測序常見問題分析實例

1、測序常見問題分析實例 峰型整齊，在某一點前后突然變亂信號迅速衰減信號極弱或無信號整條序列信號雜亂                                       峰型整齊，在某一點前后突然變亂： 圖1 Pol

2、yT特殊結(jié)構(gòu)     上圖是我們的一個質(zhì)粒測序樣品，用T7通用引物進行測序，從圖中可以看出，在約285bp的polyT結(jié)構(gòu)后，序列明顯變亂。主要原因是在polyT結(jié)構(gòu)后，測序酶容易在模板上滑動，導(dǎo)致polyT結(jié)構(gòu)后的峰型變得雜亂。此類樣品通過對其反向互補序列進行測序，一般可以得到好的結(jié)果。圖2 移碼突變雙模板的存在    上圖是我們的一個質(zhì)粒測序樣品，用M13+通用引物進行測序，從圖中可以看出，該序列在290bp后序列明顯有兩套峰存在。造成該現(xiàn)象的原因可能有如下幾條：序列發(fā)生缺失突變插入外援片段的載體和未插入外援片段的載體同時存在PC

3、R產(chǎn)物用T載體進行克隆時，PCR片段可以以兩個方向克隆進T載體所挑克隆不純兩個大小相近的PCR產(chǎn)物同時存在，無法純化分開解決的辦法：對于質(zhì)粒模板，重新挑選克隆，或從另一段進行測序?qū)τ赑CR模板，用另一端引物進行測序，或克隆后進行測序圖3 等位基因雙模板的存在    上圖是針對一個質(zhì)粒進行的測序結(jié)果，從圖中可以明顯看出，在序列的80bp到120bp之間有兩套峰存在，但是沒有發(fā)生移碼突變。該情況與圖2所舉的例子有所不同，該情況下從反向進行測序仍然不可能得到好的測序結(jié)果。該種情況下只能采取克隆的方法將兩套模板分開，分別進行測序。信號迅速衰減   &#

4、160;                                                 &#

5、160;                 返回 圖4 CTT重復(fù)結(jié)構(gòu)    如上圖，在大約260堿基后出現(xiàn)了一個嚴重的CTT重復(fù)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致信號迅速衰減，很難得到跨過該區(qū)后的信息。該種情況下，只能從另一端進行測序，一般來說，AAG重復(fù)結(jié)構(gòu)不會太影響測序。也可以對片段進行亞克隆，使每個片段大小不大于200bp，然后再進行測序。不過，該方法要麻煩很多。 圖5 GGT重復(fù)結(jié)構(gòu)嚴重影響測序  &#

6、160;  上圖下半部分是一個質(zhì)粒模板用M13+通用引物進行測序，大約在130bp開始，出現(xiàn)GGT重復(fù)結(jié)構(gòu)，測序信號迅速減弱至消失。上圖的上半部分是用M13-通用引物從反向進行測序，在反向序列上該重復(fù)是GGT的反向互補序列，即ACC，大約在500bp處，測序很輕松地就讀過了ACC重復(fù)序列區(qū)。GGT重復(fù)結(jié)構(gòu)嚴重影響測序的原因是在測序試劑盒中，為了得到均勻的測序峰型圖，G和T堿基均進行了替代，分別替代成I和U，因此與模板的結(jié)合能力減弱，測序酶反應(yīng)到此后就比較難延伸下去，導(dǎo)致該區(qū)域后信號迅速減弱。通過優(yōu)化多種條件，可以對結(jié)果有一點改善，但仍然不能得到可用的結(jié)果。對該類型的模板，對反向互補鏈

7、進行測序，可以很輕松地跨過該區(qū)域。  圖6 GC特殊結(jié)構(gòu)區(qū)    上圖是一個質(zhì)粒模板用M13+通用引物進行測序的結(jié)果，序列中存在一個GC特殊結(jié)構(gòu)區(qū)，在該區(qū)域后，信號迅速減弱。上圖的下半部分是對測序反應(yīng)進行優(yōu)化后的測序結(jié)果，在GC特殊結(jié)構(gòu)后，測序信號得到一定程度的改善，但是離一般的測序結(jié)果還是相差甚遠。針對該類型的模板，一般應(yīng)從反向進行測序，然后在該特殊結(jié)構(gòu)區(qū)附近將兩個方向的測序結(jié)果拼接起來，得到完整的序列。圖7 模板特殊結(jié)構(gòu)    上圖是一個pGEM-T載體用M13+引物進行測序，可以看出，序列在載體后迅速衰減，造成此現(xiàn)象的

8、原因一直不明，我們試用了多種方法試圖解決該測序問題，但幾乎毫無效果。該種情況很有可能是在全序列中有大的特殊結(jié)構(gòu)，造成嚴重的二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)，使測序酶無法讀過此區(qū)域。正常情況下pGEM-T載體測序結(jié)果非常理想。                         返回信號極弱或無信號 造成該現(xiàn)象主要有兩個原因：模板質(zhì)量極差；   引物與模板序列不匹配。 圖8

9、 pGEM質(zhì)粒用T3通用引物進行測序，測序結(jié)果無可用信息，因為pGEM載體上無T3通用引物結(jié)合位點。上圖中兩處峰前面的一個主要是未去除的測序反應(yīng)單體造成的，靠右邊的一處峰主要是引物的非特異性反應(yīng)造成的。       在我們每天的測序樣品中，有相當一部分測序失敗的樣品是由于缺少引物結(jié)合序列造成的，主要有下面幾種原因可能造成該種結(jié)果：客戶提供了錯誤的載體信息或引物信息，用客戶自己在克隆片段上的引物對質(zhì)粒進行測序，但是該質(zhì)粒為空載體，不包含插入片段。載體由于突變，丟失了原來的引物結(jié)合位點。圖9 一個PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果，整個序列信號極低，幾

10、乎無可用信息。造成該現(xiàn)象主要是在測序反應(yīng)中，模板的量太低，所得信號太弱。       重新提供足夠量的模板一般可以得到較好的測序結(jié)果。                          返回  整條序列信號雜亂       模板本

11、身的問題： 圖10 一個污染的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果，可以看出，整條序列都有極高的背景。 有以下幾個原因可能造成測序模板污染：   PCR產(chǎn)物有雜帶 質(zhì)粒類型的模板克隆不純 對于PCR類型的模板，我們現(xiàn)在都采取切膠的方法進行純化。該純化方法一般情況下可以將PCR產(chǎn)物的雜帶及多余的引物去掉。但是，當擴增的片段中包含有大小非常近似的片段時，切膠純化的方法也無濟于事了。該情況下只能采取將待測的PCR產(chǎn)物進行克隆測序了。質(zhì)粒類型的測序模板一般有兩種原因可以造成模板污染。一為所挑選的克隆不純，包含兩種或兩種以上的克隆，如不包含插入片段的克隆和包含插入片段的克隆的混合體，用T載體

12、進行PCR產(chǎn)物克隆時，正向插入的克隆和反向插入的克隆的混合體等。通常重新挑選獨立的克隆可以解決該問題。第二種情況是一些產(chǎn)量很低的質(zhì)粒，測序時需要加入較多體積的模板，因此相應(yīng)包含的雜質(zhì)就要多了，這些增加的雜質(zhì)對測序?qū)a(chǎn)生極大的影響。通常我們要求質(zhì)粒的產(chǎn)量要達到每毫升菌液能夠提取到至少200 ng的質(zhì)粒，低于此產(chǎn)量的質(zhì)粒用于測序成功率將大大下降。對于低產(chǎn)量的質(zhì)粒，一般讓客戶自己采取大量提取的方法，拿到足夠用于測序的量的質(zhì)粒，最少1ug。圖11 PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果，該結(jié)果信號很強，峰型整齊，但是在該測序結(jié)果中有多個位置有重疊峰，出現(xiàn)N值。造成該情況的主要原因很可能是該PCR產(chǎn)物中有突變體的存在。在每個突變位點上有一個重疊的峰，由于儀器無法正確識別該處的堿基，就只能以N值代替。在有的測序結(jié)果中，整條序列信號很好，在個別位置有N值，一定要確認該處N值的具體情況，如果卻是兩個重疊峰存在，重新測序也解決不了問題。