、AS在細(xì)胞免疫反應(yīng)的不同階段，尤其是在細(xì)胞激活增生階段和AICD凋亡階段的作用，將對正確理解RAS免疫調(diào)節(jié)作用有重要意義。而最新研究血管緊張素II促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞自發(fā)增殖，和在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中增殖，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑卡托普利抑制T淋巴細(xì)胞AICD和Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡，提示RAS信號和正常的免疫反應(yīng)CD3/TCR信號和時間動力學(xué)能起協(xié)同作用。本項目1）以人周圍血T淋巴細(xì)胞為實驗對象，以CD3/TCR信號刺激T細(xì)胞激活增殖、和激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（AICD）兩階段為主，從時間動力學(xué)角度，力圖從總體上把握RAS對細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用。2）重點分析RAS對T細(xì)胞AICD的調(diào)節(jié)作用，初步分析RA

8、S對腫瘤介導(dǎo)的T細(xì)胞AICD這一重要免疫逃避機(jī)制的調(diào)節(jié)作用。從動力學(xué)角度分析RAS對T淋巴細(xì)胞增生和凋亡的調(diào)節(jié)作用，有助于真正明確RAS的免疫調(diào)節(jié)作用和機(jī)制，從而為發(fā)展新的免疫調(diào)節(jié)手段開辟途徑。由于包括胃癌和肝癌等多種腫瘤組織低表達(dá)或不表達(dá)RAS8,多種成熟的和高特異性的RAS干預(yù)手段和藥物的存在，預(yù)示著調(diào)節(jié)RAS在調(diào)節(jié)腫瘤免疫和腫瘤免疫治療方面的廣泛前景。國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀RAS在心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞等多種組織和細(xì)胞的增生和凋亡調(diào)節(jié)作用及其信號傳導(dǎo)通路已進(jìn)行了深入研究，證明RAS對細(xì)胞增生和凋亡起重要調(diào)節(jié)作用。近兩年來RAS對免疫的調(diào)節(jié)作用逐漸引起重視，目前已經(jīng)證明：1）T細(xì)胞

9、和巨噬細(xì)胞表達(dá)RAS各組成成分；2）血管緊張素II能通過AT1受體促進(jìn)T細(xì)胞增殖 ，敲除小鼠AT1受體能阻斷ANGII的作用；3）血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑卡托普利抑制T淋巴細(xì)胞AICD和Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡；4）血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑對免疫性炎癥有保護(hù)作用; 5)RAS參與T細(xì)胞的calcineurin/NFAT信號傳導(dǎo)通路。但尚有幾個關(guān)鍵問題沒有解決：1）大多數(shù)實驗結(jié)果來源于動物實驗；2）大部分研究局限于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，而未對RAS進(jìn)行系統(tǒng)性的研究。3）雖然提示RAS對T細(xì)胞的增生凋亡均有促進(jìn)作用，但未闡明RAS如何調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增生和凋亡這兩種看起來相反的作用，以及RAS對細(xì)胞免

10、疫調(diào)節(jié)的最終效果；4）未闡明RAS調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞功能的信號傳導(dǎo)通路和細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制。RAS在腫瘤免疫方面的研究國內(nèi)外尚是空白。 3 三、研究方案1. 研究目標(biāo)、研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題研究目標(biāo)1） 檢測RAS各組成成分在淋巴細(xì)胞的mRNA和蛋白表達(dá)。2） 從時間動力學(xué)角度，以T細(xì)胞激活增殖、和激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（AICD）兩階段為主，在免疫反應(yīng)的包括：靜止-激活（細(xì)胞因子分泌）-增生/分化-免疫下調(diào)（細(xì)胞凋亡和記憶細(xì)胞形成）過程中的不同階段，分析 RAS的表達(dá)變化，分析RAS對T細(xì)胞細(xì)胞因子分泌、增生和凋亡（AICD）的影響。3） 探討RAS對T淋巴細(xì)胞AICD調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞信號傳導(dǎo)機(jī)制。

11、4） 檢測RAS在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，初步探討RAS對腫瘤介導(dǎo)的T細(xì)胞AICD這一重要免疫逃避機(jī)制的調(diào)節(jié)作用。研究內(nèi)容1） 收集健康志愿者新鮮周圍血PBMC，采用CD3單克隆抗體刺激T細(xì)胞，輔以IL-2，制作T細(xì)胞多克隆激活免疫反應(yīng)和AICD的模型。根據(jù)T細(xì)胞的表型（phenotype：包括細(xì)胞因子分泌情況和表面分子marker的表達(dá)）對免疫反應(yīng)進(jìn)行分期。2） 分析 RAS對于T細(xì)胞細(xì)胞因子分泌、增生和凋亡的影響，明確RAS免疫調(diào)節(jié)作用的時間動力學(xué)。在T細(xì)胞激活增殖、和激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（AICD）兩階段：a) 定性和定量測定RAS組成成分（血管緊張素原、AngII和AT1受體）的表達(dá)及其變化情

12、況。b) 采用AngII、ACEI(包括Captopril和Enalapril)和AT1受體特異阻斷劑（Losartan）在不同層次上對RAS進(jìn)行干預(yù)，分析 RAS對于T細(xì)胞細(xì)胞因子分泌、增生和凋亡的影響。3） 從細(xì)胞信號傳導(dǎo)機(jī)制明確RAS的對T細(xì)胞凋亡和AICD的調(diào)節(jié)機(jī)制。檢測T細(xì)胞兩條主要凋亡通路的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)分子：Bcl-2(線粒體/細(xì)胞色素C凋亡途徑)，F(xiàn)LIP（AICD，F(xiàn)as/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑），分析RAS調(diào)節(jié)何種T細(xì)胞凋亡通路，及其在傳導(dǎo)通路上的調(diào)節(jié)作用點。4） 收集同一腫瘤患者的PBMC和腫瘤切除標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞并培養(yǎng)，定性定量測定腫瘤細(xì)胞的RAS組成成分表達(dá)。制作M

13、HC限制的腫瘤細(xì)胞免疫抑制和腫瘤誘導(dǎo)T細(xì)胞AICD模型，分析RAS對腫瘤誘導(dǎo)T細(xì)胞AICD的調(diào)節(jié)作用。擬解決的關(guān)鍵問題：1） 明確RAS在免疫反應(yīng)不同階段的作用，在免疫反應(yīng)過程中的免疫調(diào)節(jié)作用的動力學(xué)，以及RAS免疫調(diào)節(jié)作用的綜合效果。2） 明確RAS對T細(xì)胞AICD調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞信號傳導(dǎo)機(jī)制。3） 制作MHC限制的腫瘤細(xì)胞免疫抑制和腫瘤誘導(dǎo)T細(xì)胞AICD模型。4） 合理選用RAS干預(yù)手段，調(diào)整RAS調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)腫瘤免疫。42. 擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實驗方案及可行性分析研究方法a) 細(xì)胞生物學(xué)方法：腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)；人周圍血T淋巴細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)和激活。b) 分子生物學(xué)方法：免

14、疫組化、RT-PCR、western blot、Northern Blot定性定量測定c) 免疫學(xué)方法：流式細(xì)胞儀測量細(xì)胞周期、雙染色測定細(xì)胞凋亡；H3攝入測定細(xì)胞增生活性，JAM-Test定量測定細(xì)胞凋亡；免疫熒光法測定Caspase3活性。腫瘤細(xì)胞/淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)。技術(shù)路線分為兩部分，兩部分有交叉5實驗方案說明：可行性分析本課題思路明確，技術(shù)路線可行，課題組成員均參加過省部級項目研究，具備相關(guān)實驗技術(shù)和方法；已熟練掌握課題中所需要的細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)，免疫學(xué)技術(shù)，流式細(xì)胞術(shù)，而且大部分技術(shù)在以往或正在進(jìn)行的項目中使用；本課題組具有治療普外科腫瘤包括胃癌、肝癌的豐富臨床經(jīng)驗，在胃癌的免疫治

15、療方面較有心得。以上情況說明我們有能力在此領(lǐng)域開展深入研究。本項目的創(chuàng)新之處：1. 率先開展對組織腎素血管緊張素系統(tǒng)對細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用的深入研究，結(jié)合細(xì)胞滿意動力學(xué)分析明確RAS的免疫調(diào)節(jié)作用，并深入研究起作用的信號傳導(dǎo)和細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制。目前尚未發(fā)現(xiàn)對RAS免疫調(diào)節(jié)作用較為系統(tǒng)的研究及相關(guān)文獻(xiàn)。2. 率先開展RAS對腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用的探討，本研究可能的RAS干預(yù)方法機(jī)制調(diào)節(jié)腫瘤免疫。目前國內(nèi)外在此方面尚是空白。4. 年度研究計劃及預(yù)測進(jìn)展2003年1月2004年12月：收集胃癌、肝癌組織標(biāo)本。測定腫瘤組織RAS表達(dá)與正常組織的差別。2003年1月2003年5月：人周圍血淋巴細(xì)胞RAS表達(dá)的檢測2003年3月2003年7月：完成Northern Blot、western Blot、RT-PCR等檢測技術(shù)、CD3抗體/IL-2激活淋巴細(xì)胞、增生和凋亡檢測等的技術(shù)考核。2003年8月2004年3月：完成RAS對免疫細(xì)胞增生、凋亡和細(xì)胞因子分泌的作用檢測。2004年4月2004年5月：階段總結(jié)，合理調(diào)整思路，準(zhǔn)備對RAS調(diào)節(jié)機(jī)制的研究。2004年5月2004年12月：RAS免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的研究。2005年1月2006年