冷凍電鏡技術

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上冷凍電鏡技術課程學習報告一、課程所講基礎知識回顧1、電子顯微鏡成像技術的發(fā)展歷史（1）上世紀50年代的負染技術（分辨率2mm）：該技術的原理為重金屬燃料與H結合，特點為對電子散射強，視野暗，襯度大，易觀察到生物材料。但不足之處在于染料顆粒較大，不易進入分子內(nèi)部。此外，因樣品需要脫水處理，會造成結構失真。（2）上世紀60年代的三維重構技術 三維重構的數(shù)學原理為傅里葉變換，其關鍵性質(zhì)為：三維函數(shù)投影的傅里葉變換等于該三維函數(shù)傅里葉變換在垂直于投影方向上的中央截面。因此，通過對待測立體物質(zhì)的多角度投影信息采集，可以借助數(shù)學的橋梁，重構出該物質(zhì)的三維結構。顯然，對待測物質(zhì)投影

2、采集的角度越多，越精確，重構出的三維圖像越接近真實。 在60年代，T4噬菌體的結構通過該方法被成功解析。（3）上世紀70年代的電子晶體學 即根據(jù)電子衍射的花樣確定物質(zhì)的晶體結構。被觀測的物體通過物鏡形成衍射圖樣，而這些衍射光束的低散射角部分再通過透鏡而形成顯微像。該方法相當于對原物體進行兩次傅里葉變換，一為將物體轉(zhuǎn)換成衍射譜，二為逆傅里葉變換使衍射譜重構成顯微圖像。 在70年代，電子晶體學的發(fā)展使得第1個膜蛋白結構被成功解析。（4）上世紀80年代的快速冷凍技術（分辨率達到0.2nm） 主要原理為將樣品快速冷凍在玻璃態(tài)的水中，樣品不需脫水，結構與在溶液中相同，呈天然狀態(tài)。因此，電鏡成像得到的更接

3、近原物質(zhì)的真實結構，且分辨率高。2、冷凍電鏡技術介紹（1）關于玻璃態(tài)冰：冰的結構多種多樣，包括六角形冰、立方體冰等，其物理狀態(tài)與冷凍速率有關。若要形成玻璃態(tài)（即無定形態(tài)）的冰，需要冷凍速率達到每秒鐘104攝氏度。此時，冰的結構呈現(xiàn)各向同性，不會因成像角度不同導致圖像產(chǎn)生偏差。（2）操作步驟概要： 冷凍包埋轉(zhuǎn)移至液氮或液氦中觀測，圖像采集三維重構（3）圖像采集的質(zhì)量要求： 應保證樣品在玻璃態(tài)冰中的分布均一，厚度一致切適當，避免污染。此外，特別應注意的是，該方法對電子劑量很敏感，最適為10e/A2，明顯超過最適劑量即容易因受到過量電子輻射而破壞物理結構，導致冰迅速汽化，出現(xiàn)氣泡，造成圖像采集不成功

4、。 因此，必須采用低劑量技術（20e/A2），用1k3k倍的低倍鏡尋找，在目標域的臨近區(qū)聚焦，使記錄區(qū)域僅在拍攝時（1s左右）受到電子輻射，保證樣品不被損壞。二、課外補充學習：冷凍電鏡技術難點的擴展閱讀1、冰晶污染冰晶污染是冷凍電鏡的主要問題和最重要的難點，可發(fā)生在冷凍電鏡的各個步驟。在每個步驟中，冰晶污染的形成的主要原因不同。在冷凍制樣階段，冰晶污染形成的原因主要有三點：（1）冷凍速率不夠；（2）冷卻劑的溫度未接近凝點；（3）容器邊緣的小冰晶墜入液氮中黏附在樣品上，或在樣品轉(zhuǎn)移過程，空氣中的水分子凝結在樣品表面。2、電子輻射損傷電子輻射損傷的原因幾乎均可歸結為熱效應，被輻照區(qū)域的損傷大致可分

5、為晶化、升華、起泡和漂移4種類型。（1）晶化與電子束的加速電壓和電子劑量有關，一般發(fā)生在樣品表面，玻璃態(tài)的冰晶化形成立方晶相，失去各向同性。（2）升華也發(fā)生在樣品表面，本身現(xiàn)象與電子劑量無關，但是升華速率與電子劑量有關電子輻射會增加樣品表面分子的動能，從而增加樣品表面分子脫離樣品表面的幾率。（3）起泡對于較厚的含水樣品。非彈性散射將造成能量沉積，大部分發(fā)生在接近樣品表面的內(nèi)層，此外，水是熱的不良導體，因此會出現(xiàn)起泡現(xiàn)象。隨電子劑量的增加，起泡的范圍和形態(tài)也會有所不同。（4）漂移樣品的物理漂移來自于樣品本身的形變，而樣品的象漂移原因為電子在樣品內(nèi)的沉積，對電子束的偏轉(zhuǎn)方向產(chǎn)生影響。一般來說，使用

6、盡可能低的電子劑量和盡可能小的照明光斑是避免上述四種輻射損傷的最佳方法。3、圖像去噪由于冷凍電鏡特殊的低電子劑量和低襯度成像技術，使得圖像反差弱，信噪比低，不易提取有效的結構信息。而濾波是圖像去噪的主要方法。其原理為將信號和噪聲都視為隨機信號，利用它們不同的統(tǒng)計特征，通過最小方差估計某點的最似信號類型，若為噪點則予以除去。此外，圖像增強和圖像復原也可相對地減輕噪點對信號圖像的影響，其中圖像增強是將人們主觀感興趣的部分亮度提高，而圖像復原則是針對圖像中客觀存在，但受到了噪點干擾（稱為退化）的樣品信號，將它們的結構性信息予以恢復。對于圖像增強，一般會綜合采用濾波、掩模、灰度變換、直方圖均衡化等方法

7、對感興趣區(qū)域的信息進行增強；而圖像復原的典型方法是根據(jù)先前的樣品經(jīng)驗，建立一個退化模型，以此模型為基礎采用濾波等手段處理，使得復原后的圖像符合一定的準則，達到改善圖像質(zhì)量的目的。其中信嗓比是評價圖像復原程度的主要標準之一。三、我國冷凍電鏡技術的新應用2011年1月，中科院生物物理所利用冷凍電鏡平臺，獲得了呼腸孤病毒科的質(zhì)型多角體病毒近原子分辨率的三維結構，并獨立構建了全原子模型。這是我國首次利用冷凍電鏡技術解析生物大分子原子結構模型，也是世界上首次利用冷凍電鏡圖像獲得的生物大分子復合體的全原子模型。該研究確認了呼腸孤病毒mRNA的流出通道，定位了該病毒的兩個甲基轉(zhuǎn)移酶，并揭示了該流出通道是如何

8、引導mRNA依次經(jīng)過這兩個甲基轉(zhuǎn)移酶以完成“加帽”過程的。 在論文Atomic model of a cypovirus built from cryo-EM structure provides insight into the mechanism of mRNA capping中，研究人員通過冷凍電鏡技術，得出以下結論：（1）CPV與其他呼腸孤病毒科相比，其主要衣殼蛋白缺乏特異的氨基酸序列，但它具有結構保守的酶蛋白VP3和衣殼蛋白VP1，表明具turret蛋白的呼腸孤病毒科的mRNA轉(zhuǎn)錄機制和衣殼組裝機制有共性。（2）CPV五聚體turret蛋白頂部獨特的結構組織區(qū)是其指導mRNA完成“加

9、帽”過程的關鍵區(qū)域。（3）CPV的VP5蛋白由RNA第7節(jié)段編碼，是由P50蛋白在轉(zhuǎn)譯后分裂產(chǎn)生的。四、冷凍電鏡技術的應用前景 隨生物成像技術的發(fā)展，電鏡技術已不再限于單純的形態(tài)結構研究，而發(fā)展為不同水平上的顯微學技術綜合應用。同時，顯微學技術與細胞生物學、分子生物學等其他生命科學技術的結合應用正在成為研究熱點。例如，免疫細胞化學與電鏡技術相結合，使原位雜交技術已從理論走向?qū)嶋H，得到相當普遍的應用。因此，冷凍電鏡技術在對物質(zhì)細微結構與功能的分析上必將極大地推動生物醫(yī)學的發(fā)展。參考資料：1 尹長城老師現(xiàn)代生物醫(yī)學成像技術選修課內(nèi)容2 李鯤鵬 冷凍電鏡技術與冷凍電鏡圖像去噪研究D.中山大學.20053 Cheng L, Sun J. et al. Atomic model of a cypovirus built from cryo-EM structure provides insigh