不同微環(huán)境對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為產(chǎn)胰島素細(xì)胞影響

1、第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文目錄縮略語(yǔ)表 . 1中文摘要 . 2ABSTRACT . 5前言 . 9文獻(xiàn)回顧 .11第一部分 干細(xì)胞治療糖尿病研究進(jìn)展 . 11第二部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與微環(huán)境的研究進(jìn)展 . 28正小文 . 46第一部分 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性 . 461 材料. 462 方法. 483 結(jié)果. 514、討論. 54第二部分 不同微環(huán)境對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為產(chǎn)胰島素細(xì)胞的影響 . 571、材料. 572、實(shí)驗(yàn)方法. 593、結(jié)果與分析. 624、討論. 64第三部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在糖尿病大鼠體內(nèi)微環(huán)境下分化的研究 . 671、材 料. 672、實(shí)驗(yàn)方法.

2、 683、結(jié)果與分析. 714、討論. 74結(jié) . 78參考文獻(xiàn) . 79附圖 . 100個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果 . 103致謝 . 104第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文縮略語(yǔ)表縮略詞MSCsIPCsESCsASCsPSCsIDDMNIDDMFCSITSKGFDMSOSTZSPBSADMEMDABPBSrpmDTZPDX-1CK英文全稱(chēng)mesenchymal stem cellsinsulin-producing cellsembryonic stem cellsadult stem cellspancreas stem cellsInsulin dependent diabetes mellitusN

3、on-insulin dependent diabetes mellitusFetal calf serumInsulin-Transferrin-Seleniumkeratinocyte growth factordimethyl sulfoxideStreptozotocinStreptavidin peroxidasebovine serum albumindulbeccos modified eagle mediumdiaminoben zidinphosphate buffered salinerevolutions per miniutedithizonepancreas duod

4、enum homeobox-1Cytokeratin-1-中文全稱(chēng)間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)胰島素細(xì)胞胚胎干細(xì)胞成體干細(xì)胞胰腺干細(xì)胞胰島素依賴(lài)性（型）糖尿病非胰島素依賴(lài)型（型）糖尿病胎牛血清胰島素鐵硒傳遞蛋白角朊細(xì)胞生長(zhǎng)因子二甲基亞砜鏈脲菌素辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素牛血清白蛋白DMEM 培養(yǎng)液二氨基聯(lián)苯胺磷酸鹽緩沖液每分鐘轉(zhuǎn)速雙硫腙胰十二指腸同源因子-1細(xì)胞角蛋白第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文不同微環(huán)境對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為產(chǎn)胰島素細(xì)胞的影響碩 士 研 究 生：黃盛導(dǎo)師：竇科峰 教授宋振順 教授第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽外科，西安 710032中文摘要糖尿病是常見(jiàn)的慢性疾病，全世界患病率約 6?；颊叱Ｐ枰K身注射胰

5、島素治療，但胰島素注射療法對(duì)血糖的控制并不理想,無(wú)法阻止糖尿病腎病、冠心病、糖尿病眼病等并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。最近幾年胰島移植的成功表明了通過(guò)補(bǔ)充缺乏的細(xì)胞可以治愈糖尿病。但供體來(lái)源缺乏和移植排斥阻礙了胰島細(xì)胞移植的廣泛應(yīng)用。干細(xì)胞作為一類(lèi)具有極強(qiáng)自我更新及多向分化潛能的細(xì)胞，已經(jīng)逐漸成為人們尋找胰島細(xì)胞替代物的新的細(xì)胞資源。由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有多向分化和很強(qiáng)的增殖能力，具有用于細(xì)胞治療的巨大潛能。它們可以分化為神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和產(chǎn)胰島素細(xì)胞等。但是由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的產(chǎn)胰島素細(xì)胞（IPCs），其胰島素分泌量不足正常胰腺細(xì)

6、胞的1。如何促進(jìn)MSCs分化為較成熟的IPCs成為亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。目前認(rèn)為其分化機(jī)制，主要是微環(huán)境因素通過(guò)一定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路傳遞，轉(zhuǎn)錄因子抑制或激活，啟動(dòng)關(guān)鍵基因表達(dá)的結(jié)果。-2-第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文本研究的目標(biāo)是：探索不同微環(huán)境下對(duì)大鼠 MSCs 體外分化為 IPCs 的影響，在糖尿病大鼠體內(nèi)微環(huán)境下 MSCs 是否還可以分化為 IPCs，為糖尿病細(xì)胞替代治療提供理想的種子細(xì)胞。大鼠 MSCs 的體外分離培養(yǎng)和生物學(xué)特征：利用貼壁法分離純化大鼠MSCs，傳代培養(yǎng)于含 10胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液中；通過(guò)倒置顯微鏡、電鏡、免疫細(xì)胞化學(xué)分析大鼠 MSCs 的生物學(xué)特征。結(jié)果顯示原代和

7、傳代培養(yǎng)MSCs 均保持較強(qiáng)的增殖能力，形態(tài)為均一的成纖維樣細(xì)胞。超微結(jié)構(gòu)顯示了干細(xì)胞的幼稚特征，免疫細(xì)胞化學(xué)顯示 CD34 陰性，CD44 陽(yáng)性。結(jié)論：采用我們的方法，可以獲得生長(zhǎng)穩(wěn)定，擴(kuò)增較快和純度較高的 MSCs。不同微環(huán)境對(duì)大鼠MSCs體外分化為IPCs的影響：采用第三代MSCs,用不同的微環(huán)境進(jìn)行誘導(dǎo)，對(duì)照組誘導(dǎo)劑為含有角朊細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素鐵硒傳遞蛋白（ITS）、尼克酰胺的無(wú)血清DMEM/F12 培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)組在對(duì)照組基礎(chǔ)上添加胰腺條件培養(yǎng)液；對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行光、電鏡觀察，雙硫腙和免疫細(xì)胞化學(xué)等進(jìn)行鑒定,并行體外葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn),測(cè)定細(xì)胞分泌胰島素及C-肽功能。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)

8、照組均可誘導(dǎo)分化為IPCs，但實(shí)驗(yàn)組分化而成的IPCs在數(shù)量及功能上均好于對(duì)照組。結(jié)論：大鼠胰腺提取物模擬的微環(huán)境能促進(jìn)大鼠MSCs體外誘導(dǎo)分化為較高質(zhì)量的IPCs。在糖尿病大鼠體內(nèi)微環(huán)境下MSCs分化為IPCs的潛能：通過(guò)腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)健康SD大鼠建立糖尿病模型；將MSCs及由MSCs誘導(dǎo)分化來(lái)的IPCs注射到糖尿病模型大鼠的腎包膜下，檢測(cè)移植前后血糖、體重、尿量、生存時(shí)間變化，當(dāng)移植大鼠血糖開(kāi)始下降后，行荷移植物腎切除術(shù)去除移植物，繼續(xù)觀察血糖變化，看是否有血糖反跳，以評(píng)價(jià)其治療糖尿病的效果，結(jié)合標(biāo)本免疫組織化學(xué)染色，觀察移植入的MSCs在糖尿病大鼠體內(nèi)是否分化為IPCs

9、。結(jié)果：將MSCs及IPCs移植到大鼠腎包膜下后，大鼠的血糖水平下降，糖尿病癥狀得到控制，生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。免疫組化顯示移植入的MSCs分化為胰島素染色陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)論：在糖尿病大鼠體內(nèi)微環(huán)境下MSCs可以分-3-第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文化為IPCs。綜上所述，大鼠 MSCs 在不同的體外及體內(nèi)微環(huán)境下均可特異誘導(dǎo)分化為 IPCs,而大鼠胰腺提取物模擬的微環(huán)境能促進(jìn)大鼠 MSCs 體外誘導(dǎo)分化為IPCs；將大鼠 MSCs 和 IPCs 移植入糖尿病大鼠模型體內(nèi)能夠明顯改善糖尿病癥狀，延長(zhǎng)其生存時(shí)間。雖然骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在安全而有效地運(yùn)用于臨床治療之前還有許多基本的問(wèn)題有待解決，但它為我們解決移植

10、治療糖尿病中供體缺乏問(wèn)題方面提供了一條新的途經(jīng)。關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，產(chǎn)胰島素細(xì)胞，糖尿病，微環(huán)境，移植。-4-第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文The Impact of Different Microenvironments on the Rat Bone MarrowMesenchymal Stem Cells differentiating into Insulin-producing CellsCandidate for master: Huang ShengSupervisor: Prof.Dou Kefeng，Prof.Song ZhenshunDepartment of Hepato

11、biliary Surgery, Xi Jing hospital, Fourth Military MedicalUniversity,Xian710032, ChinaAbstractDiabetes mellitus is a devastating chronic disease and over 6% of thepopulation is affected worldwide. The diabetic are necessary to inject insulin intheir lifetime, but it is not ideal to inject insulin si

12、nce insulin can't prevent thedevelopment of diseases derived form diabetes, such as kidney diseases, coronaryheart disease, eye diseases,etc. The success achieved over last few years with islettransplantation suggests that diabetes can be cured by the replenishment ofdeficient cells. However, th

13、e lack of donor organs and transplant rejectionhinder the application of pancreatic islet transplantation.Stem cells ,which have the capacity for both self-renewal and multilineagedifferentiation into any type of cell, becoming the new source of islet cellreplacement. Bone marrow mesenchymal stem ce

14、lls(MSCs) have great ability ofmulti-directional differentiation and reproductive activity that make thempotentially useful for cell therapy. A number of protocols have been described toinduce MSCs to neuronal cells,adipocytes,smooth muscle myocytes,skeletalmuscle myocytes,cartilage cells and insuli

15、n-producing cells(IPCs).The IPCs-5-第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文induced from MSCs can secrete insulin,but their secretory volume was less than1% that of a normal cells. How to promote MSCs differentiating into IPCsbecome the critical issue should be solved. The recent study have shown that thedifferentiation mechani

16、sm is the result of key gene expression through a definitesignal transmitting passway and inhibition or activation of transcription factorinduced by microenviroment factorsIn this study，we try to explore the impact of different microenvironmenton differentiating rat bone marrow MSCs into IPCs in vit

17、ro,then to study thecapacity of MSCs differentiating into IPCs in diabetic rats microenviroment invivo,and to provide suitable “seed” cells for replacement therapy of diabetesmellitus.Isolation, cultivation and biological features of rat MSCs in vitro：MSCs were isolated from rat bone marrow，purified

18、 by their adhesive processonto the culture dish，serial subcultivated on dulbeccos modified eagle mediumwith 10% fetal bovine serum ； The changes of cell morphology and theultrastructure were observed, cell surface markers CD34、CD44 were detected byimmunocytochemistry. The results show both primary a

19、nd passage MSCs havemaintained highly proliferative capacity.They have homogeneous fibrocyte-likeshap under light microscope. The ultrastructure showed the young cell nature ofstem cell. The cells were negative for CD34, while positive for CD44 byimmunocytochemistry staining.Conclusion: MSCs can be

20、cultured stably、expanded quickly and have higher purity with our method.The Impact of different microenvironments on the differentiating ratMSCs into IPCs: Third descended MSCs cells were then cultivated in vitromimicking different microenvironments，in which control group was cultivated inserum free

21、 DMEM/F12 medium including keratinocyte growth factor(KGF)、ITSand Nicotinamide, while experimental group was cultivated in serum free-6-第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文DMEM/F12 medium in which the rat pancreatic extract was added. During thecultivation period the cells were taken for light and electron microscopy atdif

22、ferent time points, identified by dithizone(DTZ) and immunocytochemistry.The glucose stimulation test was performed in vitro and the levels of insulin andC-peptide in response to the different glucose concentration was assayed. Theresults show MSCs could differentiat into IPCs both in the control gr

23、oup and theexperimental group. The IPCs harvested from experiment group had greaternumber and better function than that from control group . Conclusion :Themicroenvironment in which the rat pancreatic extract added could promote the ratbone marrow MSCs to differentiate into better IPCs in vitro。The

24、capacity of MSCs differentiating into IPCs in diabetic ratsmicroenviroment in vivo： The rat MSCs and IPCs induced from MSCs weretransplanted under the renal capsule of STZ induced SD rat. Blood glucose levels,weight, urine and survival rate were monitored. when rats blood glucose levelsbegin to desc

25、end，grafts were then removed by unilateral nephrectomy. The bloodglucoses level was monitored to investgate whether euglycemia reversalhappenned, and we have immunohistochemistry staining to observe wheretherthe MSCs of transplanted could differentiate into IPCs. The result show MSCsand IPCs by inje

26、ction into the renal capsule of STZ induced diabetic SD rat coulddecreaseitsbloodglucoselevelandprolongedsurvivaltime.Immunohistochemistry also confirmed that the MSCs of transplanted werestrongly positive for insulin. Conclusion: MSCs can differentiating into IPCs indiabetic rats microenviroment in

27、 vivo.In summary, the present study provides evidence that rat MSCs have thecapacity to differentiate into IPCs under different microenvironments both invitro and in vivo. The microenvironment in which the rat pancreatic extract addedcould promote the rat bone marrow MSCs to differentiate into bette

28、r IPCs in vitro.-7-第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文MSCs and IPCs transplanted into the renal capsule of STZ induced diabetic SDrats could decrease their blood glucose level and prolong their survival time.Obviously, there are still a number of fundamental questions about MSCs need tobe answered before they can be safel

29、y and effectively used in clinical setting, butit provides us a new solution to deal with the shortage of beta cells for therapy oftype 1 diabetes.Key words：Mesenchymal stem cells；Insulin-producing cells；Microenvironment；Diabetes；transplant-8-第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文前言糖尿病是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和生命的常見(jiàn)內(nèi)分泌代謝性疾病，近年來(lái)其患病率在全球呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)

30、的趨勢(shì)，在大多數(shù)國(guó)家已成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大疾病。目前幾乎所有I型糖尿病和部分II型糖尿病患者都需要長(zhǎng)期注射胰島素治療，常規(guī)治療方案發(fā)生全身血管并發(fā)癥的危險(xiǎn)性較高，而強(qiáng)化治療方案雖可使糖尿病并發(fā)癥的危險(xiǎn)性降低，但卻不能完全避免其發(fā)生，且容易出現(xiàn)低血糖反應(yīng)甚至昏迷而危及生命1,2。胰島移植為糖尿病人帶來(lái)了曙光，理論上胰島移植成功后不但能有效的控制血糖，而且可以恢復(fù)胰島正常的生理功能，維持糖代謝內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，從根本上提高型糖尿病患者3效果，主要原因在于每個(gè)受者需要 2 個(gè)以上的供體，而供體數(shù)量又極其有限胰島移植物的質(zhì)量和數(shù)量難于控制移植物免疫排斥反應(yīng)胰島移植并不能延緩自身免疫反應(yīng)的進(jìn)展。

31、如何解決這些問(wèn)題，尤其是移植物短缺問(wèn)題，成為提高胰島移植，甚至細(xì)胞移植成功率的關(guān)鍵。隨著干細(xì)胞研究的不斷深入，定向誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為產(chǎn)胰島素細(xì)胞甚至胰島成為近年研究的熱點(diǎn)。干細(xì)胞是具有自我更新和多潛能分化能力的細(xì)胞。干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞分化潛能較高,其誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞可能性很大。但胚胎干細(xì)胞的來(lái)源受倫理的限制,且有成瘤性的危險(xiǎn)。成體干細(xì)胞在來(lái)源和克服免疫排斥上有一定優(yōu)勢(shì)。但因?yàn)楦杉?xì)胞只占胰腺的很少部分,來(lái)源有限，自我更新、不斷增殖的能力有限,誘導(dǎo)分化得到的細(xì)胞分泌胰島素的量很少,目前還難以成為細(xì)胞治療的種子細(xì)胞。由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）取材容易，增殖能力強(qiáng)

32、，具有多向分化潛能，且免疫原性弱，移植后不致瘤性，可作為細(xì)胞替代治療、組織工程和基因工程的理想的種子細(xì)胞。近來(lái)MSCs誘導(dǎo)分化胰島樣細(xì)胞并治療糖尿病的研究已經(jīng)取得了一些成就。-9-的生活質(zhì)量 。但是經(jīng)過(guò)多年的臨床應(yīng)用，胰島移植并沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的治療第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文4細(xì)胞。Ianus等5通過(guò)將骨髓來(lái)源的干細(xì)胞移植到受體鼠內(nèi),能分化成具有胰腺細(xì)胞表型的細(xì)胞。能表達(dá)胰島細(xì)胞標(biāo)志，并對(duì)高血糖產(chǎn)生反應(yīng),分泌胰島素，但是其體外分化為胰島效率低，胰島素分泌量低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足移植治療糖尿病的需要是不爭(zhēng)的事實(shí)。如何提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的能力成為近來(lái)研究重點(diǎn)。在干細(xì)胞分化中有一重要學(xué)

33、說(shuō)：微環(huán)境誘導(dǎo)分化學(xué)說(shuō)，認(rèn)為指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子及啟動(dòng)基因表達(dá)的信號(hào)可能存住于干細(xì)胞生存的微環(huán)境，即“干細(xì)胞龕”中。在微環(huán)境中，間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)與其他細(xì)胞、細(xì)胞基質(zhì)及各種細(xì)胞因子、激素的相互作用，引起調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞分化的某些關(guān)鍵基因表達(dá)，決定分化的方向6。Choi 等證實(shí)在行部分胰腺切除術(shù)后,新生的胰腺組織可能含有某些因子和激素能有助于MSCs向IPCs分7本研究制備大鼠的胰腺組織提取物模擬MSCs分化的體內(nèi)微環(huán)境，觀察其是否能促進(jìn)MSCs在體外誘導(dǎo)分化為IPCs，用雙硫腙染色陽(yáng)性細(xì)胞率進(jìn)行比較,用高糖刺激試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)分化所得IPCs分泌胰島素的功能;并將MSCs及誘導(dǎo)分化來(lái)的IPCs移植入糖尿病大鼠

34、體內(nèi)下,觀察其在體內(nèi)微環(huán)境下能否控制糖尿病模型大鼠血糖。從而建立一種較好的誘導(dǎo)方案及微環(huán)境，能體外誘導(dǎo)MSCs分化為IPCs；并探討MSCs在體內(nèi)微環(huán)境下對(duì)血糖控制的功能及機(jī)制，為克服胰島移植的供體短缺提供新的胰島來(lái)源，為干細(xì)胞治療糖尿病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的解決途徑。-10-2003年 Hess ，研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外能橫向分化為產(chǎn)生胰島素的化 。第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文文獻(xiàn)回顧第一部分干細(xì)胞治療糖尿病研究進(jìn)展胰島細(xì)胞移植是目前治療I型糖尿病的一個(gè)熱點(diǎn)，但是胰島細(xì)胞來(lái)源的匱乏和存在免疫排斥反應(yīng)阻礙了這種方法的廣泛應(yīng)用，尋找胰島細(xì)胞新來(lái)源已成為全球糖尿病研究的熱點(diǎn)之一。干細(xì)胞具有自我更新和

35、定向分化的特征使干細(xì)胞治療糖尿病成為近年來(lái)研究的一個(gè)主要方向。1、糖尿病( Diabetes mellitus ,DM)糖尿病是一種以持續(xù)性高血糖為特征的全身性?xún)?nèi)分泌代謝疾病，細(xì)胞是產(chǎn)生胰島素并使體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)保持平衡，糖尿病患者無(wú)法產(chǎn)生適量的胰島素滿足機(jī)體的需要或機(jī)體不能正常利用胰島素，從而引起糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致血糖水平升高、進(jìn)而誘發(fā)心腦血管疾病和腎功能衰竭的發(fā)生。世界衛(wèi)生組織估計(jì)到2025年全球糖尿病患者將超過(guò)3億。1.1 分型1997 年美國(guó)提出將原發(fā)性 DM 分為兩型的方案，即將易發(fā)生酸中毒、胰島素絕對(duì)缺失、必須依賴(lài)外源性胰島素延續(xù)生命者歸為型（Insulindepende

36、nt diabetes mellitus，IDDM）;不依賴(lài)外源胰島素延續(xù)生命者歸為型(Non-insulin dependent diabetes mellitus，NIDDM)。臨床上診斷 DM以型為多數(shù) 。1.2 病因IDDM：屬器官特異性自身免疫性疾病，即其免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤地把胰臟中產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞當(dāng)作外來(lái)入侵者而加以破壞。其發(fā)病原因尚不清楚，其中遺傳、自身抗體、病毒、營(yíng)養(yǎng)等因素與其發(fā)病有關(guān)，它們使單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-1（IL-1）和腫瘤壞死因子-（TNF-），從而介導(dǎo)細(xì)胞壞死，導(dǎo)致胰島細(xì)胞破壞，免疫功能異常。循環(huán)中的各種自身免疫抗體（如-11-第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文ICA、I

37、AA、GAD 等）可作為 IDDM 的免疫學(xué)標(biāo)志。同時(shí)細(xì)胞的破壞產(chǎn)生自身抗原及淋巴侵潤(rùn)，刺激特異性自身免疫反應(yīng)，使胰島細(xì)胞進(jìn)一步破壞，胰島素合成與釋放減少，最終導(dǎo)致 IDDM。所有的型糖尿病的患者需要每天注射胰島素進(jìn)行治療。應(yīng)用多次小劑量的鏈脲霉素（Streptozotocin,STZ）8NIDDM：美國(guó)糖尿病聯(lián)合會(huì)認(rèn)為型糖尿病是最常見(jiàn)的糖尿病，它包括單基因型的青年人發(fā)作型糖尿?。∕aturity Onset Diabetes of Youth, MODY）9其發(fā)病與基因和非基因因素相關(guān)，遺傳和環(huán)境因素在 NIDDM 的發(fā)生中均有重要作用10。其發(fā)病率隨年齡的增加而增加，通常與胰島素抵抗、胰島

38、素相對(duì)或絕對(duì)不足相關(guān)，病人的存活通常不需要胰島素的治療。NIDDM治療方法為口服降糖藥，增加內(nèi)源性胰島素的分泌，降低胰島素抵抗，或通過(guò)延緩各種碳水化合物的吸收，降低外周血糖。NIDDM 的中、長(zhǎng)期血糖控制需要口服降糖藥漸進(jìn)性的聯(lián)合治療，20-30%的型糖尿病患者在口服高血糖抑制劑無(wú)效后，也需要胰島素控制高血糖，采用口服降糖藥和胰島素的聯(lián)合治療。1.3 治療糖尿病是世界范圍最常見(jiàn)的流行性疾病之一，其死亡率僅次于心血管疾病，惡性腫瘤。該病是由于胰島素在體內(nèi)的絕對(duì)或相對(duì)不足而引起的糖，脂肪及蛋白質(zhì)代謝紊亂的疾病。目前型糖尿病常規(guī)治療方法是應(yīng)用外源性胰島素注射控制血糖。但常規(guī)治療方案發(fā)生全身血管并發(fā)癥

39、的危險(xiǎn)性較高，而強(qiáng)化治療方案雖可使糖尿病并發(fā)癥的危險(xiǎn)性降低，但卻不能完全避免其發(fā)生，且容易出現(xiàn)低血糖反應(yīng)甚至昏迷而危及生命，而且患者難免遭受注射所帶來(lái)的不便和痛苦。細(xì)胞替代治療法（即補(bǔ)充細(xì)胞或產(chǎn)胰島素細(xì)胞，如胰島移植）較目前臨床常用的胰島素治療有一定的優(yōu)勢(shì)。迄今為止最成功的胰3格蘭醫(yī)學(xué)雜志上報(bào)告應(yīng)用一套被稱(chēng)為“Edmonton方案”的胰島移植方法，對(duì)-12-制作的型糖尿病模型能夠證實(shí)細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的主要機(jī)制 。和多基因型代謝紊亂（典型的 NIDDM）等表型 。NIDDM 屬一種異質(zhì)性紊亂，島移植的臨床報(bào)告來(lái)自于加拿大Edmonton中心 ，該中心在2000年7月的新英第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論

40、文連續(xù)7 例有嚴(yán)重低血糖史及代謝不穩(wěn)定史的型糖尿病患者進(jìn)行胰島移植，同時(shí)進(jìn)行無(wú)糖皮質(zhì)類(lèi)固醇的免疫抑制治療。分離胰島的方法為經(jīng)導(dǎo)管用純化的冷膠原酶灌注并消化,在無(wú)異種蛋白的介質(zhì)中純化,然后用經(jīng)肝門(mén)脈穿刺注射法立即移植。移植后7 名患者均實(shí)現(xiàn)了胰島素自給，未再發(fā)生低血糖昏迷,在隨訪過(guò)程中患者的血脂水平無(wú)顯著升高。至今全球超過(guò)50個(gè)中心重復(fù)Edmonton的治療方案治療了超過(guò)500個(gè)型糖尿病患者。但一些難以克服的困難限制了這種方法的推廣:（1）免疫排斥問(wèn)題，異體胰島移植后患者需要終身使用免疫抑制劑，而長(zhǎng)期使用免疫抑制劑將有可能對(duì)其機(jī)體造成極大危害;（2）供體數(shù)量不足，根據(jù)“埃德蒙頓方案”，每個(gè)糖尿病

41、患者胰島移植治療至少需要2個(gè)供體胰腺，而事實(shí)上根據(jù)器官共享聯(lián)合網(wǎng)的報(bào)告11，美國(guó)每年能夠獲得的尸體胰腺不超過(guò)6000個(gè)，而根據(jù)青少年糖尿病基金會(huì)估計(jì)，其每年被診斷為型糖尿病的新病例就多達(dá)30000例,因此在美國(guó)胰島移植如今僅限應(yīng)用于少數(shù)嚴(yán)重低血糖史及代謝不穩(wěn)定型的I型糖尿病患者；（3）療效不持久：據(jù)國(guó)際胰島移植中心登記，截至到2000年，胰島移植一年以后僅8.2患者無(wú)需再使用胰島素12。一些替代胰島移植的方法包括異種胰島移植、異體胰腺移植、可分泌胰島素細(xì)胞株的建立等方法曾先后出現(xiàn)。從異種動(dòng)物的體內(nèi)獲得可供移植的器官和組織也是目前使用的一種方法。豬被認(rèn)為是最理想的器官來(lái)源，因?yàn)樨i的器官大小、結(jié)構(gòu)

42、與人類(lèi)的非常相似。近來(lái)豬胰島異種移植已獲成功并有望用于臨床13。但異種移植的一個(gè)潛在危險(xiǎn)是接受移植的病人可能會(huì)感染上豬體內(nèi)的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，從而傳播危害人類(lèi)健康的種屬交叉疾病14。異種移植的另一個(gè)巨大障礙是其免疫排斥反應(yīng)遠(yuǎn)比同種異體移植物要大的多，這往往導(dǎo)致移植入的胰島細(xì)胞在數(shù)日內(nèi)喪失功能。異體胰腺移植是一技術(shù)較復(fù)雜的大手術(shù)，術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率高15。利用內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞或特殊胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞可以建立起分泌胰島素的細(xì)胞株，Knaack報(bào)道胰島素瘤細(xì)胞TC6-F7可以連續(xù)傳代55代以上，超過(guò)一年仍正常分泌胰島素16；取自高胰島素低血糖-13-第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文綜合征患者的細(xì)胞株NISK9，轉(zhuǎn)染

43、相應(yīng)的缺陷基因后能正常分泌胰島素，但是這些細(xì)胞株表型不穩(wěn)定，易喪失分泌胰島素的功能。因此尋找胰島細(xì)胞的新來(lái)源己成為關(guān)注的焦點(diǎn)。因干細(xì)胞具有自我更新和定向分化的特性而成為解決細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題的研究熱點(diǎn)，人們?cè)噲D探索用多種方法通過(guò)細(xì)胞的遺傳工程或通過(guò)利用各種潛在的細(xì)胞前體細(xì)胞干細(xì)胞在體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化為胰島素細(xì)胞。近年來(lái)關(guān)于嚙齒類(lèi)動(dòng)物和人類(lèi)起源的各類(lèi)干細(xì)胞治療糖尿病的研究已經(jīng)得到了可喜的成績(jī)。2、干細(xì)胞研究概述干細(xì)胞是個(gè)體發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生的具有無(wú)限或較長(zhǎng)時(shí)間自我更新和多向分化能力的一類(lèi)細(xì)胞。干細(xì)胞有以下特點(diǎn)：（1）干細(xì)胞本身不是終末分化細(xì)胞（即干細(xì)胞不是處于分化途徑的終端）；（2）干細(xì)胞能無(wú)限增殖分裂；（3）干細(xì)胞可持續(xù)分裂幾代，也可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)；（4）干細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞只能在兩種途徑中選擇其一，或保持親代特征，仍作為干細(xì)胞；或不可逆的向終末分化。根據(jù)分化潛能的大小，干細(xì)胞基本上可以分為三種類(lèi)型。（1）全能性干細(xì)胞（Totipo