豬瘟重組疫苗的研究進展.docx

1、豬瘟重組疫苗的研究進展袁遠，楊文輝(1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所.黑龍江哈爾濱150001；2.哈爾濱北方森林動物園動物醫(yī)院，黑龍江哈爾濱】50300)摘要：豬瘟是嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)一種重要傳染病.弱毒疫苗的應用一定程度地控制了該病的流行與發(fā)生.但仍存在一些缺陷，新型、高效、標記疫苗的研制一直以來成為豬瘟疫苗領(lǐng)域的研究熱點。本文對豬瘟重組疫苗領(lǐng)域取得的研究研究進展進行了綜述。關(guān)鍵詞：豬瘟病毒；疫苗；中和抗體；T細胞反應中圖分類號：S852.65文獻標識碼：A文章編號：0529-5130(2008)09-0100-05豬瘟(classicalswinefever,CSF)被OIE認定為烈性傳染

2、性疾病之一。它能感染家豬和野豬，從經(jīng)濟學和衛(wèi)生學的角度來看，CSF已成為對全球養(yǎng)豬業(yè)造成毀滅性損失的疾病之一。正如很多其他的疾病能夠采用疫苗免疫一樣，50多年前研制的弱毒活疫苗是目前針對豬瘟病毒(CSFV)的最有效的疫苗。雖然該弱毒活疫苗具有很高的保護率，但還是存在一些缺陷。如免疫接種的致弱活病毒誘導機體產(chǎn)生的抗體與野毒感染動物后產(chǎn)生的抗體類型相似,使免疫動物和野毒感染的動物難以區(qū)分。最近，標記疫苗以及能區(qū)分野毒感染和疫苗接種(DIVA)的疫苗的研究成功打破了這種窘境。隨著診斷手段與工具的改進，盡管人們在新型和更安全的標記疫苗研制方面做了不少努力，但是豬瘟疫苗的研制仍需進一步加強。本文對當前豬

3、瘟疫苗研究領(lǐng)域的一些相關(guān)進展進行了綜述。1豬感染CSFV誘導的免疫反應了解CSFV與豬免疫系統(tǒng)之間的相互作用及其在致病機制中的功能是設(shè)計新的抗病毒策略的關(guān)鍵點。幾十年前的研究成果表明CSFV具有破壞淋巴樣濾泡的能力，且感染的主要靶細胞是單核巨噬細胞系的骨髓細胞(SWC3*；SWC8-)。有趣的是，雖然CSFV不易感染成熟的粒性白細胞(SWC3；SWC8)，但卻能感染未完全分化的骨髓祖細胞(SWC3、；SWC8-),從而解釋了CSFV出現(xiàn)在外周血成熟的SWC8*細胞的原因。和其他嚴重的出血性疾病一樣，CSFV也可感染內(nèi)皮細胞，對這些細胞病理損傷在CSFV發(fā)病中似乎發(fā)揮關(guān)鍵的作用，各種CSFV發(fā)病

4、的臨床癥狀中以微血栓、彌散性血管內(nèi)凝固和纖維蛋白溶解最為典型。雖然CSFV感染內(nèi)皮細胞能抑收稿日期：2008-03-26作者簡介：袁遠(1972-).男，助理研究員。制干擾素和細胞凋亡的產(chǎn)生，但也能誘導炎性細胞因子的產(chǎn)生。CSFV利用巨噬細胞和樹突狀細胞(DCs)的遷移能力彌散全身。在感染細胞內(nèi)的抗凋亡途徑的激活能確保病毒的存活，而可溶性促炎癥反應細胞因子的表達誘導并促進了感染細胞周圍的健康細胞的凋亡，因而逃避了對感染細胞的識別。最近的研究結(jié)果表明CSFV不僅能通過分泌細胞因子,還能通過其他機制來誘導免疫抑制，如表達CSFV結(jié)構(gòu)蛋白Ems蛋白，該蛋白在體外對T淋巴細胞已顯示毒性作用。CSFV也

5、能激活T細胞分泌細胞因子,如IL-10,該細胞因子可能在CSF感染后的免疫抑制中起關(guān)鍵作用。鑒于CSFV逃避免疫反應的能力，我們必須制定控制感染和阻止CSFV介導免疫逃避的免疫策略。如上所述，CSF是一種以高死亡率為特征的毀滅性疾病，依據(jù)毒株毒力和感染豬群的免疫狀況的差異，感染所造成的顯著免疫抑制能夠在機體的免疫系統(tǒng)被激活之前較早的導致一部分感染動物的死亡；而一些動物能借助自身的保護性免疫反應抵抗病毒的感染，從而對后來的再感染產(chǎn)生保護作用，以保護其他動物群體)。在某些情況下，免疫反應不足以把CSFV從動物體內(nèi)清除，導致CSFV在宿主體內(nèi)能夠持續(xù)存在，在有中和抗體存在的情況下能建立慢性感染；反之

6、，先天感染CSFV能導致動物的持續(xù)感染，但其不能產(chǎn)生特異性抗體，這可能是在胎兒的淋巴細胞分化期間產(chǎn)生免疫耐受的結(jié)果。CSFV在動物體內(nèi)的持續(xù)存在及誘導的慢性感染，對我們進一步弄清病毒與免疫細胞的相互作用機理以及哪些特異性免疫反應是具有保護功能有一定的作用。最新研究表明，CSFV感染后721d,甚至在中和抗體產(chǎn)生之前，感染豬就能誘導產(chǎn)生特異性CD4*T細胞和毒性T淋巴細胞(CTL),這種特異性的CTLs主要識別CSFV的結(jié)構(gòu)性E2蛋白和非結(jié)構(gòu)性NS3蛋白，這些結(jié)果和先前的發(fā)現(xiàn)即在NS3和NS4病毒蛋白之間具有一個CTL表位是一致的。有研究表明豬的一些白細胞抗原（SLA）I型和II型肽，其中大部分

7、錨定NS3多肽和結(jié)構(gòu)性E2蛋白。因此，感染動物持續(xù)散毒是新的CSF爆發(fā)的潛在源頭，而且對疾病的診斷帶來了新的挑戰(zhàn)。2抗CSFV的疫苗策略CSFV的經(jīng)典疫苗盡管早期的CSFV滅活疫苗不能有效地抵抗病毒感染,但是CSFV弱毒疫苗已被證實能有效預防豬瘟的發(fā)生1成。第一次用兔化弱毒疫苗接種試驗是60多年前進行的，至今這個領(lǐng)域的進展并不十分明顯。CSFV弱毒疫苗不但安全，而且即使懷孕母豬，在免疫5d后也能產(chǎn)生高水平的中和抗體，并對豬瘟強毒的攻擊提供保護，在CSF仍然流行的地區(qū)，應用弱毒疫苗仍然是控制該病的重要措施之一。CSFV弱毒株介導的免疫保護機制尚未完全清楚。在中和抗體產(chǎn)生之前，免疫動物就獲得了保護

8、，這一點已經(jīng)被證實。在免疫接種C株CSFV后的第12天就能檢測到抗體，在2884d內(nèi)到達高峰。豬群在一次免疫后產(chǎn)生的抗體有可能使其獲得終身保護3）。中和抗體在對CSFV免疫保護中和具有重要作用，而一些研究表明抗體滴度和免疫保護之間沒有必然聯(lián)系，因此除抗體以外的一些免疫反應可能對動物的免疫保護也起著重要作用。一般情況下，中和抗體能保護動物免受病毒攻擊，但免疫接種后，在缺少中和抗體的情況下也能產(chǎn)生保護作用。盡管CSFV弱毒疫苗經(jīng)過證實能產(chǎn)生有效保護，但仍然存在一些缺陷。疫苗接種產(chǎn)生的抗體和自然感染誘導的抗體很難區(qū)分，這不利于鑒別診斷刃。而且疫苗保存和使用不當以及疫苗免疫不能覆蓋所有易感豬群，均會導

9、致免疫失敗。此外，弱毒活毒苗在接種后至少15d內(nèi)能夠在淋巴器官（主要是扁桃體）內(nèi)一定程度的復制，這期間利用標準的診斷方法難以將其與野毒區(qū)分開來CSFV的新型疫苗像許多其它病毒一樣，感染性克隆平臺的建立與應用為深入了解病毒的復制機制及致病性提供了新的機遇豬瘟病毒弱毒C株、Alfort/Tubigen.Eystrup和Brescia株感染性克隆的建立使我們明確了Ems.Npro及E2蛋白為CSFV的潛在毒力決定因子I8-,9ioCSFV反向遺傳學的信息進一步確認了促進該病毒的蛋白或決定病毒毒力和宿主范圍的蛋白域。且為CSF新型疫苗設(shè)計與研制帶來了更多的思路與策略。毒力強的CSFV在特定的流行病學條

10、件下能演化成毒力較弱的毒株，這為研究決定病毒毒力的基因組變異，尤其是E2基因的變異提供了新的途徑【狽。這一技術(shù)使我們制造缺失E2或Ems基因的突變病毒株成為可能。這種缺失突變株只能在能反式提供缺失蛋白的感受態(tài)細胞系上生長，因此將其作為疫苗是安全的。一旦接種到體內(nèi)，這些突變病毒能誘導較強的免疫反應而不產(chǎn)生新的子代病毒，相似的策略已經(jīng)應用到幾種通過交換來自CSFV弱毒C株和抗原性相關(guān)痕病毒的E2或Ems基因而構(gòu)建的嵌合體中、最后，因病毒復制子顆粒不具有傳播能力而逐漸成為安全性疫苗的一種選擇N】。為了更加有效,這類疫苗的構(gòu)建應包含大部分已知能夠誘導CSFV細胞和體液免疫保護性決定簇的E2糖蛋白。對于

11、這類疫苗，一個值得關(guān)注的焦點是突變疫苗株和CSFV野毒株之間發(fā)生重組的可能性一些用來研制CSFV的DIVA疫苗的策略如通過減少病毒在動物體內(nèi)的復制或避免病毒的胎盤傳播，已被證實其效果良好。這類疫苗在構(gòu)建過程中大部分包括全長CSFVE2糖蛋白或這個蛋白的片段。E2蛋白已經(jīng)在不同的病毒載體中獲得表達，如痘苗病毒和腺病毒表達載體，或種屬特異性載體，如豬痘病毒或偽狂犬病病毒。上述研究結(jié)果表明，應用這些載體病毒構(gòu)建的重組病毒在臨床上都能夠誘導有效的免疫保護？-習。牛病毒性腹瀉病毒是CSFV的抗原相關(guān)病毒，曾被用作載體表達CSFVE2蛋白，能夠誘導免疫保護來抵御病毒的攻擊。盡管這些疫苗具有保護性潛力，但是

12、根據(jù)病毒傳播和CSFV的胎盤傳播情況，弄清楚它們誘導的免疫反應和保護效率，仍有很多研究工作有待開展2.3亞單位疫苗為了滿足更新更安全的控制CSF標記疫苗的需要，已經(jīng)采用了一些用來研制DIVA疫苗和開展輔助型診斷試驗的方法。至今，最有效的CSF的亞單位疫苗也是基于CSFV主要E2慵蛋白而研制的。利用桿狀病毒系統(tǒng)表達E2糖蛋白的不同節(jié)段獲得一系列的重組E2蛋白，并經(jīng)證實存在不同程度的保護作用。其中免疫原性最強的一個為表達缺少跨膜域重組E2糖蛋白，該重組蛋白易于從桿狀病毒感染細胞上清中分泌和純化出來迄今為止，大部分的CSFVE2亞單位標記疫苗還處于試驗階段，只有兩個疫苗被歐洲醫(yī)療產(chǎn)品評估機構(gòu)（EME

13、A）批準并商品化。這類疫苗免疫后動物僅僅產(chǎn)生抗E2糖蛋白的特異性抗體，而野毒感染的豬卻同時能夠產(chǎn)生抗Ems蛋白的抗體，這兩種抗體利用現(xiàn)有的ELISA抗體檢測方法能夠加以區(qū)分，但是其保護效率還有待于進一步的評估:割。與經(jīng)典的弱毒疫苗相比，盡管亞單位疫苗具有很多優(yōu)勢，但其保護效率還非常有限，尤其對懷孕母豬更是如此，且造成持續(xù)感染動物個體存在的風險很大最后兩個原因都與缺少有效的鑒別診斷方法相關(guān)，導致了在自然感染情況下，這些疫苗策略作為緊急措施不能推廣應用。首先，抗Ems蛋白的特異性抗體直到感染CSFV野毒株后2142d才產(chǎn)生（需要依據(jù)毒株毒力），這使得在疾病早期的鑒別診斷變得困難；其次，現(xiàn)有的基于E

14、蛋白的遠不如基于E2蛋白的EUSA檢測方法敏感和特異）。利用桿狀病毒表達系統(tǒng)，已使得開展E2慵蛋白的保護域進一步得到定義，探索E2蛋白保護性表位的某些特征成為可能列。所有這些研究，將允許在新的疫苗構(gòu)建中添加中和性B細胞表位，以利于對免疫動物和CSFV感染動物的鑒別診斷。在研制新型和改進CSF疫苗的同時，應致力于研發(fā)能區(qū)分免疫個體和感染個體的診斷新方法。不幸的是，相比于其他的疾病，商業(yè)利益的驅(qū)使可能是新型、有效CSFV診斷方法和疫苗研發(fā)滯后的主要原因。基于E2蛋白的疫苗顯示出類似存在基于其他策略的CSF疫苗中的一些限制。有些疫苗免疫動物不產(chǎn)生針對CSFV特異性抗體，而且保護效果和誘導的中和抗體之

15、間不是完全相關(guān)。對于能介導針對CSFV的高水平保護的新的DIVA疫苗的研究，應該探索出新的診斷手段作為補充叫2.4DNA疫苗DNA免疫是近十年發(fā)展起來的最為有前途的一種疫苗策略，這類疫苗能同時誘導細胞免疫和體液免疫，易于生產(chǎn)，并且被證明是安全的，即使是接種含有母源抗體的新生個體也是相當安全的J。由于它的單一性，DNA疫苗易于設(shè)計，且有可能將所表達的靶蛋白通過指定途徑導入機體內(nèi)，因此，DNA免疫將對理解針對某特定病原內(nèi)在的保護性免疫機制和免疫保護決定簇精確定位將是一個有價值的技術(shù)手段。大部分CSFV的DNA疫苗是基于病毒的主要免疫原性決定簇，即來自不同病毒株系的E2糖蛋白的表達。一些人報道用DN

16、A疫苗編碼全長E2搪蛋白，而也有人用缺少其跨膜域的突變形式）。由于所表達E2蛋白的形式、攻毒用CSFV毒株的毒力及劑所不同，不同研究小組開展的CSFVDNA疫苗的免疫效力試驗結(jié)果也難以進行比較。盡管用編碼整個E2糖蛋白的DNA疫苗大劑量進行免疫，臨床上能保護免疫豬不發(fā)生CSF,且證實其保護效果與抗CSFV的中和抗體之間不存在直接聯(lián)系。通過采用啟動-加強免疫的免疫程序，即先接種DNA疫苗后免疫表達CSFVE2全長蛋白的重組腺病毒，也同樣能獲得同等水平的免疫保護效果用編碼CSFV全長E2糖蛋白的DNA疫苗接種動物，在沒有中和抗體產(chǎn)生的情況下也能提供保護效果，盡管免疫動物在CSFV攻毒之前檢測不到抗

17、體,但在攻毒后第6d可檢測到中和抗體，甚至一些免疫動物出現(xiàn)免疫反應增強現(xiàn)象。然而免疫動物卻沒有出現(xiàn)病毒血癥，疫苗免疫提供了臨床發(fā)病和免疫抑制的保護，與針對中和抗體的誘導和MHCII限制型細胞免疫相關(guān)。這一研究證明了免疫反應的其他分支，如MHCII限制型CD4*T細胞的誘導在抗CSFV保護方面可能起到一定的作用*坨。3小結(jié)與展望CSFV的疫苗設(shè)計是多樣的，使得我們難以確認哪一種是最好的選擇。在不同的研究中，疫苗劑鼠、免疫次數(shù)、免疫途徑、免疫攻毒之間的時間間隔均不相同，攻毒用病毒的毒株、毒力、攻毒劑信與途徑以及用來評估疫苗效果的標準也不相同。建立常規(guī)免疫和攻毒程序和追蹤觀察標準，這些對于不同疫苗類

18、型的客觀對比和CSFV合理疫苗策略的選擇都是非常必要的。CSFV主要感染抗原遞呈細胞，如內(nèi)皮細胞，巨噬細胞和DCs,且與此同時誘導周圍的B細胞和T細胞的旁觀者凋亡。致病力強的CSFV在體內(nèi)能夠演變成弱毒株，因此在病毒傳播到周圍動物之前大大避免了感染動物的死亡。通過用能編碼CSFV全長E2糖蛋白的DNA疫苗免疫來模擬病毒感染，能有效誘導T細胞反應和中和抗體產(chǎn)生，提供對CSFV攻毒的完全保護。當評估豬瘟疫苗免疫效果的時候，除了檢測體液免疫反應指標外，再引入一些其他的相關(guān)指標是可行的。在大部分已發(fā)表的CSFV疫苗研究中，尤其是那些經(jīng)典弱毒活疫苗使用過程中，中和抗體的檢測僅僅是所考慮的唯一指標?，F(xiàn)有研

19、究結(jié)果表明T細胞反應在一定程度上能夠抑制CSFV復制，在CSF的免疫保護中也是很重要的9Mo盡管分析T細胞免疫反應的技術(shù)，在大部分的診斷實驗室都沒有得到應用，因此我們應該努力研究開發(fā)基于細胞免疫衡量的新的診斷手段。通過ELISA、ELISPOT、淋巴增殖試驗來檢測免疫后或感染各種CSFV毒株后所誘導的細胞因子外形特征，在將來會成為有用的診斷技術(shù)手段。這些診斷技術(shù)的一個優(yōu)勢是它們能夠在免疫后一個很短的時間內(nèi)，甚至在抗體反應出現(xiàn)之前即可對動物的使免疫狀態(tài)獲得分析功。雖然在CSFV的有效重組疫苗研制過程中仍存在很多困難，但是最近在這一領(lǐng)域的研究進展，充分顯示了此種疫苗廣闊的應用前景。同時，抗CSFV

20、的保護性免疫原及保護機制漸漸被人們所確認，這也將有利于設(shè)計更加新穎、更加有效的豬瘟標記疫苗。參考文獻：1MoennigV,Floegel-NiesmannG,Greixr-WilkeI.ClinicalsignaandepidemiologyofclAssicalswinefever：areviewofnewknowledgeJ.TheVeterinaryJournal,2003,165:11-20.2deSmitAJ.1laboratorydiagnosis,epizootiology,andefficacyomarkervaccine#inclassicalswinefever：arevi

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37、critiealRe.*仃唧III岫，牛肉嫩度營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)研究郭萬華I,谷子林2L魏昆鸚(1.河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院.河北保定071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學山區(qū)研究所.河北保定071001)摘要：牛肉餓度是影響牛肉消使的最重要的因素之一，到目前為止通過非營養(yǎng)調(diào)控的方式來改善牛肉嫩度的方法已經(jīng)比較成熟；隨著營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)研究的進一步發(fā)展，發(fā)現(xiàn)屠宰前適時改變?nèi)占Z的組成可以提高牛肉嫩度。關(guān)鍵詞：動物營養(yǎng)；牛肉嫩度；綜述；調(diào)控中圖分類號：S816.4文獻標識四：A文章編號：0529-5130(2008)09-0104-03牛肉嫩度是影響牛肉消費的最重要的因素之一，并且嫩度是決定牛肉質(zhì)陸的最重要的適口性

38、性狀，因為它直接關(guān)系到消費者對牛肉口味的滿意程度。美國每年因嫩度不合適造成的損失高達數(shù)億美元，到目前為止通過非營養(yǎng)調(diào)控的方式來改善牛肉嫩度的方法已經(jīng)比較成熟，例如：科學成熟處理、電剌激嫩化處理、外源蛋白酶嫩化處理，冷凍嫩化處理，嫩斬和吊掛處理，NaHC03或N*C()3嫩化處理、水震波嫩化處理，選種選育、適時屠宰等。不同的環(huán)境和營養(yǎng)條件對牛肉嫩度也有影響，但這種影響作用很小。隨著營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)研究的進一步發(fā)展，發(fā)現(xiàn)屠宰前適時補充維生素可以在一定程度上提高牛肉的嫩度。影響牛肉嫩度的因素很多，目前己得到證實的因素有品種、個體差異、性別、年齡、飼料，維生素D、E和維生素A等。本文從營養(yǎng)的角度對影響牛肉嫩度的因素進行綜述。1維生素A對牛肉嫩度的影響維生素A是目前世界上最易缺乏的一種營養(yǎng)素，它的缺乏可損害機體免疫功能，影響機體的正常生長發(fā)育，并造成先天不同器官的畸變。然而對于維生素A與肉品質(zhì)關(guān)系的研究報道目前非常少。萬發(fā)春在研究維生素A對利魯雜交陶牛牛肉品質(zhì)的