顯微攝影技術(shù)

1、顯微攝影技術(shù)顯微攝影是一項(xiàng)重要的顯微技術(shù)， 同再現(xiàn)顯微鏡中物體影象的各種方法比擬， 顯微攝影是最好的方法。它對(duì)以顯微鏡作為研究工具的研究人員是必備的手段， 尤其在研究染色體及其分子特征時(shí)，就更加顯得必要了?，F(xiàn)在數(shù)碼相機(jī)的問(wèn)世， 又使顯微攝影變得更為簡(jiǎn)便， 且效果好。 在有關(guān)學(xué)術(shù)研究和理論探討時(shí)， 一幀好 的顯微照片， 可以省去許多的文字描述， 并且使人心悅誠(chéng)服。 何況在生物學(xué)領(lǐng)域 中，確有不少問(wèn)題的研究，必須借助顯微攝影。下面，僅以植物染色體作為拍攝材料，概述顯微攝影的根本方法，數(shù)碼顯微 攝影的操作流程和傳統(tǒng)的顯微攝影根本一樣， 只是省去了底片和暗房技術(shù)， 由計(jì) 算機(jī)完成。、顯微攝影對(duì)制片標(biāo)本

2、的要求染色體只見(jiàn)于有絲分裂和減數(shù)分裂的細(xì)胞核中，根尖、莖端、幼嫩花藥和胚 珠是鏡檢染色體的材料， 尤以根尖和花藥更為常用。 觀察染色體的形態(tài)、 結(jié)構(gòu)和 數(shù)量，常用酶解或壓片法制片。 此法能保持染色體的完整， 并能接近于活體狀態(tài)。 一張好的顯微照片， 來(lái)源于完好的染色體制片標(biāo)本。 適于拍照的制片標(biāo)本， 應(yīng)具 以下條件：1、選用標(biāo)準(zhǔn)的載玻片和蓋玻片 光源入射光束，經(jīng)載玻片透射標(biāo)本，再經(jīng)蓋 玻片進(jìn)入物鏡，處于光路之中的玻璃，應(yīng)是外表無(wú)傷，內(nèi)無(wú)氣泡；外無(wú)霉斑。這 樣可以杜絕光線亂反射， 防止阻光、 降低亮度以及有損清晰度。 載玻片厚度不宜 超出聚光鏡的焦距，一般在 2 毫米以內(nèi)，可將光源的光束集中于載

3、玻片的標(biāo)本上。 蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度為 0.17 毫米，假設(shè)使用厚度大于工作距離的蓋玻片，物鏡前透 鏡會(huì)觸及蓋玻片，同時(shí)不能準(zhǔn)焦；蓋片厚，球差就大，會(huì)降低影象質(zhì)量。有效蓋 片厚度，包括封固劑的厚度，即樹(shù)膠或尤派膠用量，因此，封固劑要調(diào)稀，少許 滴加一薄層。2、染色體處于相宜的時(shí)期， 平展逸散，完整無(wú)損 染色體的計(jì)數(shù)和組型分析， 以有絲分裂的中期 或晚前期 ，減數(shù)分裂的終變期和粗線期為宜。這時(shí)染色體收 縮變短，呈典型狀態(tài)，易識(shí)別。通過(guò)前處理的精細(xì)加工，染色體相互逸散，互不 接觸，并盡可能使之平展于同一水平面上，又不失細(xì)胞的完整輪廊 圖 3-1。3、染色鮮明適度 染色體過(guò)染，染料堆積，使染色體模糊成一

4、塊，難以區(qū)分 細(xì)節(jié)，缺乏質(zhì)感；染色體著色過(guò)淺，使影象不鮮明，識(shí)別不清，反差不大。染色 體染色以藍(lán)紫為佳，色彩鮮明，膠片易感受，拍攝效果好。一般多用鐵礬蘇木精 染色制片。當(dāng)然，醋酸洋紅和孚爾根反響也可以。細(xì)胞質(zhì)染色應(yīng)淺淡，以辨清細(xì) 胞質(zhì)的完整輪廓為準(zhǔn)。常用鐵礬蘇木精過(guò)染，再用45醋酸軟化和分色，結(jié)果染色體著色藍(lán)黑而鮮明， 細(xì)胞質(zhì)淺淡而不明顯， 增大了色彩的比照， 擴(kuò)大了影象 的明暗反差。4、清潔無(wú)塵，消除氣泡 制片中的灰塵異物和氣泡，有損影象的質(zhì)量，防礙 觀察。氣泡為臨時(shí)制片的常見(jiàn)弊病，小的氣泡有礙觀瞻；大的氣泡連片，推擠染 色體，堆積集中， 損壞了好的影象。 要隨時(shí)滴加所用的臨時(shí)封固液， 消除

5、氣泡、選用優(yōu)質(zhì)物鏡和接目鏡顯微攝影是以接物鏡和接目鏡作為攝影鏡頭，其中接物鏡尤為重要，物鏡的 分辨率就是顯微鏡的分辨率。 目鏡與顯微鏡的分辨率無(wú)關(guān)， 它只有把物鏡已放大 的影象進(jìn)一步放大， 既使是最好的目鏡， 也無(wú)法觀察到未被物鏡分辨的細(xì)節(jié)。 所 以攝影時(shí)，物鏡要嚴(yán)格選擇，不可任意濫用。1、物鏡 接物鏡種類(lèi)繁多，光學(xué)性能相差懸殊。攝影時(shí)必須選用得當(dāng)，絕非任 一物鏡皆可產(chǎn)生最正確影象。物鏡由透鏡組成。單片透鏡具有多種象差，一個(gè)完善的物鏡，是由一組復(fù)雜 的透鏡組成。按象差矯正程度，物鏡可分消色差物鏡，復(fù)消色差物鏡，螢石物鏡 和平象物鏡等類(lèi)別。消色差物鏡，因制造容易，是最常見(jiàn)的物鏡。金屬外殼上不刻代

6、表圖 3-4 左 。該物鏡將光譜中紅光和藍(lán)光聚焦于一點(diǎn)， 黃綠光那么聚焦于另一點(diǎn)。 其最正確清晰范 圍是在510卩m毫微米綠光區(qū)至630m橙光區(qū)間圖3-2Ach紅。消色差物鏡性 能較差，不適于顯微攝影。 因未經(jīng)矯正的藍(lán)光對(duì)感光膠片的乳劑膜非常敏感， 全 色膠片對(duì)未經(jīng)矯正的紅光也能感應(yīng)。 如果必須使用時(shí)， 加用黃綠色濾色片， 也可 獲得清晰的影象。復(fù)消色差物鏡的性能很高，能將可見(jiàn)光譜中的紅、藍(lán)和黃光聚焦于一點(diǎn)，改 正了紅、藍(lán)色光的球差和其他象差。最正確清晰范圍從波長(zhǎng)400nm至720nm圖3-2Apo 線，容納了全部可見(jiàn)光譜。適于任何色光下或加用各色濾色鏡攝影，更 適于彩色攝影。 但是，復(fù)消色差

7、物鏡殘留有象場(chǎng)彎曲， 使平面物體形成類(lèi)似球形 彎曲的影象。 結(jié)果使視野中心和邊緣的影象不能同時(shí)準(zhǔn)焦， 給攝影帶來(lái)不便。 拍 出的底片中心清晰邊緣模糊或相反。 象場(chǎng)彎曲可以通過(guò)選用特殊的目鏡加以克服 矯正。復(fù)消色差物鏡的金屬外殼，刻有“Apo字樣，供作識(shí)別圖3-30螢石物鏡，色差校正介于消色差物鏡與復(fù)消色差物鏡之間，故又可稱(chēng)半復(fù)消 色差物鏡。最正確清晰范圍在波長(zhǎng) 430nm至680nm圖3-2 I線，包括了絕大局部 可見(jiàn)光譜。適于黑白和彩色攝影，可加用各色濾色鏡，物鏡外殼刻有“F1字樣圖 3-4 右 0鑒于倍數(shù)愈高物鏡的象場(chǎng)彎曲愈顯著，歪曲影象，降低攝影質(zhì)量，難以獲得 完美的底片0現(xiàn)今，已研制出

8、去除象場(chǎng)彎曲的一系列平象物鏡0平象物鏡，校正 了象正場(chǎng)彎曲， 不存在視野中心與邊緣不同時(shí)準(zhǔn)焦的現(xiàn)象0 由于將影象展平， 在 同樣倍數(shù)下， 有效影象要比一般物鏡的影象稍大0 為當(dāng)今理想的攝影物鏡， 應(yīng)積 極選用。平象物鏡有多種類(lèi)別，外殼上刻有不同的字樣，以資識(shí)別。如“ Plan平象，“Pl廣視野平象、“NPI正常視野平象，“Planachromate平象消色差、“PlApo平象昨消色差等圖3-5。物鏡在使用時(shí)， 按其前透鏡與標(biāo)本間介質(zhì)的不同， 分為枯燥系和浸沒(méi)系物鏡。 浸沒(méi)系物鏡外殼前端，?？桃缓诃h(huán)，以便識(shí)別。油浸物鏡外殼刻有 “Oel、“Oil、“ H字樣；水浸系物鏡刻有“ W、“ Wate；

9、甘油浸沒(méi)系物鏡刻有“ Glyc、 “ Glyz, 通常油浸物鏡只有90X和100X圖3- 6高倍物鏡。個(gè)別顯微鏡配有63X或40対勺 中倍油浸物鏡，其中尤以63対勺油浸物鏡，質(zhì)量最正確，非常適于顯微攝影。在焦 距和數(shù)值孔徑相同時(shí)， 浸沒(méi)物鏡勺象差校正比枯燥物鏡完善， 成象質(zhì)量好。 由于 浸沒(méi)液折射率大于空氣勺折射率， 從而提高了物鏡勺分辨率。 同時(shí)，這層介質(zhì)可 使入射物鏡勺光線提高， 提高視野亮度。 采用浸沒(méi)物鏡， 可消除物鏡前端透鏡表 面勺雜亂反射光，減少有害勺反射光量，使物體影象反差增加。2、目鏡 目鏡亦參與造象，把物鏡映來(lái)勺影象進(jìn)一步擴(kuò)大，并校正物鏡余下 勺象差和色差。 目鏡作為投影器，

10、 把放大勺影象投射在暗箱勺焦平面上。 目鏡種 類(lèi)多，光學(xué)性能差異較大，一定類(lèi)型勺物鏡必須選用一定類(lèi)型勺目鏡相互組合。 絕非只要有好勺物鏡，隨便一種目鏡都可用來(lái)攝影。附有攝影裝置勺顯微鏡，備有攝影目鏡，專(zhuān)用攝影，不宜作為觀察用。這種目鏡 能較好的校正象場(chǎng)彎曲，提高成象質(zhì)量。攝影目鏡上刻有“Photo “FK等字樣。 平象目鏡也是一種適于攝影勺目鏡。 有專(zhuān)用攝影目鏡， 選用平象目鏡配合平象物 鏡一起使用，可以獲得很好的攝影效果。目鏡刻有“ Plan “ Periplan“ GF、“ GW 和“Kpl等字樣。3、物鏡與目鏡組合 為提高影象質(zhì)量，消除象差和色差，在選配物鏡和目鏡 組合時(shí)，從類(lèi)別上進(jìn)行選

11、擇， 如用平象復(fù)消色差物鏡和攝影目鏡或平象目鏡組合 使用。此外，物鏡的數(shù)值孔徑和放大倍數(shù)，以及目鏡的放大倍數(shù)，更要考慮這涉 及有效放大率、 分辨率、 焦點(diǎn)深度和視野寬度等幾個(gè)與攝影質(zhì)量相關(guān)的問(wèn)題。 所 以，選用物鏡和目鏡時(shí)，要考慮下述幾個(gè)問(wèn)題：1有效放大率：顯微鏡區(qū)分微小物體和細(xì)節(jié)的能力，取決于分辨率，不在 于放大倍數(shù)。分辨率決定于物鏡，而與目鏡無(wú)關(guān)。顯微鏡的有效放大率，為所用 物鏡數(shù)值孔徑的500- 1,000倍。數(shù)值孔徑常簡(jiǎn)寫(xiě)為 N.A.,其數(shù)值刻在物鏡上。 例如，使用數(shù)值孔徑為0.65的40X物鏡，其有效的放大倍數(shù)為325-650倍。為 達(dá)此倍數(shù)，要選用8-16倍的目鏡。高于16X目鏡所

12、得放大倍數(shù)叫做 空的放大, 對(duì)影象細(xì)節(jié)的分辨，沒(méi)有絲毫提高。目鏡倍數(shù)太低，總放大倍數(shù)太小，物鏡分辨 率不能充分發(fā)揮， 本來(lái)可以識(shí)別的細(xì)節(jié)， 由于總倍數(shù)太小， 擠在一起難以分辨。2分辨率：顯微鏡的分辨力決定于物鏡數(shù)值孔徑，孔徑愈大， 分辨率愈高。數(shù)值孔徑與物鏡倍數(shù)有關(guān)，請(qǐng)看以下數(shù)字：物鏡倍數(shù) 4X 10X 20X 40X 100X數(shù)值孔徑 0.10.250.400.651.25上列數(shù)字說(shuō)明，隨著放大倍數(shù)的加大，數(shù)值孔徑相應(yīng)提高，分辨力隨之增大，欲 提高對(duì)物象細(xì)節(jié)的分辨能力和清晰度， 必須使用高數(shù)值孔徑的物鏡。 例如， 拍攝 染色體減數(shù)分裂前期I的幾個(gè)影象， 非用高分辨率的油鏡不可，攝影目鏡應(yīng)視物

13、 象的大小和視野寬度， 選用低倍的目鏡為宜。 在這里要考慮物鏡的數(shù)值孔徑， 不 是總放大率，單純考慮放大倍數(shù)， 不顧及分辨率， 就會(huì)出現(xiàn)攝影質(zhì)量相差懸殊的 結(jié)果。例如，用100/1.25物鏡與4X目鏡組合，總放大倍數(shù)為400倍，分辨距離 為0.27微米；使用40/0.65的物鏡與10X目鏡組合，總放大倍數(shù)也是 400倍，分 辨距離下降到 0.5微米。盡管總放大倍數(shù)相同，物象微細(xì)結(jié)構(gòu)的分辨力幾乎相差 一倍。3焦點(diǎn)深度和視野寬度：焦點(diǎn)深度是指物象的某一點(diǎn)被準(zhǔn)焦時(shí)，其清晰部 分的上下距離 厚度。焦深大，清晰的深度大，焦深小，清晰的深度小。染色體 數(shù)目較多的植物，例如八倍體小黑麥2n= 56,制片時(shí)難

14、以把所有染色體平展一薄層， 56 條染色體縱橫交錯(cuò)，散在不同的水平層次上。因此，假設(shè)缺少足夠的焦 點(diǎn)深度，難把眾多的染色體清晰地反映在同一張底片上。 焦點(diǎn)深度與物鏡的數(shù)值 孔徑和總放大倍數(shù)成反比。數(shù)值孔徑小，放大倍數(shù)低的物鏡和目鏡，焦深長(zhǎng)，只 有選用數(shù)值孔徑小和放大倍數(shù)低的物鏡和目鏡， 加長(zhǎng)焦點(diǎn)深度， 才能把處于不同 水平層次的染色體，清晰地?cái)z入同一張底片內(nèi)。視野寬度與顯微鏡的總放大率成反比，使用高倍物鏡和目鏡，視野縮小，難 在同一視野內(nèi)容納一個(gè)細(xì)胞的全部染色體。 改用低倍的物鏡或目鏡， 降低總放大 率，放大視野，以至能包括一個(gè)細(xì)胞的所有染色體止。綜上所述，物鏡數(shù)值孔徑大，分辨率高，物象清晰，

15、焦點(diǎn)深度和視野寬度降 低，選用物鏡和目鏡主要著眼于提高物體影象的分辨率和清晰度， 即選高數(shù)值孔 徑的平象復(fù)消色差中、 高倍油浸物鏡， 兼顧焦點(diǎn)深度和視野寬度， 并選用相宜的 低倍攝影目鏡或平象目鏡。 焦深和視野缺乏時(shí)， 適當(dāng)調(diào)換物鏡， 降低數(shù)值孔徑或 放大倍數(shù)。三、光路合軸和光闌調(diào)整 顯微攝影采用中心亮視野透射照明法，照明光束中軸與顯微鏡的光軸在一直 線上。光路系統(tǒng)始于光源，經(jīng)視野光闌、孔徑光闌、聚光鏡、透明制片標(biāo)本、物 鏡和目鏡，將物體影象投射在暗箱的焦平面上。攝影前，光路要合軸調(diào)整，光束與顯微鏡的光軸，位于同一軸線上。光路系 統(tǒng)中的目鏡、物鏡和孔徑光闌，于固定位置，勿需調(diào)整，僅聚光器可變。

16、因此， 光路的合軸，實(shí)為聚光器的調(diào)中。 攝影要求視野亮度非常均勻，調(diào)整光源燈位置，使之照明于視野中央。當(dāng)前，攝影和觀察普遍采用科勒Koehler照明法，這是一種最正確的中心亮視 野照明。1、聚光器和光源燈的調(diào)中 攝影前，要把聚光器和光源燈調(diào)中，使聚光器中 心與視野光闌的中心處于同一光軸上。光源燈的燈絲，照明于視野中心。 聚光器的調(diào)中步驟：1轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器升降旋鈕，把聚光器升至最高位置； 2接通光源燈的電源開(kāi)關(guān)；3 將被攝的制片標(biāo)本，放在載物臺(tái)上，用4X或6.3低倍物鏡聚焦在樣品 上；4縮小鏡座上的視野光闌， 在視野中可見(jiàn)邊緣模糊的視野光闌圖象 3-7 ；5微降聚光器，至視野光闌的圖象清晰聚焦止 圖

17、 3-8；6用聚光器兩個(gè)調(diào)中螺桿推動(dòng)聚光器，使縮小的視野光闌圖象，調(diào)至視野 中心圖 3-9；7開(kāi)放視野光闌，使多角形周邊與視野邊緣相接 圖 9-11；8反復(fù)縮放視野光闌數(shù)次，確認(rèn)光闌中心和邊緣與視野完全重合；9使聚光器回復(fù)頂點(diǎn)位置。要通過(guò)視野光闌，保證視野的照明強(qiáng)度和均一，必須進(jìn)行燈絲的調(diào)中，使投 射的光束和光軸合一，其調(diào)整方法如下：光源燈泡擰緊在燈座上，固緊于燈室或鏡座中，轉(zhuǎn)動(dòng)燈座或燈室上的垂直、 水平調(diào)節(jié)螺絲，使燈絲調(diào)中，位于視野中心 圖 3-11。燈絲的圖象，可于兩處觀 察：一是在視野光闌上面的濾色鏡座上， 放一毛玻璃或乳白濾色鏡， 用以觀察燈 絲象的位置，至調(diào)中止；二是在物鏡的后焦面上

18、，聚焦后，從鏡筒中取下目鏡， 在物鏡的后焦面上， 可見(jiàn)到燈絲的清晰圖象。 兩法當(dāng)中，前法可取， 簡(jiǎn)便易行。燈絲的調(diào)中，可結(jié)合科勒照明法一并進(jìn)行。2、科勒照明法 科勒照明法是當(dāng)今顯微攝影的最正確照明法，視野照光均勻， 被攝物體不受熱，影象清晰。新近的顯微鏡，照明系統(tǒng)已按科勒法設(shè)計(jì)裝置，使 用時(shí)稍加調(diào)整即到達(dá)最正確照明狀態(tài)。 科勒照明法是光源的燈絲在聚光器的孔徑光闌上成象。 因此，也就在物鏡后焦面 上成象。 這樣視野內(nèi)照光均勻， 不會(huì)烤焦被攝材料， 極為有效的控制被照明的視 場(chǎng)及其照明孔徑。視野的照明強(qiáng)度，用升降電壓調(diào)節(jié)。3、正確的使用光闌 顯微鏡有兩種可變光闌，孔徑光闌和視野光闌。正確的 調(diào)整和

19、使用光闌是保證攝影質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。1孔徑光闌的調(diào)節(jié)使用： 孔徑光闌與聚光鏡是構(gòu)成聚光器的兩個(gè)重要局部。 顯微鏡的性能主要決定于物鏡的性能， 而物鏡的性能又決定于數(shù)值孔徑。 物鏡的 數(shù)值孔徑與聚光鏡的數(shù)值孔徑相關(guān)， 兩者孔徑相等時(shí)， 物鏡分辨力最高。 聚光鏡 的數(shù)值孔徑受孔徑光闌控制， 用孔徑光闌的開(kāi)放與收縮， 調(diào)節(jié)聚光鏡數(shù)值孔徑的 大小。顯微攝影不同于一般攝影，其最大的區(qū)別是影象反差小，焦深淺。這兩點(diǎn)可 隨孔徑光闌縮小而提高。 孔徑光闌小于物鏡的數(shù)值孔徑時(shí)， 物象的分辨力和亮度 降低，但影象反差和焦點(diǎn)深度提高，便影象更加清晰。所以，在不過(guò)多地降低分 辨力的前提下，把孔徑光闌調(diào)到所用物鏡數(shù)值孔徑

20、的6070大小是比擬適宜的。例如，物鏡的數(shù)值孔徑為 1.0，孔徑光闌的數(shù)值調(diào)到 0.60.7，所以，顯微 攝影時(shí)，縮小孔徑光闌，盡管喪失少許的分辨力，卻提高了影象反差、焦點(diǎn)深度 和影象的清晰度?？讖焦怅@的調(diào)節(jié)方法：當(dāng)聚光器標(biāo)有孔徑的數(shù)字時(shí)，對(duì)準(zhǔn)所需的值即妥，如 果不具孔徑光闌數(shù)值， 在顯微鏡向標(biāo)本聚焦后， 從鏡筒中取下目鏡， 在物鏡的后 透鏡中可見(jiàn)孔徑光闌影象。光闌縮小時(shí)，僅一見(jiàn)一亮點(diǎn)，逐漸開(kāi)大光闌，亮孔擴(kuò) 大，直至需要的程度。當(dāng)光闌縮小，視野亮度降低時(shí)，可適當(dāng)提高電壓增加照明 強(qiáng)度。2視野光闌的調(diào)節(jié)：視野光闌位于鏡座之中，用以控制照明光束的直徑， 縮小視野光闌，光束直徑小于孔徑光闌，視野亮度

21、缺乏，影象不清晰；視野光闌 開(kāi)大，光束直徑超出孔徑光闌，因光線過(guò)多，造成光線的亂反射，影響影象的清 晰度。視野光闌的適宜大小， 以光闌的邊緣外切孔徑或孔徑光闌內(nèi)接視野光闌為 度 圖 3-13?？傊讖焦怅@的調(diào)節(jié)，取決于所用物鏡數(shù)值孔徑。當(dāng)兩者相等，分辨力最 高；孔徑光闌小于物鏡的數(shù)值孔徑， 影象反差和焦點(diǎn)深度增大。 視野光闌隨孔徑 光闌而變，總是外切孔徑光闌。更換物鏡，數(shù)值孔徑改變，孔徑光闌重新調(diào)整， 視野光闌亦隨之改變。四、選用適宜的感光膠片 感光膠片類(lèi)別多，性能相差甚大，不是每種膠片都適于顯微攝影。了解膠片 的各種性能試拍后擇優(yōu)選用。 一經(jīng)選定，不要輕易改換， 以保持拍攝質(zhì)量的穩(wěn)定。 膠

22、片的性能是膠片中直接決定和影拍攝質(zhì)量的因素， 如感色性， 感光度和反差系 數(shù)等，要從這些質(zhì)量因素中選用適宜的膠片。1、感色性 是指膠片對(duì)不同色光的敏感程度，這是膠片最主要的性能。根據(jù) 感色性，可把黑白膠片分為色盲片、分色片和全色片等不同的片種。色盲片：乳劑中除鹵化銀外未參加化學(xué)增感劑，只能感受可見(jiàn)光譜中的藍(lán)紫 兩色，對(duì)其他各種色光不感受。感色范圍為 330nm-480nm 的波長(zhǎng)區(qū) 圖 3-14。 為一種低速感光片，銀粒細(xì)，反差大，解象力高。適于黑白、藍(lán)紫等色光影象的 顯微攝影，不能用以拍攝紅、綠和黃等色的影象。膠片對(duì)這些色光不感受，在照 片上呈黑灰一片，不能分辨。所以，用醋酸洋紅和孚爾根反響

23、的染色體標(biāo)本，不 能使用色盲片攝影，鐵礬蘇木精制片的標(biāo)本可以使用色盲片。分色片：感光乳劑中參加了黃綠增感色素，除感受藍(lán)紫色外，對(duì)黃綠二色也 能感受，對(duì)紅橙色光仍不能感受，感受范圍為波長(zhǎng) 300m-600m區(qū)段圖3-15 乙 ，除紅橙色標(biāo)本外，可廣泛用于顯微攝影，是一理想的顯微攝影膠片，它不 僅反差強(qiáng)， 顆料細(xì)， 并能記錄出較多的亮度等級(jí)和較寬的感受范圍。 用醋酸洋紅 染色和孚爾根反響的標(biāo)本，仍不能使用分色片拍攝。全色片：乳劑中添加了公演增感色素， 對(duì)可見(jiàn)光譜的各波段色光能全部感受， 故稱(chēng)全色片，感色范圍為330-700 m圖3-15丙，共中對(duì)綠色光感應(yīng)稍弱。膠片 的銀粒粗、感光速度快、反差小、

24、黑白等級(jí)多。這些特點(diǎn)，會(huì)使顯微攝影本來(lái)影 象反差就小，黑白比照不鮮明的缺點(diǎn)更加突出。 照片中的染色體不黑， 背景不白， 呈灰暗狀態(tài)，使用感光底低 ASA50 以下的全色膠片，可獲良好的效果。2、感光度 指膠片對(duì)光線作用的敏感程度，即感光速度。顯微攝影對(duì)膠片的 感光速度沒(méi)有特寫(xiě)的要求， 選用膠片時(shí)， 考慮的不是速度本身， 而是與感光速度 相關(guān)的質(zhì)量因素，凡屬感光度高的膠片，乳劑的銀粒粗、反差小、灰霧大、保存 性差；感光速度低的膠片、銀粒細(xì)、反差大、灰霧小，保存性好。所以，顯微攝 影力求使用低感光度的膠片， 以便獲得反差高、 銀粒細(xì)膩、清晰度高的攝影效果。 目前，市場(chǎng)供給的GB21 ASA50全色

25、膠片，不是理想的顯微攝影用膠片，感光 度在 ASA100 以下適于顯微攝影。3、反差和反差系數(shù) 反差是指被攝物體景象中明亮局部與陰暗局部亮度差異 的程度。膠片的反差， 用反差系數(shù)表示。 它是指膠片影象反差與被攝物體影象反 差的比值。即：假設(shè)膠片上影象反差大于物體影象反差，那么膠片的反差系數(shù)大于 1；膠片影象 反差小于物體影象反差時(shí)，膠片的反差系數(shù)小于 1。同一視野的相同影象，用不 同反差系數(shù)的膠片拍攝， 能拍出不同反差效果的底片。 反差系數(shù)愈大， 底片的影 象反差愈強(qiáng)，黑白比照愈清楚；反差系數(shù)愈小，底片反差愈弱，色調(diào)灰暗，影象 黑白比照不鮮明。顯微攝影選用高反差系數(shù)，對(duì)控制影象的質(zhì)量是十分重要

26、的。應(yīng)作為選用膠片的重要質(zhì)量指標(biāo)。除上所述，膠片的有效期限、乳劑號(hào)、膠片牌號(hào)和制造廠家，也是選用膠片 時(shí)，加以考慮的因素。五、濾色鏡的選用濾色鏡是顯微攝影必備的光學(xué)濾光元件， 利用濾色鏡對(duì)色光選擇吸收的原理， 通過(guò)控制色光，突出或抑制影象在膠片上的感應(yīng)，以期獲得理想的照相底片。黑白膠片的顯微攝影，是把視野中的彩色影象，以黑白兩色及其不同程度的 灰色中間層次， 將影象錄在負(fù)片上。 利用濾色鏡控制照明光束的不同色光， 調(diào)整 影色的色調(diào)和反差， 可拍出各種不同效果的底片， 甚至拍出在反差和清晰度上優(yōu) 于原物體影象的底片。一束白光，色散后形成紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)和紫七種單色光。這段可見(jiàn) 光譜的波長(zhǎng)為

27、400-700叩，為實(shí)際應(yīng)用的方便，通常將該七種色光概括為紅、綠 和藍(lán)三段。 白光就是由這三種色光等量混合組成。 而紅、綠和藍(lán)色光的不等量混 合，會(huì)形成各種不同的色光。在攝影中，通常把紅色光、綠色光和藍(lán)色光稱(chēng)作三原色光。把藍(lán)光與黃光、 綠光與品紅光、 紅光與青光稱(chēng)作三對(duì)互補(bǔ)色光， 這三對(duì)互補(bǔ)色光分別相加皆可得 到白光、黃、品紅和青三色，就稱(chēng)為紅，綠和藍(lán)三原色的補(bǔ)色。濾色鏡對(duì)各種色光有選擇吸收的特性， 凡與濾色鏡顏色相同的色光那么能透過(guò)， 而與濾色鏡顏色互補(bǔ)的色光那么被吸收。 例如， 綠濾色鏡， 在白光下把光譜中的藍(lán) 色光區(qū)段和紅色光區(qū)段全部吸收，只讓綠色光段的色光透過(guò)，濾色鏡顯示綠色。 黃濾色

28、鏡吸收藍(lán)色光， 透過(guò)紅光和綠色光。 紅濾色鏡， 把光譜中由綠到紅段的光 波全部吸收， 只讓紅色的一段光透射。 藍(lán)濾色鏡吸收了由紅到綠段的色光， 僅讓 紅色的一段光透射， 藍(lán)色濾色鏡吸收了由紅到綠段的色光， 僅使藍(lán)色光通過(guò) 圖 3 15。在顯微鏡的光路上，加用濾色鏡，從白光中減去與濾色鏡顏色互補(bǔ)的色光， 使改變的色光透射物體， 造成影象色調(diào)和反差的改變。 顯微攝影利用濾色鏡提高 影象的反差和清晰度， 以獲得理想的底片， 被攝物體反射出來(lái)的色光， 如果被濾 色鏡透過(guò)， 在黑白底片上產(chǎn)生相應(yīng)的密度， 印放出照片， 這局部影調(diào)， 比擬明亮， 假假設(shè)該色光被濾色鏡吸收，底片上的密度就薄，制出的照片影調(diào)就

29、暗。為提高影象反差，選用濾色鏡的原那么：選用與被攝物體吸收的色光同一顏色 的濾色鏡， 即選用被攝物體的補(bǔ)色濾色鏡， 那么可到達(dá)理想的最正確影象比照。 因?yàn)?視野中的物體影象的色調(diào)和反差， 可被補(bǔ)色的濾色鏡加強(qiáng)， 而被同色的濾色鏡所 削弱。舉例說(shuō)明如下：染色體用鐵礬蘇木精染色，呈藍(lán)色，這種藍(lán)色染色體，吸收紅光和綠光，透 過(guò)藍(lán)光。攝影時(shí)加用藍(lán)色的補(bǔ)色 一 色濾色鏡，可把照明光線中的藍(lán)色光吸收， 通過(guò)的是黃色光， 濾色鏡透射的色光， 恰好是染色體吸收的色光， 致使透射在染 色體上的黃色光全被吸收， 不再作用在底片上。 染色體在沖洗后的底片上呈白色， 其他局部為黑色。印放照片，將是深黑色的染色體，散在

30、光亮的白色背景上，影 象清晰，黑白清楚。又如，在孚爾根反響中，染色體呈陽(yáng)性，顯品紅色，非 DNA 局部不著色。 拍攝時(shí)，加用品紅色的補(bǔ)色 一 色濾色鏡，它吸收紅光和藍(lán)光，透過(guò)綠光；品 紅色的染色體，透過(guò)紅光和藍(lán)光，吸收綠光，濾色鏡透過(guò)的色光，恰是染色體所 能吸收的色光，因而造成了最正確影象反差。對(duì)雙重染色的染色體標(biāo)本，拍攝時(shí)選用突出重要影象的濾色鏡。例如，用孚 爾根反響外加固綠，染色體染成品紅色，細(xì)胞質(zhì)局部呈綠色。加用綠色濾色鏡， 那么突出品紅色，削弱綠色?？傊?，顯微攝影選用濾色鏡，取決于染色體的染色。如果濾色鏡只透染色標(biāo) 本所能吸收的光譜， 或?yàn)V色鏡的透射曲線與標(biāo)本的吸收曲線相同， 即選用補(bǔ)

31、色的 濾色鏡，定會(huì)到達(dá)理想的最正確影象比照。此外，尚須提及的一點(diǎn)：攝影時(shí)選用被攝體同色的濾色鏡，可提高影象的分 辨率。濾色鏡只限于用全色膠片拍攝時(shí)使用， 不能到處濫用。 對(duì)于只有黑白或灰色的物 體影象，由于均勻的吸收或透射各種色光，濾色鏡在此不起作用。六、拍攝拍攝是顯微攝影系列操作中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在鏡檢觀察中，發(fā)現(xiàn)必須攝下的影 象，應(yīng)即時(shí)拍照。 拍攝前，做好系列的操作準(zhǔn)備，具體方法已在前面述及。例如，攝影物鏡和目鏡 的合理組合，光路合軸，科勒照明，合理加用濾色鏡，調(diào)準(zhǔn)孔徑光闌和視野光闌 以及應(yīng)用低速全色膠片等。這些操作，彼此相關(guān)，缺一不同。然后轉(zhuǎn)入取景、聚 焦和曝光拍攝。1、取景和聚焦 顯微攝影

32、要通過(guò)攝影裝置的側(cè)視目鏡取景器，對(duì)準(zhǔn)拍攝的物 體影象，選取適宜的物象進(jìn)行拍照。1屈光度調(diào)節(jié)：取景聚焦前，首先進(jìn)行屈光度調(diào)節(jié)，使目鏡取景器適于 各種不同視力者， 到達(dá)準(zhǔn)確的聚焦。 在顯微攝影裝置的接頭部位， 有一那么視目鏡 取景器圖 3-16，它由數(shù)片透鏡組成，近眼端為屈光度調(diào)節(jié)環(huán)，能左右轉(zhuǎn)動(dòng)，變 換透鏡間距，改變焦點(diǎn)距離，調(diào)節(jié)環(huán)旋轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)的最大范圍為 ±5 屈光度 一屈光度 相當(dāng)于眼鏡的 100度。經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)，使近遠(yuǎn)視眼在 500度以內(nèi)的人，可脫下眼鏡 取景對(duì)焦。雙十字線校準(zhǔn)后，要保持不變，不能隨意變動(dòng)，以防焦距改變。取景聚焦，只需 使用顯微鏡調(diào)焦螺肇。 屈光度調(diào)節(jié)， 僅改變目鏡取景器的

33、長(zhǎng)度， 不涉及被攝物體 至暗箱焦平面的距離， 當(dāng)十字被看成雙線時(shí)， 聚焦的影象焦點(diǎn)， 能清晰地投射在 焦平面上； 如果十字線被看成單線， 既使影象是最清楚的準(zhǔn)焦， 其焦點(diǎn)并不落在 暗箱的焦平面上， 而位其前后， 底片影象模糊不清， 當(dāng)改變拍攝者或左右眼調(diào)換 使用時(shí)，皆需重新進(jìn)行屈光度調(diào)節(jié)。2取景：取景決定拍攝的對(duì)象、范圍和大小。專(zhuān)用攝影設(shè)備，用側(cè)視目鏡 取景器取景，在刻有雙十字線的玻璃屏上， 同時(shí)刻有數(shù)種規(guī)格的長(zhǎng)方形取景框 圖 318。底片所能攝下的范圍，并非視野所見(jiàn)的全部，僅是圓形視野中的長(zhǎng)方形 局部，在可供系列暗箱共同使用的取景器中， 有數(shù)種規(guī)格的取景框， 取景時(shí)要準(zhǔn) 確使用，務(wù)使報(bào)用暗箱

34、的規(guī)格與取景框的大小相符。拍攝的物體一經(jīng)確定后，即要考慮拍攝的范圍和大小 放大倍數(shù) 。例如，拍 攝減數(shù)分裂的同步性， 為展示植物花粉母細(xì)胞在花藥中同步地進(jìn)行減數(shù)分裂， 拍 攝的范圍應(yīng)大， 在一張底片上， 要有足夠數(shù)量的同步分裂的花粉母細(xì)胞， 以數(shù)量 突出同步性。 這時(shí)選用低倍的物鏡和目鏡拍攝。 作為染色體計(jì)數(shù)和組型分析的攝 影，拍攝的范圍要小， 每片要拍全一個(gè)細(xì)胞的染色體， 盡可能利用取景框所能提 供的范圍，提高放大倍數(shù)，使染色體民取景框相接。取景時(shí)，要使被攝的物體影象中心位于長(zhǎng)方形取景框的對(duì)角線中心，并使兩 者的長(zhǎng)、短相應(yīng) 圖 319。需要 90°調(diào)整時(shí)， 轉(zhuǎn)動(dòng)載物面或攝影裝置，讓

35、影象長(zhǎng) 軸和取景框橫軸平行。影象的大小用調(diào)換物鏡和目目鏡控制。3聚焦：轉(zhuǎn)動(dòng)顯微鏡的粗細(xì)調(diào)焦螺旋， 改變物鏡前透鏡和被檢物體的距離， 使視野中物體影象的焦點(diǎn)聚于暗箱的焦平面上?？v橫移動(dòng)鏡臺(tái)的制片標(biāo)本， 尋找拍攝的圖象； 上下轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)焦螺旋， 辨清染色體的 細(xì)微結(jié)構(gòu)，取景聚焦，需幾經(jīng)反復(fù)， 底片影象的清晰度決定于拍攝前的最終一次 準(zhǔn)焦。取景聚焦完畢，立即撳下快門(mén)按鈕，任何有關(guān)操作，都要在聚焦前完成。準(zhǔn) 焦的微小顫抖，也會(huì)引起焦點(diǎn)的改變，致使拍出的底片影象模糊不清。使用 135 或 120 膠片拍攝，卷片在在聚焦前完成， 尤其使用鏡臂升降的顯微鏡更應(yīng)注意。加放濾色鏡務(wù)在聚焦前置于鏡架上，如在聚焦后加用

36、，會(huì)使焦點(diǎn)改變，影象 不清。攝影暗箱的焦平面要與載物臺(tái)平行， 否那么調(diào)焦后的影象， 不會(huì)垂直地投射到膠片 上，致使影象局部清晰，局部模糊。拍攝有絲分裂中期染色體，要對(duì)準(zhǔn)兩個(gè)染色單體間的空隙局部聚焦；具各種 分帶的染色體， 亦可對(duì)準(zhǔn)帶紋準(zhǔn)焦。 同一細(xì)胞內(nèi)的各染色體， 往往不易分散在同 一水平上，多少有一個(gè)深度和或?qū)哟?。?duì)此，要聚焦在中層的染色體上，力爭(zhēng)物 鏡和目鏡所能予的有限的焦點(diǎn)深度， 以期擴(kuò)大清晰范圍。 當(dāng)然，降低物鏡的數(shù)值 孔徑，亦可提高焦點(diǎn)深度。用4或更低的物鏡拍攝，由于焦點(diǎn)深度大，影象在很大的深度內(nèi)都保持清晰， 致使難以做到準(zhǔn)確的聚焦。 為此，要把聚焦望遠(yuǎn)鏡裝上目鏡取景器上， 借以聚焦

37、。 聚焦時(shí)，將望遠(yuǎn)鏡的焦距調(diào)至無(wú)限遠(yuǎn)處， 重新進(jìn)行屈光度調(diào)節(jié)。 待看清兩條平行 的十字線再轉(zhuǎn)入調(diào)焦操作。使用單張散頁(yè)片暗箱攝影，先把暗箱拉蓋抽出，稍待片刻，穩(wěn)后聚焦。2、曝光 曝光是顯微攝影技術(shù)上的關(guān)鍵。曝光最重要的問(wèn)題就是判定曝光時(shí) 間，確定曝光所用的快門(mén)速度。顯微攝影的視野，亮度變化極大，曝光時(shí)間的變 化輻度甚大。 正確的估計(jì)曝光時(shí)間， 比普通攝影要困難得多。 常用的估計(jì)影象亮 度來(lái)確定曝光時(shí)間的方法， 往往因光強(qiáng)度的特大變化， 人眼對(duì)光的強(qiáng)度不會(huì)有科 學(xué)的定量能力，致使發(fā)生錯(cuò)誤。曝光過(guò)度，使底片密度很大，渾暗不清，沒(méi)有透明的地方，喪失影紋細(xì)節(jié)； 在最小密度局部灰霧密度大，底片反差?。黄毓?/p>

38、缺乏，整個(gè)底片密度很小，比擬 透明，雖然最大密度局部影紋清楚， 但最小密度和灰霧密度一樣， 沒(méi)有影紋存在， 缺乏正常的反差。這類(lèi)底片，根本不能印放出合格的照片。影響曝光的因素很多，其中包括：被攝物體的顏色和光學(xué)必須、物鏡的數(shù)值 孔徑和倍數(shù)、目鏡倍數(shù)、膠片的性能、濾色鏡的顏色、光源強(qiáng)度和色溫等因素。 下面概述幾個(gè)主要因素， 除膠片感光速度是表示對(duì)亮度的敏感強(qiáng)度外， 考慮其余 因素的共同著眼點(diǎn)，就是分析它們對(duì)被攝影象的亮度是加強(qiáng)還是削弱。1照明光源：光源燈是顯微攝影的照明光源，它有數(shù)種，照明強(qiáng)度和色溫 各不相同。低壓鎢絲白熾燈為常用的照明光源，燈泡很小，便于使用，燈絲聚成球狀， 頗似點(diǎn)光源，光線易

39、會(huì)聚成束，強(qiáng)度較大。所用電壓6-12V，功率5-60W,以6V15W 的燈泡最常見(jiàn)。燈絲發(fā)出的光譜成分和光量，決定于它的色溫，色溫越高，發(fā)出 的光量越大，光譜成分中藍(lán)紫的比例增多。色溫與電壓有關(guān)，電壓升高，光量愈大，色溫提高，藍(lán)紫光成分增多圖3-21。6V15W燈泡較之12V60W燈泡，無(wú) 論在色溫和發(fā)光量上， 都相差較大。 顯微攝影的曝光時(shí)間， 按所用光源強(qiáng)度而定， 電壓高，功率大的燈泡， 照明強(qiáng)度高， 藍(lán)紫光多， 使膠片感光快， 曝光時(shí)間要短。 與其他光源相比，鎢絲白熾燈的發(fā)光，紅橙光多，藍(lán)紫光少，所以燈光顯黃色。 發(fā)出的光為連續(xù)光譜，加上適當(dāng)?shù)臑V色鏡，可得到可見(jiàn)光譜中的任一單色光。鹵鎢燈

40、為一新型光源燈，發(fā)光效率高，照明強(qiáng)度大。燈泡小，石英玻璃外殼， 發(fā)光燈絲近點(diǎn)狀，色溫在 3000°K 以上，發(fā)光穩(wěn)定，比功率相同的鎢絲白熾燈亮 得多。膠片感光快，曝光時(shí)間要短。鹵鎢燈的光譜曲線也是連續(xù)光譜，常用 12V50W 和 12V100W 的燈泡。適于顯微攝影照明用。氙燈，亦屬新型光源燈，是在充氙氣的石英玻璃管內(nèi)裝上鎢絲電極制成。顯 微攝影照明用的是一種短孤氙燈，為一種亮度極高的點(diǎn)光源。多采用 20V150W 的氙燈照明。氙燈也是連續(xù)光譜，在可見(jiàn)光區(qū)，各種波長(zhǎng)能量大致相等，色溫 6000°K 左右，近于日光的白光。 適于顯微攝影， 尤其適于日光型彩色膠片攝影。 2膠片

41、的感光度：目前，很多單位顯微攝影所用的感光膠片，大多為 ASA10021DIN 的全色膠卷。膠卷的感光度直接影響曝光時(shí)間， ASA 感光標(biāo)準(zhǔn)， 其數(shù)值相差一倍時(shí)， 膠片的感光時(shí)間也相應(yīng)地相差一倍。 例如， ASA100 的膠片， 正確的曝光時(shí)間為 1/15 秒， ASA50 的膠片那么曝光 18秒，而 ASA200 的膠片只 需曝光 130秒。余類(lèi)推。 DIN 制感光標(biāo)準(zhǔn)，每差三個(gè)數(shù)值，膠片感光時(shí)間相差 一倍。如 21°DIN 膠片，正確的感光時(shí)間為 115 秒， 24°DIN 膠片只要曝光 1/30 秒，18°DIN的膠片要用1/8秒，我國(guó)的膠片感光標(biāo)準(zhǔn) “GB制同于“DIN制標(biāo)準(zhǔn)。 使用膠片時(shí)要注意：同一感光度，不同牌號(hào)