水中大腸菌群的測(cè)定

1、水中大腸菌群的測(cè)定報(bào)告題目水中大腸菌群的測(cè)定作者姓名班級(jí)生科1104班指導(dǎo)教師完成時(shí)間2013年6月生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心目 錄引言11 實(shí)驗(yàn)材料12 實(shí)驗(yàn)步驟12.112.212.312.412.5數(shù)據(jù)分析與結(jié)果處理13 結(jié)果與分析13.1圖片13.21總結(jié)1參考文獻(xiàn)1水中大腸菌群的測(cè)定（指導(dǎo)老師：）（湖北師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 生物技術(shù)1104班 湖北 黃石 435002）摘 要：測(cè)定青山湖水中的大腸菌群的含量。將待測(cè)水分別稀釋10倍、100倍、1000倍3種梯度在三倍濃縮培養(yǎng)基 37培養(yǎng)24h后挑選出產(chǎn)酸或產(chǎn)氣的菌畫(huà)線接種到伊紅美藍(lán)平板中37培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)基中表現(xiàn)為陽(yáng)性的菌落做革蘭氏染色鏡

2、檢為陰性的菌種接種到乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中37培養(yǎng)24h,挑選大腸桿菌陽(yáng)性菌。結(jié)果稀釋10倍的水有3管大腸桿菌陽(yáng)性菌，稀釋100倍的水有3管，稀釋1000倍的有2管，即青山湖水中大腸桿菌的含量為MPN=11000.關(guān)鍵詞：大腸桿菌、多管發(fā)酵法 青山湖水水中大腸菌群的測(cè)定（指導(dǎo)老師：）（湖北師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 生物技術(shù)1104班 湖北 黃石 435002）引言水對(duì)我們的生命起著重要的作用，它是生命的源泉，是人類(lèi)賴以生存與發(fā)展的不可缺少的最重要的物質(zhì)資源之一。人的生命一刻也離不開(kāi)水，水是人生命需要最主要的物質(zhì)。水也是大腸菌群的天然環(huán)境，一般地面水比地下水含菌數(shù)量多，并易被病原菌污染。人飲用后引發(fā)疾病

3、。水質(zhì)細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)是培水與污水水質(zhì)分析工作中的一項(xiàng)重要指標(biāo)。水的微生物學(xué)的檢驗(yàn)，特別是腸道細(xì)菌的檢驗(yàn)，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時(shí)也是評(píng)價(jià)水質(zhì)狀況的重要指標(biāo)。國(guó)家飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，飲用水中大腸菌群數(shù)每升中不超過(guò)3個(gè)，細(xì)菌總數(shù)每毫升不超過(guò)100個(gè)。1 實(shí)驗(yàn)材料藥品：蛋白胨，牛肉膏，乳糖，蒸餾水，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，2%伊紅（曙紅）水溶液，0.5%美藍(lán)（亞甲藍(lán)）水溶液，氫氧化鈉水溶液。工業(yè)酒精、草酸銨結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液，番紅復(fù)染液，香柏油，二甲苯。儀器(生產(chǎn)廠家)：顯微鏡，天平，培養(yǎng)箱，水浴鍋，平皿，德氏管，刻度吸管，洗耳球，無(wú)菌涂布棒，量筒，滅菌鍋，酒精燈，接種環(huán)，棉花，

4、棉線，報(bào)紙。菌種：青山湖水中大腸桿菌2實(shí)驗(yàn)步驟（參照實(shí)驗(yàn)書(shū)）：2.1 配制培養(yǎng)基及滅菌1. 乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的配制（供多管發(fā)酵法的復(fù)發(fā)酵用）（1）蛋白胨1g牛肉膏0.5g乳糖0.5g氯化鈉0.5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液0.1mL蒸餾水100mL 2、三倍濃縮乳糖培養(yǎng)基（1）蛋白胨3g牛肉膏1.5g乳糖1.5g氯化鈉1.5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液0.3mL蒸餾水100mL3.滅菌l 移液管的包裝：將移液管的尖端，放在4-5cm寬的長(zhǎng)紙條的一端，移液管與紙條約成30°夾角，折疊包裝紙包住移液管尖端，用左手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，紙條螺旋式地包在移液管外面，余下的紙折疊打結(jié)。多

5、支包裝，待滅菌。l 培養(yǎng)皿的包裝：培養(yǎng)皿由一底一蓋組成一套，用報(bào)紙將10套培養(yǎng)皿（皿底朝里，皿蓋朝外，5套、5套相對(duì)而放）包好。l 棉塞的制作：按試管口或錐形瓶口大小估計(jì)用棉量，將棉花鋪成中間厚、周?chē)饾u變薄的近正方形，折一個(gè)角后（成五角形）卷成卷，一手握粗端，將細(xì)端塞入試管或錐形瓶的口內(nèi)，棉塞不宜過(guò)緊或過(guò)松用手提棉塞，以管、瓶不掉下為宜。棉塞四周應(yīng)緊貼管壁或瓶壁不能有褶皺，以防空氣微生物沿棉塞皺折侵入。棉塞的直徑和長(zhǎng)度視試管和錐形瓶的大小而定，一般約3/5塞入管內(nèi)。必須做到松緊合適，緊貼管壁，拔出時(shí)不松散、不變形。l 將所有準(zhǔn)備待滅菌物品，包扎好后置于高壓蒸汽滅菌鍋中，121高壓蒸汽滅菌20

6、min。l 將上述滅菌物品貯存于冷暗處備用。1.2 初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。配制350ml三倍的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（每組取45ml），分裝到9支試管中，每支試管內(nèi)加入一個(gè)倒放的布氏小管，保證小管內(nèi)無(wú)氣泡。取水樣并作梯度稀釋?zhuān)謩e稀釋出10倍，100倍，1000倍，在培養(yǎng)基中加入3中濃度的菌液10ml，每個(gè)稀釋濃度各重復(fù)3個(gè)，混勻37度培養(yǎng)24h。2.3平板分離。培養(yǎng)后產(chǎn)酸，產(chǎn)氣或僅產(chǎn)酸的發(fā)酵管為陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性。配制伊紅美藍(lán)培養(yǎng)液1200ml（每組取200ml），然后倒12個(gè)平板，分別將9支試管中的菌用畫(huà)線法接種到培養(yǎng)基上，。再隨機(jī)從3種濃度的菌液中隨機(jī)取一管進(jìn)行接種。37度培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)基中的菌種

7、挑取少許進(jìn)行革蘭氏染色，再做鏡檢。革蘭氏染色：將帶有上述典型特征的菌落（在伊紅美藍(lán)平板上大腸桿菌群的典型菌落為深紫黑色，具有金屬光澤；或者為紫黑色，不帶或略帶金屬光澤；或者為紫紅色、中心較深的菌落）做革蘭氏鏡檢：將大腸桿菌菌落涂片，干燥，固定。然后加草酸銨結(jié)晶紫一滴，染色1分鐘后傾去染液，水洗至流出水為無(wú)色。用盧戈氏碘液覆蓋1分鐘，傾去碘液，水洗至流出水為無(wú)色。再用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，并襯以白紙背景，用95%乙醇滴洗至剛剛無(wú)紫色為止，25S，然后立即用水沖去乙醇。將玻片上殘留的水用吸水紙吸去，用番紅復(fù)染液染色2分鐘，水洗，吸去殘水，晾干。干燥后，油鏡觀察。以分開(kāi)的細(xì)菌顏色為準(zhǔn)，革

8、蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色。陰性菌呈紅色。 2.4 復(fù)發(fā)酵。配制100ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)基，分裝10管（每管均加入布氏小管），高溫滅菌。將鏡檢結(jié)果為陰性的菌種對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基上的菌種接種到乳糖蛋白胨培養(yǎng)基上，37度培養(yǎng)24h，仍產(chǎn)酸，產(chǎn)氣的是大腸菌群陽(yáng)性。2.5結(jié)果計(jì)算。根據(jù)三個(gè)稀釋度中的陽(yáng)性管數(shù)組成的一個(gè)數(shù)量指標(biāo)，查表計(jì)算結(jié)果。3 結(jié)果與分析1.大腸桿菌初發(fā)酵后的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：稀釋度 0.10.010.001管號(hào)123123123現(xiàn)象氣泡較多，溶液變黃有氣泡，溶液變黃有氣泡，溶液變黃有氣泡，溶液變黃氣泡較少，溶液變黃2. 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基的篩選后的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象： 稀釋度0.10.010.001管號(hào)123412341

9、234鏡檢現(xiàn)象陰陰陰陰陰陰陰陰陽(yáng)4陰陰陰3.大腸桿菌復(fù)發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：稀釋度0.10.010.001陽(yáng)性管數(shù)332大腸桿菌MPN11000實(shí)驗(yàn)分析：大腸桿菌是一大類(lèi)群的總稱(chēng)并不是哪一種的種名，這一類(lèi)群中包括好多種，這些種中有的僅產(chǎn)酸有的既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣。大腸桿菌在伊紅美藍(lán)中菌落具有典型的特征，依據(jù)菌落的特征可以進(jìn)行篩選再由革蘭氏染色進(jìn)行確認(rèn)。本次實(shí)驗(yàn)中初發(fā)酵中現(xiàn)象均為陽(yáng)性，在進(jìn)行篩選中有6個(gè)培養(yǎng)皿中鏡檢為陰性，但鏡檢中發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的密度很低。在復(fù)發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中培養(yǎng)一天各管并未產(chǎn)氣且僅有一管產(chǎn)酸，可能是復(fù)發(fā)酵挑選的菌中大部分不是大腸桿菌，也有可能是菌濃度過(guò)低，還有可能是在挑菌是挑的太少或是在操作時(shí)

10、不規(guī)范如在灼燒接種環(huán)時(shí)未待冷卻使菌受到損傷或直接燒死了，這些均會(huì)是結(jié)果不理想?？偨Y(jié)釋10倍的水有3管大腸桿菌陽(yáng)性菌，稀釋100倍的水有3管，稀釋1000倍的有2管即青山湖水中大腸桿菌的含量為MPN=11000.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與安排的建議、實(shí)驗(yàn)感受、實(shí)驗(yàn)改進(jìn)想法等操作分析1、培養(yǎng)基的配制滅菌1）在培養(yǎng)基分裝過(guò)程中注意乳糖培養(yǎng)基與三倍乳糖培養(yǎng)基的量，其中三倍乳糖培養(yǎng)基是每管10ml,乳糖培養(yǎng)基每管5ml。2）杜氏小管在傾斜的放入裝有培養(yǎng)基的試管內(nèi)出現(xiàn)了氣泡，將試管倒立使氣泡排空后再正放即可排除氣泡。3）在整理所需滅菌物品時(shí)，由于訓(xùn)練不足整體上還是有點(diǎn)混亂，不過(guò)能及時(shí)解決。4）培養(yǎng)基的配制儀器的包扎與包裝

11、比較熟練，未出現(xiàn)問(wèn)題。2、水樣采集及稀釋?zhuān)醢l(fā)酵實(shí)驗(yàn)1）用移液管移取菌液時(shí)，單手操作能力還是欠缺，總習(xí)慣性的把試管塞放到桌面上。在微生物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，最重要的就是要時(shí)刻保持無(wú)菌條件，因此一些試管塞應(yīng)該放到手上而不是桌上。在打開(kāi)每一個(gè)試管塞時(shí)應(yīng)該將試管口在火焰上灼燒，操作時(shí)盡量距離酒精燈近一些。2）移液管依然是用吸耳球吸取液體，由于無(wú)菌操作臺(tái)的玻璃門(mén)開(kāi)啟幅度不能過(guò)高，以不超過(guò)下巴為宜，因此雙手在操作臺(tái)里操作很僵硬，受到限制，移取液體很不方便；多熟悉在無(wú)菌操作臺(tái)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的環(huán)境并且要培養(yǎng)自己?jiǎn)问植僮鞯哪芰Γ跓o(wú)菌操作臺(tái)里盡量避免用吸耳球輔助移液管移取液體，而是訓(xùn)練用口操作。3）還是準(zhǔn)備的不充足，

12、在無(wú)菌操作臺(tái)里需要提前把實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要用到的一些儀器與試劑等放到里面提前滅菌消毒二十分鐘，考慮不全面總會(huì)時(shí)不時(shí)突然想到還有什么東西沒(méi)拿進(jìn)來(lái)滅菌消毒，于是在這個(gè)地方耽誤了很長(zhǎng)時(shí)間。因此每次用無(wú)菌操作臺(tái)之前，應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)室里將所需物品準(zhǔn)備齊全，最好能考慮周到，可以小組互相討論，將遺漏的物品補(bǔ)齊。4）初發(fā)酵將稀釋好的樣液倒入試管中應(yīng)注意將樣液緩緩地倒入以免倒入過(guò)猛而導(dǎo)致氣泡進(jìn)入杜氏小管，或?qū)е屡囵B(yǎng)基的飛濺。5）在加入樣液前未做好標(biāo)記，增添了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜度，應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)前應(yīng)貼好標(biāo)簽以使實(shí)驗(yàn)過(guò)程更清晰。3、平板分離1）倒平板時(shí)培養(yǎng)基的量倒的過(guò)多，導(dǎo)致培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基層過(guò)厚；倒平板時(shí)，右手持裝有培養(yǎng)基的三角瓶，左

13、手將瓶入培養(yǎng)基約15ml，量不能過(guò)多，然后蓋上蓋子，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，最后平置于桌面上，冷卻凝固。2）劃線分離時(shí)劃線的方式有誤，如接種環(huán)在酒精燈灼燒后未完全冷卻就立即劃線，可能會(huì)引起某些菌由于局部過(guò)熱而喪失生命活性；劃線太過(guò)密集，稀釋次數(shù)少，可能無(wú)法形成單菌落。平板劃線分離：a.接種環(huán)蘸取菌液的度是菌液在接種環(huán)上形成一個(gè)可見(jiàn)的水液面 b.劃線時(shí),培養(yǎng)皿在左手,接種環(huán)在右手,皿蓋打開(kāi)的范圍足夠接種環(huán)伸進(jìn)去劃線c.劃線時(shí)先將接種環(huán)在酒精燈上灼燒,然后放在培養(yǎng)皿中間的培養(yǎng)基上輕輕劃動(dòng)冷卻接種環(huán),然后蘸取少量菌液在培養(yǎng)基上劃線d.劃線的力度要控制好,第一次三條線將接種環(huán)傾斜

14、一點(diǎn)平劃,是環(huán)上菌液落入培養(yǎng)基表面,再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿,用同樣的方法劃線,重復(fù)此類(lèi)操作三至四次.4、革蘭氏染色、復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)1）革蘭氏染色，五個(gè)裝片做了兩次才成功，可能原因是：a.涂片時(shí)菌液過(guò)少,在顯微鏡下觀察時(shí),一個(gè)視野類(lèi)的菌太少,很難判定革蘭氏染色的結(jié)果是陰性菌還是陽(yáng)性菌b脫色時(shí)間不夠,紫色未完全褪去c.番紅復(fù)染時(shí)間不夠,視野里的菌大部分未被上色,對(duì)判斷是陰性菌還是陽(yáng)性菌有干擾;d.菌液在載玻片上分布不均勻。解決的方案：(1)可以重復(fù)涂片幾次,但避免涂片過(guò)厚,導(dǎo)致視野里菌過(guò)多；(2)用乙醇脫色的標(biāo)準(zhǔn)是乙醇滴洗至剛剛無(wú)紫色為止,為了便于分辨顏色可以在玻片下墊一張白紙；(3)番紅染色的時(shí)間最終是控制在

15、4min左右,盡量控制染色時(shí)間適宜；(4)雖然復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在操作上沒(méi)有什么問(wèn)題,但我們根據(jù)實(shí)際情況對(duì)書(shū)上的一些操作進(jìn)行了調(diào)整,在將革蘭氏染色鏡檢為陰性無(wú)芽孢桿菌的菌落按無(wú)菌操作接種到裝有乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中時(shí),由于一次挑取的菌種比較少,因此每個(gè)試管都各自接種了三次,保證每個(gè)試管里都有足夠的大腸桿菌進(jìn)行復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)感受：經(jīng)過(guò)我們小組各成員的積極配合、共同努力，我們的實(shí)驗(yàn)得到了圓滿結(jié)束。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們也遇到了不少困難，但大家齊心協(xié)力，一起討論問(wèn)題的解決方法，才使的這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)都順利地完成。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，讓我們更好地水中細(xì)菌及大腸菌在我們的生產(chǎn)、生活中的作用，明確飲用水的符合標(biāo)準(zhǔn)，更好地應(yīng)用到我們的實(shí)踐中去。同時(shí)，也學(xué)到了水中微生物在保證安全用水和控制傳染病上有著重要意義，同時(shí)也是評(píng)價(jià)水質(zhì)狀況的重要指標(biāo)。通過(guò)此實(shí)驗(yàn)，讓我們懂得只有大家團(tuán)結(jié)合作，不怕困難才能更好地克服各種困