幽門螺旋桿菌候選疫苗抗原的研究進展.docx

1、doi：10.3969/j.issn.100084X.2018.06.032幽門螺旋桿菌候選疫苗抗原的研究進展趙翠趙福廣黃利亞(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春130118)中圖分類號Q936文獻標志碼A文章編號1000184X(2018)064)9574)5摘要幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori,HP)是1983年首次從慢性活動性肖炎患者的肖黏膜組織中分離成功，是目前所知能夠在人胃中生存的唯一微生物種類,本文對HP的尿素酶、空泡毒素、細胞毒素、黏附素、過軾化氫酶、膜炎性蛋白、十二指腸潰瘍促進因子及脂多舫抗原進行闡述，以便學(xué)者對HP抗原的研究近況進行了解，對未來篩選高效抗原并增加

2、抗原的表達責(zé)、探索HP表位疫苗中表位結(jié)合的新型方式等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞幽門螺旋桿菌;疫苗;候選抗原;免疫原性ResearchprogressofHelicobacterpylorivaccineantigenZHAOCui,ZHAOFu-Guang,HUANGLiYa.CollegeofLifeSciences,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,C/iina:AbstractHelicobacterpyloriwasseparatedfromgastricmucosaofchronicgastritispatientsforthefi

3、rsttimein1983,anditistheonlyspeciesknowntobeabletosurviveinthehumanstomach.TheUrase,Vacuolatingcytotoxin,cytotoxin,adhesin,catalase,OuterInflammatoryProtein,duodenalulcerpromoterfactorandlipopolysaccharideantigenofHPwerereviewedinthispaper,sothatscholarscanunderstandtherecentresearchsituationofHPant

4、igen.Theabovestudylaysthefoundationforfuturescreeningofhighefficientantigenandincreasingtheexpressionofantigen,andexploringnewmethodsofepitopebindinginHPepitopevaccine.KeywordsHelicobacterpylori；Vaccine；Candidateantigen;Immunogenicity1前言HP是一種螺旋形，寄居于人胃黏膜上的一種革蘭氏陰性微需氧菌，對生長條件要求十分苛刻。HP不依賴組織入侵的方式定植于胃上皮黏膜，

5、這在很大程度上有利于逃避宿主免疫機制，同時，HP有整合環(huán)境DNA的能力，這種能力增加了HP在變化的環(huán)境中得以生存的機會。HP感染后的臨床表現(xiàn)多樣性提示了HP致病機制的復(fù)雜性。在與疾病的相關(guān)性方面,HP是慢性胃炎、十二指腸潰瘍等的主要致病菌，且與胃癌、胃黏膜相關(guān)淋巴組織(Mucosaassociatedlymphoidtissue,MATL)惡性淋巴痛的發(fā)生有密切聯(lián)系。最近的研究表明，HP與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)聯(lián)性呈上升趨勢，此外在多發(fā)性硬化患者中HP檢出率極低，推測HP可能是發(fā)展多發(fā)性硬化的保護因子。在對HP疫苗的探究過本文受長春科技局重大科技攻關(guān)項目(No.14KG056)資助。作者簡介:趙猥

6、，女，碩士，主要從事微生物與分子免疫學(xué)方面研究，E-mail：1257218621。通訊作者及指導(dǎo)教師：趙福廣，男.博士.副教授.碩士生導(dǎo)嬸.主要從審動物微生物與分子免疫學(xué)方面研究,E-mail:felixfuguang。程中，圍繞全iW體抗原進行的攻毒試驗獲得了較為理想的免疫保護率，但因其成分復(fù)雜,安全性差等缺點，將其作為疫苗應(yīng)用于人體，還需進一步研究。因此,研制一種經(jīng)濟、高效、安全的治療性疫苗是防治HP感染的有效途徑，而篩選高效抗原又是疫苗研制工作的重中之重，本文就HP疫苗的候選抗原的研究近況及發(fā)展前景作一綜述。2抗原研究進展2.1尿素酶尿素酶(Urase)位于細菌表面，包括UreA和Ur

7、eB兩個結(jié)構(gòu)基因，其豐富的蛋白含量約占全菌蛋白的5%10%。在HP的致病機制方面,尿素酶主要通過水解尿素產(chǎn)生氨和二氧化碳，調(diào)肯細菌細胞周圍的pH值，是HP在高強度胃酸中得以生存和定植的關(guān)鍵，同時尿素酶是HP重要的定植因子和毒力因子，因此，“無酸無潰瘍”的傳統(tǒng)觀點已經(jīng)被打破。目前，對尿素酶的研究比較廣泛，秦玉紅等將純化的rUreB蛋白加弗氏佐劑經(jīng)腹腔注射免疫小鼠,可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的特異性抗體,測得小鼠血清中的IgG抗體水平較對照組相比顯著增加，同樣的結(jié)果體現(xiàn)在Zhang等的研究中。隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)將尿素酶和其他能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫保護作用的抗原聯(lián)合制成二價或多價疫苗，可能會進一步增強疫

8、苗的免疫效果。林煥建等通過UreB和過氧化氫的加免疫佐劑CT制成二價口服疫苗，獲得了近83.4%的免疫保護率，與單價疫苗組即過氧化氫前加CT組的41.7%和UreB加CT組的54.2%相比獲得了較為理想的免疫效果，且二價疫苗組中小鼠胃黏膜中HP的定植密度也明顯降低。更多可喜的研究結(jié)果體現(xiàn)在Zhou等"I的研究中。雖然不同地區(qū)的HP菌株具有多樣性和易變異等特點，但不同HP菌株間UreB的核酸序列具有高度的保守性和同源性，區(qū)分子量:大，特異性強，能有效地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生穩(wěn)定的免疫保護作用，與treA相比,UreB具有更好的免疫保護作用”°】。因此，UreB被列為最有前景的候選抗原之

9、一。2.2空泡毒素和細胞毒素2.2.1空泡毒素空泡毒素相關(guān)基因A(VacuolatingcytotoxingenA,VacA)編碼的VacA蛋白是HP中重要的毒力因子和致病因子。有研究表明,VacA和CagA基因的可變序列可能是HP菌株多樣性和易變異的主要原因。目前，根據(jù)VacA和CagA的表達情況，可將HP分為兩類：1型(CagA*VacA*)和II型(CagA"VacA")oVacA是一種約含有860個氨基酸殘基的多功能蛋白，該毒素通過在靶細胞膜上形成小孔,導(dǎo)致細胞中離子和小分子物質(zhì)泄漏VacA最重要的生物學(xué)作用是誘導(dǎo)宿主細胞的細胞膜孔隙與空泡的形成，誘導(dǎo)上皮細胞空泡樣

10、損傷Chiozzi等'研究表明:VacA口J誘發(fā)炎癥反應(yīng)，而VacA與氯化鉉聯(lián)合作用，在誘發(fā)炎癥反應(yīng)的同時，還可使人胃上皮細胞加速凋亡。Hasanzadeh等”將VacA的抗原區(qū)克隆到載體PET32a中，并在大腸桿菌BL21中表達目的蛋白，結(jié)果表明VacA蛋白不但具有抗原性,且重組VacA蛋白能夠與HP患者血清中IgG特異性識別。由以上結(jié)果不難看出VacA作為HP疫苗候選抗原的潛力，并推測VacA可以用于HP診斷試劑和HP疫苗的發(fā)展，但VacA單獨作為抗原對小鼠進行攻毒試驗并評價免疫效果的研究很少，一般是與細胞毒素相關(guān)基因A或其他抗原聯(lián)合應(yīng)用。2.2.2細胞毒素細胞毒素相關(guān)基因A(Cy

11、toloxin-associatedgenA,CagA)的表達產(chǎn)物CagA蛋白是一種免疫原性較強，存在于菌體表面的外膜蛋白。CagA基因夕端高度保守，不同毒力菌株之間的同源性高達80%以上，可以作為候選抗原刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，與此相反的CagA基因3,端相對多變，含有不同數(shù)量的重復(fù)序列。CagA是HP中能增強胃炎、消化性潰瘍的一種重要的毒力因子，還可能是胃上皮細胞癌變的關(guān)鍵因素"句。據(jù)早些年研究表明”，CagA陽性曲株常見于炎癥較為嚴重或胃癌患者中，這些患者胃上皮細胞中的AP-1和NFKB等轉(zhuǎn)錄因子活性升高，其激活可導(dǎo)致多種炎癥因子如1FN-)、IL-2等的表達，從而加劇胃黏膜損傷

12、。再者，T細胞的FasL基因啟動子區(qū)域有2個NF-kB和3個AP-1結(jié)合位點,CagA可能通過激活轉(zhuǎn)錄因子增強T細胞FasL基因的表達，損害Fas陽性上皮細胞，促進T細胞間“相互殘殺”。因此以上研究并不支持CagA用于候選抗原的應(yīng)用。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)CagA基因完整的DNA序列因其含有非必需表位和較高分子質(zhì)蚯,不易克隆和表達。因此，研究者們選擇將CagA部分基因序列與其他抗原聯(lián)合，制備二價甚至多價疫苗，并在動物模型中取得了較為可喜的成果，同時開啟由HP單價疫苗轉(zhuǎn)向多價疫苗的時代心氣近些年來，對VacA和CagA的研究僅限于動物模型，鮮有VacA和CagA疫苗進入臨床試驗的相關(guān)報道,但對二

13、者的研究熱度并沒有因此而減少。由于多抗原融合疫苗參與發(fā)病的不同階段，因而獲得r較為理想的免疫效果，為HP多價疫苗的發(fā)展提供一定的理論支持,HP多價疫苗可能是攻克HP感染道路上的成功一步。2.3黏附素黏附素(HelicobacterpyloriadliesinA,HpaA)是由HpaA基因編碼的脂蛋白，不同HP菌株間高度保守，迄今為止，并沒有發(fā)現(xiàn)HpaA陰性菌株。HpaA介導(dǎo)HP的黏附與定植，具有較好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，但發(fā)揮免疫保護作用的關(guān)鍵表位和分子機制尚不明確。有研究表明，HpaA由胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)、胞外區(qū)三個部分組成,其中跨膜區(qū)和胞外區(qū)發(fā)揮免疫保護作用，因此，F(xiàn)lach等利用截短形式的

14、HpaA聯(lián)合UreB免疫C57BL/6小鼠，與對照組全長的HpaA聯(lián)合UreB相比較,HP特異性抗體IgG的滴度顯著升高。近期,Tobias等構(gòu)建重組無毒的霍亂弧菌，將HpaA和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌定植因子(CFA/I)共表達(VC-HpaA-CFA/I),發(fā)現(xiàn)與VC-HpaA相比,HpaA水平在重組菌株VC-HpaA-CFA/I中的表達最更高,理論上，此種疫苗可以對抗包括大腸桿菌、幽門螺旋桿曲、霍亂弧菌在內(nèi)的三種病原體，可能成為抗HP感染的潛在候選疫苗，為今后研制對抗多種病原體疫苗提供更多的理論支持，但此疫苗的安全性有待進一步評估。2.4過氧化氧酶過氧化氫酶(Catalase,KatA)是一種高

15、度保守，暴露于菌體表面的蛋白酶，約占HP菌體蛋白的1-5%左右。在功能上KatA與Urase似乎有著異曲同工之妙,KatA通過將有毒的代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成水,保證代謝平衡的同時，保護HP免受中性粒細胞殺傷，是HP逃避宿主免疫的重要組成部分°同時KatA在pH<3的環(huán)境中仍可保持活性，是HP在胃黏膜極酸環(huán)境中得以定植和生存的關(guān)鍵。近些年，關(guān)于KatA表位疫苗的研究較多，并證實含有較少氨基酸序列的KatA表位疫苗等同甚至優(yōu)于KatA全序列疫苗m”：。隨著研究的深入,KatA抗原與疾病的美聯(lián)程度備受關(guān)注，尤其是在胃癌中。有研究表明)，較高的KatA抗體滴度在一定程度上可以預(yù)防胃癌的發(fā)生，并

16、可以作為胃癌篩選的生物標志物。經(jīng)查閱文獻可以看出，在2010年甚至更早以前涌現(xiàn)了大量關(guān)于證實KatA免疫原性的研究24J5為KatA作為HP疫苗候選抗原、K&tA聯(lián)合其他抗原、KatA表位疫苗的發(fā)展提供理論依據(jù)。雖然表位疫苗的表位識別和正確組裝技術(shù)尚不成熟，表位之間的相互影響仍需探索，但KatA表位疫苗已經(jīng)展現(xiàn)了不俗的發(fā)展前景，這為探究HP疫苗的大方向奠定基礎(chǔ)。2.5膜炎性蛋白膜炎性蛋白(Outerinflammatorypn)trin,OipA)由hopH基因編碼.相對分子質(zhì)量約34kD。關(guān)于OipA與臨床疾病的關(guān)系尚無統(tǒng)一定論,有研究發(fā)現(xiàn)，在胃潰瘍患者中OipA+HP的總檢出率高達

17、100%,顯著高于胃炎患者26.2%的檢出率。相似的結(jié)果也體現(xiàn)在Markovska等的研究中,OipA幾乎表達于從消化性潰瘍患者分離的所有菌株中(97%),在胃炎患者中分離的菌株中較少(66%)。但在最近的研究卻展現(xiàn)相反的結(jié)果,OipA與胃部疾病無關(guān)聯(lián)，不能作為預(yù)測診斷胃腸疾病的標志S。目前，對于OipA能否直接影響促炎性信號還存在爭議，有研究表明，功能性的hopH基因失活導(dǎo)致iL-8分泌減少50%左右，因此功能性的OipA在IL-8的誘導(dǎo)中起著重要作用。與此相反，在Dossumbekova等”的研究中發(fā)現(xiàn)hopH基因表達與IL-8分泌并沒有相關(guān)性。出現(xiàn)上述兩種結(jié)果的原因可能是菌種的區(qū)域性差異

18、，因此，不同地理區(qū)域的臨床報告預(yù)測毒力因子與疾病的發(fā)生結(jié)果是有爭議的。2.6十二指腸潰瘍促進因子DupA(Duodenalulcerpn)motinggene,D叩A(chǔ))被稱為十二指腸潰瘍促進因子，因常見于十二指腸潰瘍患者中而得名。DupA是近些年研究的熱門.因此，圍繞DupA的相關(guān)研究并不完善，研究結(jié)果不盡相同甚至相反。有研究表明不同區(qū)域DupA陽性檢出率不同，且與臨床疾病無顯著相關(guān)性,該研究還發(fā)現(xiàn),DupA的存在與否與HP的其他毒力因子無關(guān)。同年Shiota等劉表明，DupA與十二指腸潰瘍密切相關(guān),但與胃癌的關(guān)系尚不明確。近年來Souod等向i通過研究DupA.OipA與胃部疾病的關(guān)系中指出

19、,DupA可以作為預(yù)測十二指腸潰瘍的標志物和胃癌的抑制因子，同時發(fā)現(xiàn)HP中的一些毒力因子并不單獨存在，而是與其他毒力因子聯(lián)合形成“協(xié)同活性”，此研究結(jié)果與Shiota等甄完全相反。最近，在探索HP中毒力因子與胃部疾病的關(guān)聯(lián)性發(fā)現(xiàn)，HP中的毒力因子之間存在關(guān)聯(lián)性(VacA、CagA、DupA、OipA),這種關(guān)聯(lián)性與胃部疾病聯(lián)系緊密，特別是胃炎)。以上種種結(jié)果不難看出，雖然圍繞DupA的相關(guān)研究日漸廣泛，但關(guān)于DupA與臨床疾病的關(guān)聯(lián)性尚無統(tǒng)一定論，且目前并沒有關(guān)于D叩A(chǔ)作為候選抗原制成HP疫苗的相關(guān)報道°2.7脂多糖脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是重要的毒力因

20、子，被認為是引起黏膜炎癥反應(yīng)的一種強效內(nèi)毒素，介導(dǎo)多種細胞因子和趨化因子的釋放，從而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的發(fā)生】。LPS主要表達LewisX和LewisY抗原決定簇，HP患者產(chǎn)生Lewis抗原決定簇抗體并通過自身免疫反應(yīng)造成胃黏膜損傷和潰瘍創(chuàng)面形成此外LPS促進Thl型免疫應(yīng)答反應(yīng),并在受試小鼠體內(nèi)檢測到細胞因子IFN-)增加,這可能是消除HP感染的關(guān)鍵1可。在對此種抗原的學(xué)習(xí)和查閱文獻中發(fā)現(xiàn)，LPS的研究現(xiàn)狀處于探究其生物活性，評價免疫原性階段，且對其引起免疫應(yīng)答的類型處于研究探索中，因此，尚且沒有LPS作為抗原或與其他抗原聯(lián)合制備HP疫苗的相關(guān)報道。3前景展望除上述幾種抗原外，中性粒細胞激活蛋白(

21、Nap)列、熱休克蛋白(Hsp)都有作為候選抗原的相關(guān)報道，在這里不再一一概述。就HP疫苗的研究現(xiàn)狀而言，HP疫苗仍處于實驗階段，現(xiàn)階段的研究成果尚不能完全清除體內(nèi)感染和阻斷HP傳播，且保護率不高的問題在國內(nèi)外一直未有突破。目前為止，尚旦沒有HP疫苗進入臨床的相關(guān)報道，因此，現(xiàn)階段的治療方式仍以抗生素治療為主，但抗生素耐藥性(克拉霉素)成為應(yīng)用抗生素治療失敗的主要原因,基于目前理論研究成果，推薦使用益生菌】和中藥制劑作為輔助治療。HP疫苗的研究尚存在許多問題，但取得的成果不容忽視，Naz等基于反向疫苗學(xué)方法預(yù)測HP疫苗的潛在候選抗原，并預(yù)測VacA、BabA、HpaA等是首要候選抗原?，F(xiàn)如今，

22、大部分的臨床研究已經(jīng)運用重組尿素酶作為抗原?；蛟S研究不同抗原組合的多價疫苗、篩選高效抗原并增加抗原的表達量、探索HP表位疫苗中表位結(jié)合的新型方式是HP疫苗未來的發(fā)展方向。隨著生物學(xué)、信息科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,HP疫苗的研制必將取得成功。參考文獻：1'HanadaK9YamaokaY.GeneticbattlebetweenHelicobacterpylori,andhumans.Themechanismunderlyinghomologousrecombinationinbacteria,whichcaninfecthumancellsJMicrobesInfect.2014116

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42、iangB,初al.SystemicandmucosalprcadministrationofrecombinantHrlicol)acterpylorineutrophilactivatingproteinpreventsovalbumin-inducedallergicasthmainmicefj.FemsMicrobiolLett,2017,364(2)：288-295.36DongHvHuangY,YaoS.ctal.TherecombinantfusionpmteinofcholeratoxinBandneutrophil-activatingproteinexpressedonBa

43、cillussubtilissporesurfacesuppressesallergicinflammationinmiceLJ.ApplMicrobiolBiot,2017J01(3)：1-11.37ChionhYT,ArulmuruganarA,VrendittiE.etal.HealshockproteincomplexvaccinationinducesprotectionagainstHelicobacterpyloriwithouttrxogenousadjuvantJ.Vaccine,201432(20):2350-2358.38趙慧琳.季曉飛.張艷麗.等.分子伴侶幽門螺桿蔭H-p60與Ur