發(fā)明專利模板

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上一株發(fā)酵產(chǎn)黑色素的枯草芽孢桿菌及發(fā)酵產(chǎn)黑色素的方法技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明屬于生物工程發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及通過(guò)枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵生產(chǎn)黑色素及提取方法。背景技術(shù)：黑色素是一種廣泛存在于生物體中的一類天然色素，是酪氨酸經(jīng)過(guò)一連串的化學(xué)反應(yīng)形成的，通常以聚合的方式存在。黑色素可以作為吸收紫外線的化妝品成分、天然染發(fā)劑的成分、以及生物殺蟲(chóng)劑的光保護(hù)劑尤其是應(yīng)用于化妝品，因其具有吸收紫外線的作用，可以保護(hù)皮膚；色素有很多重要的生物學(xué)功能,它能通過(guò)與蛋白質(zhì)的交聯(lián)起到強(qiáng)化結(jié)構(gòu)的作用,同時(shí)黑色素還能提供一些機(jī)械力,并且保護(hù)蛋白質(zhì)不被降解；此外黑色素在醫(yī)學(xué)上也具有很廣的應(yīng)用范圍，具有清除自

2、由基、阻止心磷脂脂質(zhì)體的氧化、抗輻射及抗氧化、對(duì)病理學(xué)和分類學(xué)的研究具有重要意義、作為新型的天然藥物載體、用來(lái)治療某些與黑色素缺乏相關(guān)的神經(jīng)性疾病,例如白癜風(fēng)是常見(jiàn)的一種由于黑色素的缺失而引起的一種疾病。目前，黑色素既可以通過(guò)酪氨酸或其衍生物的氯化進(jìn)行化學(xué)合成，也可以從動(dòng)植物材料中提取，還可以利用微生物合成，但現(xiàn)在大規(guī)模生產(chǎn)黑色素仍以化學(xué)合成法為主。例如一種以哺乳類動(dòng)物的毛發(fā)為原料和一種以黑芝麻味原料，用氫氧化鈉溶液浸提后采用鹽析作為沉淀劑使黑色素沉淀來(lái)制取黑色素的方法。但隨著人們對(duì)以化學(xué)原料合成黑色素安全性問(wèn)題的認(rèn)識(shí)，現(xiàn)越來(lái)越傾向于對(duì)天然黑色素的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。尤其傾向于用微生物液體發(fā)酵生產(chǎn)黑色

3、素。天然黑色素安全性高，成分確定可操作性強(qiáng)，尤其是采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)黑色素具有反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、低成本等特點(diǎn)?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)對(duì)利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)黑色素的研究還較少，本發(fā)明是利用枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵生產(chǎn)黑色素。發(fā)明內(nèi)容：本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有黑色素合成工藝的不足，提供一種利用微生物液體發(fā)酵生產(chǎn)黑色素并提取的方法。本發(fā)明所用菌株為枯草芽孢桿菌*（ ）現(xiàn)已保藏在中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC），保藏編號(hào)為*本枯草芽孢桿菌*（ ）屬于革蘭氏陰性菌 本發(fā)明的技術(shù)方案：通過(guò)枯草芽孢桿菌的液體發(fā)酵生產(chǎn)黑色素，其過(guò)程包括菌種的斜面培養(yǎng)、種子液培養(yǎng)、搖床發(fā)酵培養(yǎng)、深層液體發(fā)酵培養(yǎng)和黑色素的提取。本發(fā)

4、明的具體步驟為:(1)發(fā)酵菌種的準(zhǔn)備：取保存在-80的枯草芽孢桿菌接種于于固體培養(yǎng)基中，劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度3638，培養(yǎng)時(shí)間4872h，挑取單菌落作為種子菌。固體培養(yǎng)基的配制方法：成分為蛋白胨1g、葡萄糖0.1g、NaCl0.5g、CaCl2 0.01g、L-酪氨酸0.1g、瓊脂粉1.5g，然后用去離子水定容到100ml，調(diào)節(jié)PH為7.0，最后在溫度121、高壓蒸汽滅菌1520min，冷卻制得固體平板。(2)種子液發(fā)酵培養(yǎng)：將固體平板菌接種于種子液中，在溫度3638、轉(zhuǎn)速181r/min，培養(yǎng)1216h，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。種子液的配制方法：成分為蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、NaCl1g然后用去離子

5、水定容至100ml，調(diào)節(jié)PH為7.0，分裝到若干個(gè)250ml搖瓶中，在溫度121、高壓蒸汽滅菌1520min，冷卻得到種子液。(3)將種子液進(jìn)行放大培養(yǎng)：取上述（2）種子液按接種量6%（V/V）接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度3638、轉(zhuǎn)速181r/min培2226h，然后加入L-酪氨酸0.1g/100ml，再繼續(xù)培養(yǎng)2030h。發(fā)酵培養(yǎng)基制備：成分為氮源1.5%2.5%、碳源1.5%2.5%、NaCl0.4g、KH2PO4、MgSO4.7H2O 0.02g、KNO31g、（NH4）2SO4 1g、玉米粉1g，然后用去離子水定容到100ml，調(diào)節(jié)PH為7.0，在溫度121、高壓蒸汽滅菌20min制得

6、發(fā)酵液。上述（3）中發(fā)酵液：氮源可為酵母膏、尿素中的一種或多種。碳源可為麩皮、蔗糖、乳糖中的一種或多種。深層通風(fēng)液體發(fā)酵培養(yǎng)：（5）發(fā)酵液中黑色素的提取：發(fā)酵結(jié)束后將枯草芽孢桿菌黑色素發(fā)酵液過(guò)濾或者離心除去菌體，取發(fā)酵液濃縮，用5mol/LHCl調(diào)pH值至23，充分振蕩,靜置40100min，在攪拌的同時(shí)加入等體積有機(jī)溶劑使其充分沉淀，用濾布過(guò)濾棄上清，得黑色粗提物，于50真空干燥至恒重。所述發(fā)酵液離心轉(zhuǎn)速為50008000r/min，離心10min，除去菌體。所述有機(jī)溶劑為無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇或無(wú)水丙酮中任意一種。所述有機(jī)溶劑為濃度40%100%的乙醇。所述黑色素發(fā)酵液的濃縮比為50%。所述靜

7、置可以為恒溫水浴中靜置，水浴溫度為0100。所述水浴溫度優(yōu)選為80。本發(fā)明制備黑色素的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明方法制備的黑色素具有安全、簡(jiǎn)單、高效等優(yōu)點(diǎn)。在化妝業(yè)、工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。產(chǎn)自枯草芽孢桿菌的黑色素降低的生產(chǎn)能耗、縮短的生產(chǎn)周期、對(duì)環(huán)境危害小，于國(guó)家倡導(dǎo)的可持續(xù)性發(fā)展相結(jié)合。具體實(shí)施方式：下面結(jié)合具體事例對(duì)發(fā)明做詳細(xì)介紹：本發(fā)明所用菌種為枯草芽孢桿菌*（ ）現(xiàn)已保藏在中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC），保藏編號(hào)為*本枯草芽孢桿菌*（ ）屬于革蘭氏陰性菌 實(shí)施例一、種子液的培養(yǎng) (1)發(fā)酵菌種的準(zhǔn)備：取保存在-80的枯草芽孢桿菌菌種于固體培養(yǎng)基中，劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度

8、3638，培養(yǎng)4872h，挑取單菌落作為種子液菌種。固體培養(yǎng)基的配制方法：成分為蛋白胨1g、葡萄糖0.1g、NaCl0.5g、CaCl2 0.01g、L-酪氨酸0.1g、瓊脂粉1.5g，然后用去離子水定容到100ml，用NaOH或HCL調(diào)節(jié)PH為7.0，在溫度121、高壓蒸汽滅菌1520min，冷卻制得固體平板。(2)枯草芽孢桿菌種子液培養(yǎng)：將固體平板菌接種于種子液中，在溫度3638、轉(zhuǎn)速181r/min，培養(yǎng)1216h，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。 種子液的配制方法：成分為蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、NaCl1g然后用去離子水定容至100ml，用NaOH或HCL調(diào)節(jié)PH為7.0，分裝到2個(gè)250ml搖瓶中

9、，在溫度121 、高壓蒸汽滅菌1520min，冷卻得到種子液。實(shí)施例二、 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)取上述枯草芽孢桿菌種子液按接種量6%（V/V）接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度3638、轉(zhuǎn)速181r/min培2226h，然后加入L-酪氨酸0.1g/100ml，再繼續(xù)培養(yǎng)2030h。發(fā)酵培養(yǎng)基制備：成分為氮源1.5%2.5%、碳源1.5%2.5%、NaCl0.4g、KH2PO4、MgSO4.7H2O0.02g、KNO31g、（NH4）2SO41g、玉米粉1g，然后用去離子水定容到100ml，調(diào)節(jié)PH為7.0，在溫度121、高壓蒸汽滅菌20min制得發(fā)酵液。上述發(fā)酵培養(yǎng)基中：源可為酵母膏、尿素中的一種或多種。碳源可為麩皮、蔗糖、乳糖中的一種或多種。實(shí)施例三、深層通風(fēng)液體發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)施例四、發(fā)酵液中黑色素的提取發(fā)酵罐裝液量為15L，接種量為6%（V/V）,溶氧量20%,37181r/min，在24h后加入L-酪氨酸0.1g/100ml培養(yǎng)2-3d。發(fā)酵結(jié)束后將枯草芽孢桿菌黑色素發(fā)酵液過(guò)濾或者離心除去菌體，取發(fā)酵液濃縮，用5mol/LHCl調(diào)pH值至23，充分振蕩,靜置40100min，在攪拌的同時(shí)加入等體積有機(jī)溶劑使其充分沉淀，用濾布過(guò)濾棄上清，得黑色粗提物，于50真空干燥至恒重。所述發(fā)酵液離心轉(zhuǎn)速為5000