柱層析分離色素

1、柱層析分離色素實驗?zāi)康? .進(jìn)一步了解綠葉中色素的組成及各色素的顏色和性質(zhì)。2 .學(xué)會用柱層析法分離色素的操作技術(shù)，了解層析分析的有關(guān)知識。實驗原理葉綠體色素是植物吸收太陽光能進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)，主要有葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素組成。從植物葉片中提取和分離葉綠體色素是對其認(rèn)識和了解的前提。利用葉綠體色素能溶于有機溶劑的特性，可用95%醇或無水乙醇提取。分離色素的方法有多種，如紙層析、柱層析等。柱層析法是色譜法中的一種，它是根據(jù)混合物中各組分對固定相的吸附能力，以及對洗脫劑（即移動相）的溶解度不同將各組分分離。常用的柱色譜有吸附色柱譜和分配柱色譜兩類。吸附柱色譜通常是在玻璃管中填入

2、表面積很大，經(jīng)過活化的多孔性物質(zhì)或粉狀固體作為吸附劑（如氧化鋁或硅膠），當(dāng)混合物的溶液流經(jīng)吸附柱時，就被吸附在柱的上端，然后從柱頂加入溶劑（洗脫劑）洗脫。由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶劑中的溶解度也不同，因此各組分隨溶劑以不同速度下移，形成色帶。繼續(xù)用溶劑洗脫，吸附能力最弱的組分就隨溶劑首先流出，整個層析過程進(jìn)行反復(fù)的吸附-解析-再吸附-再解吸。用柱層析法可以分別收集各組分，并逐個鑒定。分配柱色譜是以硅膠、硅藻土和纖維等為支持劑，以吸附較大量的液體作為固定相，而支持劑本身不起分離作用。本實驗是把三氧化二鋁填入玻璃管中（壓成柱狀）作為吸附劑，將葉綠體色素的石油醴提取液傾于吸附柱

3、上，色素即被吸附。由于色素的種類不同，被吸附的強弱不同，就在吸附柱上排列成為不同的色層，再利用吸附劑在不同溶劑中有不同的吸附力，用不同的溶劑進(jìn)行洗脫，從而達(dá)到葉綠體主要的4種色素（葉綠素a、葉綠素b、葉黃素、胡蘿卜素）的分離。在選擇溶劑時主要依據(jù)下面幾條原則：（1）吸附劑要求較純，否則會影響樣品的吸附和洗脫。（2）溶劑和吸附劑不能起化學(xué)反應(yīng)。（3）溶劑的極性應(yīng)比樣品小，如果大了，樣品不宜被吸附劑吸附。（4）溶劑對樣品的溶解度不能太大，否則影響吸附，但也不能太小，溶液的體積增加，易使色譜分散。（5）可使用混合溶劑，如有的組分含有較多的極性基團，在極性小的溶劑中溶解度太小。也可選用極性大的溶劑溶解

4、，然后加入一定量的非極性溶劑。這樣既降低了極性，又減少了溶液的體積。層析柱粗細(xì)必須均勻，柱管大小可根據(jù)試劑需要選擇。一般來說，細(xì)長的柱分離效果較好。若樣品量多，最好選用內(nèi)徑較粗的柱，但此時分離效果稍差。柱管內(nèi)徑太小時，會發(fā)生“管壁效應(yīng)”，即柱管中心部分的組份移動慢，而管壁周圍的移動快。柱越長，分離效果越好，但柱過長，實驗時間長，樣品稀釋度大，分離效果反而不好。葉綠素存在兩種結(jié)構(gòu)相似的形式即葉綠素a（C55H7?QN4Mg）和葉綠素b（C55HoQNMg）,其差別僅是a中一個甲基被b中的甲?；〈Ｋ鼈兌际沁晨┭苌锱c金屬鎂的絡(luò)合物，是植物進(jìn)行光合作用所必需的催化劑。植物中葉綠素a的含量通常是

5、b的3倍。盡管葉綠素分子中含有一些極性基團，但大的姓:基結(jié)構(gòu)使它易溶于醴、石油醴等一些非極性的溶劑。胡蘿卜素（CwHk）是具有長鏈結(jié)構(gòu)的共腕多烯。它有三種異構(gòu)體，即a-,B-和丫-胡蘿卜素，其中B-異構(gòu)體含量最多，也最重要。在生物體內(nèi)，B-體受酶催化氧化即形成維生素A。目前B-胡蘿卜素已可進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，可作為維生素A使用，也可作為食品工業(yè)中的色素。葉黃素（C40H6Q）是胡蘿卜素的羥基衍生物，它在綠葉中的含量通常是胡蘿卜素的兩倍。與胡蘿卜素相比，葉黃素較易溶于醇而在石油醍中溶解度較小?？捎糜袡C溶劑將上述色素萃取出來。而后用層析柱，以同樣的或其他混合有機溶劑當(dāng)洗脫劑，便可將這些色素分離。試劑器材

6、材料烘干的菠菜葉試劑無水乙醇，石英砂，丙酮，石油醴（60-90°C）,三氧化二鋁,飽和氯化鈉溶液，無水硫酸鈉，洗脫液（丙酮：石油醴=1:9）器材層析柱（1X30cm）,研缽，蒸儲裝置，脫脂棉，天平，燒杯，過濾漏斗，玻璃棒，錐形瓶，分液漏斗，試管，鐵架臺實驗步驟色素提取取20g青椒，加少許石英砂，再加20mL無水乙醇研磨成漿，脫脂棉過濾,保存濾液，濾渣再用無水乙醇提取一次，合并濾液，濾渣再加入30mL石油醴提取一次，過濾，合并濾液，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，再加入40mL飽和氯化鈉溶液震蕩（注意不要激烈振蕩，以防止發(fā)生乳化現(xiàn)象）。棄去下層溶液，再分別加入20mL水震蕩洗滌幾次，直至下層無色，保

7、留上層溶液，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，用無水硫酸鈉干燥5min,備用。樣品濃縮將提取液放入蒸儲燒瓶中，蒸除多余的石油醴，至剩10mL時停止加熱，用余熱加熱至剩余58mL,以備加樣使用。層析柱的制備稱取12g堿性三氧化二鋁加入30mL石油醴攪拌，浸泡10min。在層析柱內(nèi)加入一團棉花（棉花要盡量薄）在底部再加入0.5cm的石英砂，然后用石油醴半充滿柱子，再將浸泡好的三氧化二鋁倒入柱內(nèi)，倒時應(yīng)該緩慢，重復(fù)使用下面的石油醴，直到裝完。用石油醴洗柱內(nèi)壁，頂部加一小團棉花，然后再加入石英砂0.5cm高。樣品的分離層析將濃縮液小心地從柱頂部加入。加完后打開活塞，讓液面下降到柱中砂層，關(guān)閉活塞，加幾滴石油醴沖洗內(nèi)壁，

8、打開活塞，使液面下降如前，在柱頂小心加入約1.52cm高度的石油醴-丙酮洗脫劑，層析即開始進(jìn)行。當(dāng)?shù)谝粋€有色成分即將滴出時，另取一潔凈的燒杯收集，得黃色溶液，即胡蘿卜素。將洗脫劑換成1:7的石油醴-丙酮混合液，繼續(xù)洗脫可得到第二色帶的黃綠色溶液，即葉綠素a和葉黃素。實驗結(jié)果從左到右依次為：胡蘿卜素（黃色），葉綠素a（藍(lán)綠色），葉黃素（黃綠色），葉綠素b（綠色）實驗總結(jié)在該柱層析分離色素實驗中，了解了柱層析技術(shù)的相應(yīng)方法和原理，學(xué)會了層析柱的制作和準(zhǔn)備，進(jìn)一步了解綠葉中色素的組成及各色素的顏色和性質(zhì)。洗脫液的配比、層析柱的制作及洗脫液的流速是本實驗成功與否的三大關(guān)鍵因素。同時在實驗過程中，為保證實驗快速有效地進(jìn)行，也需要注意以下問題：1、萃取時不要劇烈振蕩，以防止發(fā)生乳化現(xiàn)象2、為了保持柱子的均一性，使整個吸附劑浸泡在溶劑或溶液中是必要的，否則當(dāng)柱中溶劑或溶液流干時，就會使柱身干裂，影響滲透和顯色的均一性。因此要保證整個裝樣過程中溶劑要高于三氧化二鋁的表面。3、在吸附劑上端加入脫脂棉（或濾紙）是使加樣品時不致把吸附劑沖起；在吸附柱下端加脫脂棉（或沙子）可以防止吸附劑細(xì)粒流出。4、層析柱填裝緊密與否，對分離效果很有影響，若各部分松緊不勻，會影響滲透速度和顯色的均勻