酶工程復(fù)習(xí)材料

1、1. 酶生物合成的模式有哪些？哪一種模式較為適合生產(chǎn)的需要？對于其他的合成模式，應(yīng)如何調(diào)節(jié)發(fā)酵的條件以使其更為趨近于最佳的模式？酶生物合成的模式·同步合成型·延續(xù)合成型·中期合成型·滯后合成型同步合成型概念：酶的合成與細(xì)胞生長同步進(jìn)行。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，酶大量產(chǎn)生，細(xì)胞生長進(jìn)入穩(wěn)定期后，酶的合成隨之停止。特點(diǎn)：屬于這種類型的酶，其生物合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏和產(chǎn)物阻遏作用。延續(xù)合成型概念：酶的合成伴隨著細(xì)胞的生長而開始，但在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡之后，酶還可以延續(xù)合成較長的一段時間。特點(diǎn)：這種類型的酶可受誘導(dǎo)但不受分解代謝物阻遏和產(chǎn)物阻遏，其對應(yīng)

2、的mRNA是相當(dāng)穩(wěn)定的。中期合成型概念：酶的合成在細(xì)胞生長一段時間以后開始，而在細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的合成也隨著停止。特點(diǎn)：酶的合成受到反饋?zhàn)瓒簦移渌鶎?yīng)的mRNA 是不穩(wěn)定的。滯后合成型概念：只有當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶才開始合成并大量積累。特點(diǎn)：酶的合成受到分解代謝物阻遏作用。 在酶工程生產(chǎn)中為了提高酶的生產(chǎn)率，延長酶的發(fā)酵生產(chǎn)周期，酶最理想的生物合成模式應(yīng)為部分生長偶聯(lián)型（延續(xù)合成型），因?yàn)檫@類酶在發(fā)酵過程中沒有明顯的生長期和產(chǎn)酶區(qū)的區(qū)別，隨細(xì)胞生長即有酶的產(chǎn)生，直到細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期之后酶還可以合成。對于其他型的酶，要提高酶產(chǎn)率，可以再細(xì)胞選育上，工藝條件等方面加以條件控制。對于

3、同步合成型的酶，可以采用適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)工藝，如降低發(fā)酵溫度以盡量提高其對應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性；對于滯后合成型的酶，在發(fā)酵過程中應(yīng)設(shè)法盡量減少甚至借出分解代謝物阻遏，使酶的合成提早開始, 控制葡萄糖等易利用碳源, 添加一定量的cAMP；對于中期合成型的酶，則要在提高mRNA穩(wěn)定性和解除阻遏兩方面進(jìn)行?？刂颇┒水a(chǎn)物濃度,添加末端產(chǎn)物類似物2. 試以基因調(diào)節(jié)控制理論說明酶生物合成的分解代謝物阻遏作用、誘導(dǎo)作用及反饋?zhàn)瓒糇饔玫脑怼?基因調(diào)節(jié)控制理論-操縱子學(xué)說分解代謝物阻遏作用是指容易利用的碳源阻遏某些酶（主要是誘導(dǎo)酶）生物合成的現(xiàn)象酶生物合成的誘導(dǎo)作用是指加進(jìn)某種物質(zhì)，使酶的生物合成開始或加速進(jìn)行的過

4、程酶合成的反饋?zhàn)瓒糇饔檬侵该复呋饔玫漠a(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使該酶的合成受阻的過程3. 何為酶電極、酶標(biāo)免疫測定？酶標(biāo)免疫測定是指在放射免疫測定的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種分析方法，它是將酶作為標(biāo)記物質(zhì)，使之和抗原（或抗體）結(jié)合形成酶與抗原（或抗體）復(fù)合物，然后再根據(jù)待測抗體（或抗原）與復(fù)合物專一且定量的結(jié)合關(guān)系，通過測定與待測抗體（或抗原）結(jié)合的酶的活力，從而計(jì)算出待測抗體（或抗原）的量。酶電極是最早問世的生物傳感器，它是把測定無機(jī)離子或低分子量氣體的電化學(xué)器體（如離子選擇性電極或氣敏電極）與酶固定化技術(shù)相結(jié)合而產(chǎn)生的傳感器，使原來僅有測量物理量功能的電極具備了測量生物化學(xué)量的功能，它在生物試樣

5、化學(xué)成分的檢測方面具有良好的選擇性和較強(qiáng)的特異性。4. 試以米氏方程說明酶法分析、酶活測定的原理。 酶活力測定（Enzyme Assay）分析對象 酶一般常測定酶促反應(yīng)的初速度以確定酶活力。酶單位：1961 年，國際生化聯(lián)合會酶委員會建議，一個酶單位為在確定的最適反應(yīng)條件下，每分鐘催化1 ml分子底物變化所需要的酶量。測定原理:酶法分析（Enzyme Analysis ）分析工具 酶（酶免分析、酶電極）原理：米氏方程：當(dāng)s << km 時，即反應(yīng)體系中底物濃度較低，酶量足或過量時，v vm/km.s ，即測定的酶活（反應(yīng)速度）與體系中的底物濃度成正比，具有線性的比例關(guān)系。6. 何為

6、酶工程、抗體酶、半抗原、酶的專一性，酶的分類.Ø 酶工程即利用酶的催化作用，在一定的生物反應(yīng)器中，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所需的產(chǎn)品。酶工程是現(xiàn)代酶學(xué)理論與化工技術(shù)的交叉技術(shù)，它的應(yīng)用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域。Ø 抗體酶通過改變抗體中與抗原結(jié)合的微環(huán)境，并在適當(dāng)部位插入催化基團(tuán)，所產(chǎn)生的具有催化活性的抗體。Ø 半抗原有些小分子化合物（如藥物）因其結(jié)構(gòu)簡單，本身不是抗原，不能免疫動物，但是當(dāng)它和蛋白質(zhì)載體結(jié)合后就可以成為抗原，免疫動物因之產(chǎn)生的抗體可以與小分子化合物本身起抗原抗體反應(yīng)，這種小分子化合物一般稱之為半抗原。Ø 酶的專一性是指酶對催化

7、反應(yīng)和反應(yīng)物有嚴(yán)格的選擇性。被作用的反應(yīng)物通常叫做底物，酶往往只能催化一種或一類反應(yīng)，作用于一種或一類物質(zhì)，一般催化劑沒有這樣的選擇性。酶作用專一性的類型1. 立體異構(gòu)專一性a) 立體異構(gòu)專一性(L/D)b) 幾何異構(gòu)專一性(順/反)2. 非立體化學(xué)專一性a)絕對專一性:A Bb)相對專一性 1) 鍵專一性:A B2) 基團(tuán)專一性:A -B,A- B酶作用專一性的機(jī)制：誘導(dǎo)契合學(xué)說該學(xué)說認(rèn)為酶表面并沒有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀。（酶的化學(xué)本質(zhì)：蛋白質(zhì)、 RNA、DNA、抗體酶）Ø 酶的分類1. 氧化還原酶類Oxidoreductases2. 轉(zhuǎn)移

8、酶類 Transgerases3. 水解酶類 Hydrolases4. 裂合酶類 Lyases5. 異構(gòu)酶類 Isomerases6. 合成酶類 SynthetasesSynthases7.簡述酶蛋白的結(jié)構(gòu)特征、酶高效催化作用的原理或機(jī)制。Ø 酶蛋白的結(jié)構(gòu)特征：·結(jié)合部位Binding site酶分子中與底物結(jié)合的部位或區(qū)域一般稱為結(jié)合部位。結(jié)合部位決定酶的專一性·催化部位 Catalytic site酶分子中促使底物發(fā)生化學(xué)變化的部位稱為催化部位。通常將酶的結(jié)合部位和催化部位總稱為酶的活性部位或活性中心。催化部位決定酶所催化反應(yīng)的性質(zhì)。·調(diào)控部位 Re

9、gulatory site酶分子中存在著一些可以與其他分子發(fā)生某種程度的結(jié)合的部位，從而引起酶分子空間構(gòu)象的變化，對酶起激活或抑制作用。酶活性中心的必需基團(tuán)主要包括：親核性基團(tuán)：絲氨酸的羥基，半胱氨酸的巰基和組氨酸的咪唑基。酸堿性基團(tuán)：門冬氨酸和谷氨酸的羧基，賴氨酸的氨基，酪氨酸的酚羥基，組氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巰基等。Ø 酶作用高效率的機(jī)制:一、中間產(chǎn)物學(xué)說在酶催化的反應(yīng)中，第一步是酶與底物形成酶底物中間復(fù)合物。當(dāng)?shù)孜锓肿釉诿缸饔孟掳l(fā)生化學(xué)變化后，中間復(fù)合物再分解成產(chǎn)物和酶。E + S = E-S P + E許多實(shí)驗(yàn)事實(shí)證明了ES復(fù)合物的存在。ES復(fù)合物形成的速率與酶和底物的性質(zhì)

10、有關(guān)。二、活化能降低酶催化作用的本質(zhì)是酶的活性中心與底物分子通過短程非共價力(如氫鍵,離子鍵和疏水鍵等)的作用，形成E-S反應(yīng)中間物，其結(jié)果使底物的價鍵狀態(tài)發(fā)生形變或極化，起到激活底物分子和降低過渡態(tài)活化能作用。1.趨近和定向效應(yīng)趨近效應(yīng): 在酶促反應(yīng)中，底物分子結(jié)合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效濃度大大增加，有利于提高反應(yīng)速度；定向效應(yīng):另一方面，由于活性中心的立體結(jié)構(gòu)和相關(guān)基團(tuán)的誘導(dǎo)和定向作用，使底物分子中參與反應(yīng)的基團(tuán)相互接近，并被嚴(yán)格定向定位，使酶促反應(yīng)具有高效率和專一性特點(diǎn)。2.底物變形與張力學(xué)說酶(E)與底物(S)結(jié)合后,使底物的某些敏感鍵發(fā)生變形,從而使底物分子接近

11、于過度態(tài),降低反應(yīng)的活化能;同時,由于底物的誘導(dǎo),酶分子的構(gòu)象發(fā)生表化，并對底物產(chǎn)生張力作用(多為酶中金屬離子引起)使底物扭曲,促進(jìn)ES進(jìn)入過度態(tài)。3. 共價催化催化劑通過與底物形成反應(yīng)活性很高的共價過渡產(chǎn)物，使反應(yīng)活化能降低，從而提高反應(yīng)速度的過程，稱為共價催化。·酶中參與共價催化的基團(tuán)主要包括His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羥基等。·某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價催化作用。4. 酸堿催化酸-堿催化可分為狹義的酸-堿催化和廣義的酸-堿催化。酶參與的酸-堿催化反應(yīng)一般都是廣義的酸堿催化方式。廣義酸堿催化是指通過質(zhì)子酸提供部分

12、質(zhì)子,或是通過質(zhì)子堿接受部分質(zhì)子的作用，達(dá)到降低反應(yīng)活化能的過程。廣義酸基團(tuán)（質(zhì)子供體）廣義堿基團(tuán)（質(zhì)子受體）His 是酶的酸堿催化作用中最活潑的一個催化功能團(tuán)。8.過濾、脫鹽及濃縮的主要方法.過濾過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)。其中以各種高分子膜為過濾介質(zhì)的過濾稱為膜分離技術(shù)。過濾技術(shù)：1粗濾：顆粒直徑>2m微濾：顆粒直徑0.2 m 2 m 分離細(xì)菌、灰塵2膜分離技術(shù)：超濾：顆粒直徑20 Å 0.2 m 分離不同分子量的物質(zhì)反滲透：顆粒直徑<20 Å 分離各種離子與小分子物質(zhì)粗濾可分為常壓過濾、加壓過濾、減壓過濾。為了加快過濾速度，提

13、高分離效果，經(jīng)常需要添加助濾劑。常用的有硅藻土、活性炭、紙粕等。膜分離：加壓膜分離；電場膜分離（電滲析、離子交換膜電滲析）；擴(kuò)散膜分離（透析）：用于酶、蛋白質(zhì)等大分子的濃縮與脫鹽。脫鹽可以超濾、透析（擴(kuò)散膜分離）以及層析法進(jìn)行脫鹽。濃縮酶的濃縮有五種方式：蒸發(fā)濃縮、膠過濾濃縮、超濾濃縮、反復(fù)凍融濃縮、聚乙二醇濃縮法9.層析的主要方法，簡述疏水作用層析、離子交換層析等各種層析方法分離酶蛋白的原理。層析是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的大小、形狀、分子極性、吸附力、分子親和力和分配系數(shù)等）的不同，使各組分在層析的固定相和流動相之間的分布程度不同而得到分離，又稱為色譜分離。·凝膠層

14、析概念：又稱“分子篩、體積排阻色譜”，是根據(jù)溶質(zhì)分子量的大小不同而進(jìn)行分離的一種相色譜技術(shù)。·離子交換層析概念：是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)對各種離子的親和力不同，而使不同的蛋白質(zhì)組分得以分離的方法。原理：離子交換層析是利用電荷間相互作用使不同蛋白質(zhì)得以分離·疏水層析·吸附層析概念：是利用吸附劑對不同酶蛋白的吸附力不同，而使混和液中的各種蛋白質(zhì)得以分離的方法。原理：表面積較大的吸附劑，在低PH、低離子強(qiáng)度下吸附，在提高PH、增加離子強(qiáng)度的條件下解吸。·親和層析概念：是利用生物分子對之間所具有的專一而又可逆的親和力而使生物分子分離純化的技術(shù)。酶與底物，酶

15、與競爭性抑制劑，酶與輔酶之間即是具有專一而又可逆的親和力的分子對·反相色譜和疏水作用色譜10.純化表的計(jì)算及純化工藝優(yōu)劣的評價。11.酶的固定化：概念、方法及固定化工藝優(yōu)劣的評價。通過化學(xué)或物理的手段將酶或游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域內(nèi)，使其保持活性并可反復(fù)利用的技術(shù)。固定化酶(immobilized enzyme)固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。固定化細(xì)胞（immobilized cell）固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動（生長、繁殖、新陳代謝）的細(xì)胞。1.吸附法依據(jù)帶電的酶或細(xì)胞和載體之間的靜電作用，使酶吸附于惰性固體的表面或離子交換劑上。1）物理吸附法

16、（physical adsortion）作用力：氫鍵、疏水鍵常用載體：氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石、纖維素等。2）離子結(jié)合法（ion binding）作用力：離子鍵常用載體：DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-纖維素優(yōu)點(diǎn)：條件溫和，操作簡便，酶活力損失少。缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，易解吸附。2.共價偶聯(lián)法借助共價鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體的功能基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)。優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，不會輕易脫落，可連續(xù)使用。缺點(diǎn)：反應(yīng)條件較激烈，易影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性3.交聯(lián)法（crosslinking）借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)的固定化方法。雙功能試劑：常用

17、的是戊二醛,戊二醛有兩個醛基，均可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng),使酶蛋白交聯(lián)。此法與共價偶聯(lián)法利用的均是共價鍵，不同之處：交聯(lián)法不使用載體。交聯(lián)反應(yīng)既能發(fā)生在分子間，也可發(fā)生在分子內(nèi)。 酶濃度低時，交聯(lián)發(fā)生在分子內(nèi)，酶仍保持溶解狀態(tài)。 酶濃度高時，交聯(lián)發(fā)生在分子間，酶變?yōu)椴蝗軕B(tài)。優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，不易輕易脫落，可連續(xù)使用。缺點(diǎn)：(1)反應(yīng)條件激烈，酶分子的多個基團(tuán)被交聯(lián)，酶活力損失大。(2)制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來不便4. 包埋法（entrapment）將酶用物理的方法包埋在各種載體（高聚物）內(nèi)。分為：網(wǎng)格型：將酶包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中。微囊型：將酶包埋在高分子半透膜中。與網(wǎng)

18、格型包埋法相比，微囊型包埋法的優(yōu)點(diǎn)：1）固定化酶顆粒小，有利于底物和產(chǎn)物擴(kuò)散。2）半透膜能阻止蛋白質(zhì)分子滲漏和進(jìn)入，注入體內(nèi)既可避免引起免疫過敏反應(yīng)，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有較大的醫(yī)學(xué)價值。缺點(diǎn)：反應(yīng)條件要求高,制備成本也較高。包埋法是目前應(yīng)用最多的一種較理想的方法，與其它固定化方法相比：優(yōu)點(diǎn)：不與酶蛋白氨基酸殘基反應(yīng)，很少改變酶的高級結(jié)構(gòu)，酶活回收率高。缺點(diǎn)：只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。112.何為鹽析沉淀、酶的分子修飾、等電聚焦電泳。鹽析沉淀鹽析沉淀是利用在弄一濃度鹽溶液中，不同的蛋白質(zhì)和酶的溶解度各不相同的原理，對酶蛋白進(jìn)行分離的方法。原理：對于含有多種蛋白質(zhì)或酶的混合液

19、，可以采用分段鹽析的方法進(jìn)行分離純化。因?yàn)樵谀骋粷舛鹊柠}溶液中，不同的蛋白質(zhì)和酶的溶解度各不相同，故可達(dá)到彼此分離的目的。酶的分子修飾通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等電聚焦電泳概念：在電泳系統(tǒng)中加入兩性電解質(zhì)載體，通以直流電后，兩性電解質(zhì)即在電場中形成一個由陽極到陰極連續(xù)增高的PH梯度。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)、多肽或酶進(jìn)入這個體系時，不同的蛋白質(zhì)即移動到與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上，從而使不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)得以分離。良好的載體兩性

20、電解質(zhì)必備的條件13.對于未知蛋白的分離，如何選擇恰當(dāng)?shù)碾x子交換層析的介質(zhì)？14.酶的分子修飾的方法有哪些？如何運(yùn)用蛋白質(zhì)工程的方法來改造天然的酶分子？分子修飾通過各種方法使酶的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變了酶的某些特性和方法，以提高酶的活力，增加酶的穩(wěn)定性，消除或降低酶的抗原性等的過程，稱之。蛋白質(zhì)工程§蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)預(yù)測§利用分子生物學(xué)技術(shù)方法改造酶蛋白一級結(jié)構(gòu),進(jìn)而改造其高級結(jié)構(gòu)酶分子的修飾方法·金屬離子置換修飾,·大分子結(jié)合修飾(共價/非共價)·側(cè)鏈基團(tuán)修飾·肽鏈有限水解修飾·氨基酸置換修飾·酶分子的物理修飾利用基因工程技術(shù)定向改造酶蛋白的結(jié)構(gòu)基因定點(diǎn)誘變（ Site-directed mutagenesi s）PCR 誘變（PCR mutagene