臨床微生物檢驗在感染診治方法中作用

1、臨床微生物檢驗在感染診治方法中作用234Click to edit Master title styleClick to edit Master subtitle style主要議題：微生物室的概況耐藥監(jiān)測，幫助醫(yī)生經(jīng)驗選藥規(guī)范標本采集及常見標本類型的案例分享臨床與微生物檢驗中常見問題的討論6內(nèi)容提要內(nèi)容提要一.微生物室的概況實驗室面積：70+m2 （標本接收室、接種室、儀器操作間、培養(yǎng)基制備間、資料庫房）人員：共3人，1-2人/天主要儀器設(shè)備：德靈 Microscan Walk/Away-40全自動微生物鑒定和藥敏試驗分析系統(tǒng)BD公司BACTEC 9120 全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)ATB半自動細菌鑒

2、定和藥敏分析系統(tǒng)（ATB-STREP 5、ATB-HAEMO）78一.微生物室的概況現(xiàn)今的微生物實驗室大體分為三大部分：傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)（涂片、培養(yǎng)、鑒定和藥敏）非傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)（免疫學(xué)方法）分子生物學(xué)檢測技術(shù)（基因測序、耐藥基因檢測等） 9一.微生物室的概況基于涂片染色+鏡檢的微生物檢查是微生物檢驗中古老但非常有效非常有效的方法。 顯微鏡鏡檢不僅可以迅速了解標本中有無病原體，而且可根據(jù)其形態(tài)和著色性進行初步分類，為臨床經(jīng)驗用藥臨床經(jīng)驗用藥提供依據(jù)。涂片檢查結(jié)果對臨床早期診斷和治療早期診斷和治療有十分重要的意義。n 培養(yǎng)培養(yǎng)根據(jù)標本的種類和培養(yǎng)目的來選擇不同的培養(yǎng)方法，如常規(guī)CO2培養(yǎng)，

3、尿液定量培養(yǎng)方法，多重耐藥菌需選擇性培養(yǎng)基，以及厭氧培養(yǎng)等。n 涂片涂片n 流行病學(xué)資料流行病學(xué)資料指導(dǎo)本院的臨床用藥預(yù)測耐藥發(fā)展趨勢有目的的科研方向經(jīng)驗診斷中的經(jīng)驗診斷中的依據(jù)依據(jù)一.微生物室的概況直接鏡檢法和培養(yǎng)檢查法是形態(tài)學(xué)檢查的基本方法，我們不應(yīng)該輕視形態(tài)學(xué)，特別是直接鏡檢法和培養(yǎng)檢查法是形態(tài)學(xué)檢查的基本方法，我們不應(yīng)該輕視形態(tài)學(xué)，特別是“鏡鏡檢檢”、而片面的去追求一些尚不成熟的、而片面的去追求一些尚不成熟的“新技術(shù)新技術(shù)”。11一.微生物室的概況強調(diào)一下，鏡檢及培養(yǎng)的重要臨床意義：強調(diào)一下，鏡檢及培養(yǎng)的重要臨床意義：直接鏡檢簡單、快速、實用直接鏡檢簡單、快速、實用1.評價送檢標本質(zhì)量

4、評價送檢標本質(zhì)量2.對臨床快診快報對臨床快診快報3.評價培養(yǎng)質(zhì)量評價培養(yǎng)質(zhì)量4.對培養(yǎng)物鑒定藥敏有導(dǎo)航的作用對培養(yǎng)物鑒定藥敏有導(dǎo)航的作用5.簡單、常規(guī)的工作卻需要經(jīng)驗的積累和責任心簡單、常規(guī)的工作卻需要經(jīng)驗的積累和責任心.6.但陽性率較低，陰性結(jié)果不能排除診斷但陽性率較低，陰性結(jié)果不能排除診斷12一.微生物室的概況鏡檢及培養(yǎng)的重要臨床意義：鏡檢及培養(yǎng)的重要臨床意義：培養(yǎng)作為直接涂片的后續(xù)步驟，其目的是為了：培養(yǎng)作為直接涂片的后續(xù)步驟，其目的是為了： 進一步提高對病原體檢出的陽性率進一步提高對病原體檢出的陽性率驗證直接鏡檢的結(jié)果驗證直接鏡檢的結(jié)果同時確定致病菌的種類同時確定致病菌的種類1.1.

5、但所需時間較長但所需時間較長必須強調(diào)直接鏡檢與培養(yǎng)檢查相結(jié)合的重要性！13必須強調(diào)直接鏡檢與培養(yǎng)檢查相結(jié)合的重要性！涂片和培養(yǎng)二者相輔相成缺一不可！涂片和培養(yǎng)二者相輔相成缺一不可！14內(nèi)容提要內(nèi)容提要主要議題：微生物室的概況耐藥監(jiān)測，幫助醫(yī)生經(jīng)驗選藥規(guī)范標本采集及常見標本類型的案例分享臨床與微生物檢驗中常見問題的討論病原譜抗菌藥物選擇的決定性因素之一15社區(qū)獲得性感染常見類型lCAPlAECOPDlUTIl皮膚軟組織感染醫(yī)院感染常見類型l HAPl BSIl CAUTIl SSI(含腹腔感染、術(shù)后腦膜炎)醫(yī)生需要什么樣的病原譜信息呢？16這樣的信息對臨床治療決策有意義嗎？這樣的信息對臨床治療決

6、策有意義嗎？針對性病原譜信息對臨床決策有價值17MRSA（耐甲氧西林的金葡）占金葡中87.8%抗菌藥物敏感性監(jiān)測數(shù)據(jù)現(xiàn)有大量的抗菌藥物敏感性監(jiān)測數(shù)據(jù)國家層面：CHINET、全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)（CARSS）地區(qū)層面：多家醫(yī)院數(shù)據(jù)匯總醫(yī)院層面：微生物提供的全院數(shù)據(jù)科室層面：微生物提供的重點科室（如ICU、感染科、呼吸科）的分科室數(shù)據(jù)18目前抗菌藥物敏感性監(jiān)測數(shù)據(jù)的利與弊利：有助于制定抗菌藥物管理政策（如限制某些藥物使用）有助于確定感控中監(jiān)測的目標菌（如CRE、VRE）弊菌株的臨床意義不明（可能是感染、定植和污染）質(zhì)控較差（含有大量痰、分泌物等低質(zhì)量的標本）未能按感染類型分類使用抗菌藥物后耐藥菌易分

7、離19目前的敏感性監(jiān)測數(shù)據(jù)對個體治療決策的幫助小，臨床需要的不是大而全的監(jiān)測數(shù)據(jù)，而是結(jié)果疾病譜的耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)：20社區(qū)獲得性感染：地區(qū)數(shù)據(jù)lCAPlAECOPDlUTIl皮膚軟組織感染醫(yī)院感染：本院數(shù)據(jù)l HAPl BSIl CAUTIl SSI(含腹腔感染、術(shù)后腦膜炎)21內(nèi)容提要內(nèi)容提要主要議題：微生物室的概況耐藥監(jiān)測，幫助醫(yī)生經(jīng)驗選藥規(guī)范標本采集及常見標本類型的案例分享臨床與微生物檢驗中常見問題的討論規(guī)范微生物標本采集規(guī)范微生物標本采集22微生物檢查的標本收集原則無菌采集無菌采集無菌容器無菌容器及時足量及時足量迅速送檢迅速送檢23及時運送苛養(yǎng)菌中除卡他莫拉菌外，流感嗜血桿菌和肺炎鏈球

8、菌對干燥、寒冷的抵抗力均較弱，在標本離開機體后其存活率十分低。對環(huán)境抵抗強的細菌（銅綠假單胞及其他G陰性菌、葡萄球菌、念珠菌等）2-4h繁殖數(shù)代，影響定量結(jié)果。24送檢標本種類與臨床意義l臨床意義較低的標本： 痰、咽拭子（HI、SP、A鏈、溶血隱秘桿菌除外） 糞便、肛拭子（致腹瀉病原菌和艱難梭菌CD）l臨床意義中等的標本： 尿 膿液、傷口分泌物l臨床意義較大的標本： 血、CSF、胸腹水、及其他無菌體液25常見標本類型的案例分享常見標本類型的案例分享26常見標本類型的案例分享CASE1：2015/11/25 2015/11/25 病人：男性病人：男性 感染科感染科-082-082床床 肺吸蟲病肺

9、吸蟲病 標本：痰標本：痰 . .CD4TCD4T淋巴細胞：淋巴細胞：1/ul1/ulESRESR：78mm78mmCRPCRP：107mg/L107mg/LPCTPCT：0.88ug/L0.88ug/L2728在合格的痰標本里發(fā)現(xiàn)在合格的痰標本里發(fā)現(xiàn)“有隔菌絲有隔菌絲”，是比較有臨床意義的！于是把，是比較有臨床意義的！于是把痰標本接種了痰標本接種了SDASDA、血平板。、血平板。2 2天后血平板優(yōu)勢生長出了絲狀真菌。天后血平板優(yōu)勢生長出了絲狀真菌。292 2天的血平板棉蘭染色，顯微鏡觀察如下圖：天的血平板棉蘭染色，顯微鏡觀察如下圖：因鏡下形態(tài)曲霉特因鏡下形態(tài)曲霉特征明顯，但單純靠征明顯，但單純

10、靠血平板和目前所觀血平板和目前所觀察到的鏡下形態(tài)難察到的鏡下形態(tài)難以鑒定為啥曲霉？以鑒定為啥曲霉？隨后進行了隨后進行了PDA的的轉(zhuǎn)種。轉(zhuǎn)種。30PDAPDA平板四天時的菌落和鏡下形態(tài)如下圖：平板四天時的菌落和鏡下形態(tài)如下圖：根據(jù)菌落和鏡下特點，傾向于土曲霉，但菌落顏色因時間的關(guān)系，仍不夠典型，續(xù)孵。根據(jù)菌落和鏡下特點，傾向于土曲霉，但菌落顏色因時間的關(guān)系，仍不夠典型，續(xù)孵。31PDAPDA平板六天時的菌落形態(tài)如下圖：平板六天時的菌落形態(tài)如下圖：典型的泥土色菌落出現(xiàn)，典型的泥土色菌落出現(xiàn)，確定為確定為“土曲霉菌土曲霉菌”。CASE2：腎病科 藥物毒性反應(yīng) 男 編號：1779和1780 連續(xù)兩次抗

11、酸染色3210%NAOH10%NAOH消化痰液后低速離心鏡檢消化痰液后低速離心鏡檢3310%NAOH10%NAOH消化痰液后低速離心鏡檢消化痰液后低速離心鏡檢鏡下發(fā)現(xiàn)的菌絲進行革蘭染色鏡下發(fā)現(xiàn)的菌絲進行革蘭染色 如上圖如上圖把兩個標本都進行了真菌培養(yǎng)，接種了血平板。把兩個標本都進行了真菌培養(yǎng)，接種了血平板。血平板培養(yǎng)48h后，菌落如下：從平板中可以看出兩者是幾乎是一樣的絲狀真菌生長，于是都分別轉(zhuǎn)種了SDA平板。341779 48h35轉(zhuǎn)種SDA后4d的生長情況1779 號號1780 號號361779 號號當即做了棉蘭染色，如上圖當即做了棉蘭染色，如上圖煙曲霉菌煙曲霉菌簡單、常規(guī)的工作卻需要經(jīng)驗

12、的積累和責任心簡單、常規(guī)的工作卻需要經(jīng)驗的積累和責任心.3738曲霉菌屬曲霉是一類絲狀真菌，自然界中廣泛存在。?？梢栽倌嗤?、植物腐物、空氣中等處分離到。其引起的人類疾病可分為機會性感染、變態(tài)反應(yīng)性曲霉病及曲霉毒素中毒。免疫受損免疫受損是曲霉機會性感染最常見的原因。感染可以表現(xiàn)為局限性的曲霉球到嚴重的侵襲性感染侵襲性感染。39與侵襲性曲霉病發(fā)病相關(guān)的主要危險因素有：與侵襲性曲霉病發(fā)病相關(guān)的主要危險因素有：中性粒細胞及巨噬細胞數(shù)量減少或功能異常；骨髓造血干細胞及實體器官移植、腫瘤放化療、COPD、ICU機械通氣以及長期使用糖皮質(zhì)激素、細胞毒藥物等免疫功能受損的患者。檢驗結(jié)果的解釋：檢驗結(jié)果的解釋：

13、曲霉菌為條件致病菌，自然界糞便廣泛，某些菌可以成為實驗室污染菌。因此曲曲霉菌為條件致病菌，自然界糞便廣泛，某些菌可以成為實驗室污染菌。因此曲霉菌分離結(jié)果需要謹慎對待。結(jié)合鏡檢結(jié)果判斷培養(yǎng)得到的曲霉是否具有臨床意霉菌分離結(jié)果需要謹慎對待。結(jié)合鏡檢結(jié)果判斷培養(yǎng)得到的曲霉是否具有臨床意義，一般來說以下幾種形式被認為具有臨床意義：義，一般來說以下幾種形式被認為具有臨床意義：1.1.無菌部位或下呼吸道臨床標本中發(fā)現(xiàn)菌絲；無菌部位或下呼吸道臨床標本中發(fā)現(xiàn)菌絲；2.2.單一標本中為優(yōu)勢菌或者多次標本中分離得到同一菌株；單一標本中為優(yōu)勢菌或者多次標本中分離得到同一菌株；3.3.組織中發(fā)現(xiàn)菌絲。組織中發(fā)現(xiàn)菌絲。

14、注意：當懷疑肺部真菌感染的時候，最好連續(xù)培養(yǎng)三次痰標本。痰液中分注意：當懷疑肺部真菌感染的時候，最好連續(xù)培養(yǎng)三次痰標本。痰液中分離出的曲霉菌則應(yīng)結(jié)合直接鏡檢結(jié)果進行考慮，離出的曲霉菌則應(yīng)結(jié)合直接鏡檢結(jié)果進行考慮，涂片細胞學(xué)檢查為合格的涂片細胞學(xué)檢查為合格的痰標本，且初始分離培養(yǎng)基上呈優(yōu)勢生長可作為臨床診斷的依據(jù)。痰標本，且初始分離培養(yǎng)基上呈優(yōu)勢生長可作為臨床診斷的依據(jù)。41CASE 3 :2015.12.27 上午10點，患者:張某 “反復(fù)腰背疼痛半月，加重伴起臥困難3天”入院。入院前半月，患者無明顯誘因開始出現(xiàn)腰背部疼痛，間歇性疼痛，持續(xù)時間長短不一，休息后可緩解。既往康健，無不良個人史。輔

15、助檢查：MRI顯示腰4/5椎間盤突出，腰4椎體失穩(wěn)，腰椎側(cè)凸畸形。血常規(guī)：正常，ESR：31mm/h 27日下午14時，反復(fù)高熱，最高達39.7，送檢血培養(yǎng)血培養(yǎng)28日心內(nèi)科、感染科會診：發(fā)熱待診。感染性心內(nèi)膜炎可能性小，不排除血流感染，建議進一步檢查。29日彩超：雙側(cè)腋窩查見淋巴結(jié)（結(jié)構(gòu)異常）。血PCT：0.43ng/ml HS-CRP：39.18mg/L。30日，血液科會診，發(fā)熱待診，原因不明，轉(zhuǎn)入血液科，行骨髓穿刺送檢，結(jié)果正常。診斷陷入糾結(jié)，發(fā)熱原因何在？感染？非感染？診斷陷入糾結(jié)，發(fā)熱原因何在？感染？非感染？接收了血培養(yǎng)的微生物室呢？421.1下午發(fā)現(xiàn)儀器報陽（+）進行了常規(guī)涂片和轉(zhuǎn)

16、種，但涂片革蘭染色：未見細菌。1.2轉(zhuǎn)種平板未見明顯生長。思考？思考？1.血培養(yǎng)瓶4-5天報陽，假陽性？真陽性？2.革蘭染色未見細菌是真的無菌嗎？3.骨科病人，有骨骼和關(guān)節(jié)損傷可能。4.血平板24h未見明顯生長，是生長緩慢？還是真的也無菌生長？生長曲線43108.96h報陽，報陽，4.5d，明顯的倒，明顯的倒S行，符合真陽性表現(xiàn)。行，符合真陽性表現(xiàn)。報陽瓶再次涂片革蘭染色44查見可疑“細菌團”。45報陽瓶再次涂片瑞氏染色清晰可見“沙堆狀”紫色細菌團。再次轉(zhuǎn)種的普通巧克力平板46布魯氏菌屬觸酶：陽性氧化酶：陽性吲哚試驗：陰性有上述生化反應(yīng)特征且2h內(nèi)脲酶陽性的微生物應(yīng)被推定為布魯氏菌種!并應(yīng)立即

17、采取生物恐怖預(yù)防措施！布魯菌-人畜共患病原菌47布魯菌布魯菌容易感染豬、羊、牛等家畜，人類與病畜接觸或食用病畜肉、奶及奶制品而被感染。Brucellosis,布病布?。阂卜Q“波狀熱”“馬耳他熱”或“地中海池張熱”，是布魯菌引起的急性或慢性傳染病，屬于自然源性疾病，主要表現(xiàn)為：發(fā)熱、多汗、乏力、關(guān)節(jié)痛可逐漸轉(zhuǎn)為慢性，侵襲骨骼系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸道、胃腸道、心血管系統(tǒng)和皮膚。48內(nèi)容提要內(nèi)容提要主要議題：微生物室的概況耐藥監(jiān)測，幫助醫(yī)生經(jīng)驗選藥規(guī)范標本采集及常見標本類型的案例分享臨床與微生物檢驗中常見問題的討論一、涂片鏡檢結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果不吻合？1、涂片結(jié)果是報告所有檢見病原菌，而培養(yǎng)的目的是檢

18、出致病菌，因此會產(chǎn)生不一致的情況；2、一些苛養(yǎng)菌需要在特殊環(huán)境或培養(yǎng)基上生長，因此常規(guī)培養(yǎng)不一定能得到結(jié)果。臨床與微生物檢驗中常見問題的討論取的明顯是膿液標本，為何培養(yǎng)報告為無菌生長？1、常規(guī)培養(yǎng)為需氧培養(yǎng)，膿液可能來自厭氧菌感染；2、病原菌可能被大量的中性粒細胞吞噬。二、未破裂膿腫：消毒覆于膿腫表面的皮膚，用注射器將膿腫內(nèi)容物吸出，注射器針頭扎入無菌橡膠瓶蓋（青霉素小瓶橡膠塞）。-厭氧培養(yǎng)or需氧培養(yǎng)開放病灶和膿腫：不建議做厭氧培養(yǎng)；用無菌生理鹽水或70%酒精擦拭除去表面分泌物，盡量去除表面菌群，用拭子采集病灶底部或邊緣的標本，置于需氧培養(yǎng)基中。-需氧培養(yǎng)臨床與微生物檢驗中常見問題的討論三、

19、一般培養(yǎng)三天出結(jié)果，為何第四天還沒有結(jié)果？常規(guī)流程：將標本接種于不同的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，24h后觀察培養(yǎng)皿中生長情況，此時若無病原菌生長，繼續(xù)放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，若任無細菌生長則判定為陰性結(jié)果，因此常規(guī)培養(yǎng)報告時間為3天。第四天出報告：臨床與微生物檢驗中常見問題的討論四、今天的培養(yǎng)結(jié)果與前一天的不一樣？1、取材是否一致；2、痰標本，選擇優(yōu)勢菌做鑒定藥敏，就可能導(dǎo)致兩次結(jié)果不一致。痰標本中：銅綠、金葡腸桿菌（肺克）鮑曼痰中常見的定植菌或污染菌l念珠菌（如果沒有其他部位培養(yǎng)陽性）l嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌l凝固酶陰性葡萄球菌l弗勞地檸檬酸菌（枸櫞酸菌）和陰溝腸桿l腸球菌l木

20、糖氧化產(chǎn)堿桿菌臨床與微生物檢驗中常見問題的討論五、明顯是稀便，培養(yǎng)結(jié)果為何正常？大便培養(yǎng)，通常只能鑒定志賀菌、沙門菌感染，很少醫(yī)院常備致病性大腸桿菌鑒定血清，很少醫(yī)院能夠做艱難梭菌培養(yǎng)，很少醫(yī)院能常備霍亂弧菌血清。與國際微生物檢驗的差距-缺項1.艱難梭菌：醫(yī)院感染常見病原菌，一些發(fā)達國家中排名第一2. 肺炎鏈球菌3. 軍團菌4. 非典型分支桿菌5. 呼吸道感染病毒臨床與微生物檢驗中常見問題的討論六、培養(yǎng)報告上寫著四聯(lián)球菌、類白喉棒狀桿菌，為何沒有藥敏結(jié)果？1、四聯(lián)球菌為微球菌、類白喉棒狀桿菌，一般不引起人體致病，為非致病菌，故考慮污染可能；2、藥敏結(jié)果需參照CLSI標準，目前微球菌沒有參照標準

21、，故暫不能做藥敏試驗，若需治療可參照陽性球菌用藥?！叭魞H從一份血培養(yǎng)中分離出凝固酶陰性葡萄球菌，不必常規(guī)做藥敏試驗，因為這種菌經(jīng)常認為是血培養(yǎng)中的皮膚污染，假如需要做藥敏，請在24小時內(nèi)聯(lián)系實驗室?！眱和馀R床與微生物檢驗中常見問題的討論培養(yǎng)陽性的病原菌都需要用抗菌藥物治療嗎？1、不是；2、培養(yǎng)陽性感染，可能為污染（血培養(yǎng)），可能為定植（痰培養(yǎng)）；3、任何結(jié)果必須結(jié)合臨床情況進行評價（重要）；4、感染部位的清創(chuàng)、引流、換藥比使用抗菌藥更重要；5、改善患者全身情況：器官功能支持、糾正酸堿平衡、電解質(zhì)紊亂、低蛋白血癥、高血糖等。七、臨床與微生物檢驗中常見問題的討論臨床想用的藥物在藥敏試驗中沒有做

22、？1、可能是天然耐藥2、可能是藥敏板沒有包括該藥3、可能是該藥敏感性被其他藥物所預(yù)報是否能將所用的藥物都做抗菌藥物敏感試驗？1、沒有必要：通過耐藥機制和標志性藥物可以預(yù)測其他藥物的敏感性。2、沒有可能：藥敏藥物需要在體外穩(wěn)定，需要有操作標準和解釋標準。八、九、臨床與微生物檢驗中常見問題的討論天然耐藥：天然耐藥：腸球菌： 對除青、氨芐以外的所有青霉素類、頭孢菌素類天然耐藥。肺炎鏈球菌：對氨基糖苷類天然耐藥。嗜麥芽窄食單胞菌：碳青霉烯類天然耐藥。肺炎克雷伯菌：對氨芐西林天然耐藥。陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌：對頭孢西丁天然耐藥。銅綠假單胞菌：銅綠假單胞菌：對氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林-克拉維酸、復(fù)方新

23、諾明、1、2代頭孢天然耐藥。對三代頭孢（噻肟、曲松）即使藥敏試驗敏感，在實際里程治療中也需要超大劑量才會取得療效。頭孢中僅他啶和吡肟。銅綠假單胞菌有對跟多藥物的誘導(dǎo)耐藥性，在體外試驗可能沒有表現(xiàn)出來，但一旦接觸某種抗生素，其沉默的耐藥基因可能被誘導(dǎo)激活，耐藥性則表現(xiàn)出來，這種特性在-內(nèi)酰胺抗生素中尤為明顯，可導(dǎo)致體外敏感，但實際治療卻無效。臨床與微生物檢驗中常見問題的討論耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌發(fā)生率耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌發(fā)生率 耐碳青霉烯類用量耐碳青霉烯類用量對碳青霉烯類耐藥或中介敏感銅綠假單胞菌比例(%)碳青霉烯類用量(DDD/1000床-日)中部地區(qū)中部地區(qū)西南地區(qū)西南地區(qū)東部地區(qū)東部地區(qū)碳青霉烯的用量與碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌的檢出率正相關(guān)，碳青霉烯的用量與碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌的檢出率正相關(guān)，r=0.63r=0.63，P0.01P0.01Plss-Suard C,et al.Antimicrob Agents Chemother. 20