地黃飲子對(duì)老年性癡呆模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶及炎性反應(yīng)的影響

1、地黃飲子對(duì)老年性癡呆模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶及炎性反應(yīng)的影響    作者：宋琳 安平 樸鐘源 謝寧 姚麗芬【摘要】  目的探討地黃飲子對(duì)AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶及炎性反應(yīng)的影響。方法模型組以D半乳糖腹腔注射合并A注射海馬制備AD動(dòng)物模型，各治療組分別在造模的同時(shí)灌胃地黃飲子和抗腦衰膠囊、哈伯因。運(yùn)用MORRIS水迷宮檢測(cè)各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及采用免疫組化方法觀察各組大鼠海馬神經(jīng)元TNF，IL1蛋白的變化。結(jié)果治療組能縮短潛伏期、增加過(guò)臺(tái)次數(shù)，第四象限與其它象限游泳距離之間比較也有差異，說(shuō)明地黃飲子能改善癡呆大鼠空間探索記憶能力，低劑量組已經(jīng)顯效，高劑

2、量組效果更為明顯。地黃飲子治療組IL1，TNF含量顯著下降，且具有劑量差別。結(jié)論 地黃飲子對(duì)癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶空間探索能力有改善作用及能有效抑制海馬神經(jīng)元炎性反應(yīng)，其作用機(jī)理可能與地黃飲子抑制海馬神經(jīng)元TNF，IL1蛋白，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活性進(jìn)而減輕海馬神經(jīng)元的炎癥損傷有關(guān)。【關(guān)鍵詞】  地黃飲子； 老年性癡呆； 淀粉樣蛋白； MORRIS水迷宮； 炎性反應(yīng)Effect of Decoction of Rehmanniae on Improving Learning Memory Ability  and Inflammation Reaction of  Alz

3、heimers  Disease  Model  RatsAbstract：ObjectiveTo investigate effects of Decoction of Rehmanniae（DR） on improving learning  memory ability and inflammation reaction of Alzheimers disease(AD) model rats.MethodsAD model rats induced by D-galactose intraperitoneal injection and the

4、hippocampus injected -amyloid(A) were made. Every group was fed with Hup A, Kangnaoshuai and DR. The ability of learning memory was measured by Morris water maze(MWM). The inflammatory reaction of hippocampus neurons were observed by electron lens using immunohistochemistry method.Results DR could s

5、horten the escape latency and increase the number of passing plats and the swimming distance of the fourth quad compared with the other quads.  DR could dose-dependly reduce the expression of TNF，IL1 protein of Hippocampus neurons. ConclusionDR can improve the ability of spatial exploratory and

6、 effectively control the inflammation reaction. The mechanism of action is possibly relevant that DR can decrease the expression of IL1 and TNF to inhibit the activity of glia cell and inflammatory injury of hippocamus neurons.Key words：Decoction of Rehmanniae；  Senile Dementia；  amyloid ；

7、  Morris water maze；  Inflammation reaction老年性癡呆（Senile dementia）,亦稱阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD），是一種常見于老年人的神經(jīng)退行性疾病。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)AD發(fā)病的淀粉樣蛋白（A）致病學(xué)說(shuō)1制備AD復(fù)合動(dòng)物模型，觀察地黃飲子對(duì)擬AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶及炎性反應(yīng)的影響，旨在探討本方防治AD的作用機(jī)理。1  器材1.1   動(dòng)物  健康Wistar雄性大鼠140只，普通級(jí)，重（260±20）g，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證編號(hào):黑動(dòng)字

8、第P0010200A號(hào)）提供。1.2  藥物與試劑  地黃飲子制備方法：醇、水提取液與揮發(fā)油提取液，離心、濃縮至適量。合并上述醇、水提液及揮發(fā)油制成含生藥1 g/ml的濃縮液?？鼓X衰膠囊由石家莊四藥股份有限公司生產(chǎn)(國(guó)藥準(zhǔn)字Z13021850，生產(chǎn)批號(hào)040107) ，配制成含生藥0.2403 g/ml水溶液。哈伯因由河南竹林眾生制藥股份有限公司生產(chǎn)(國(guó)藥準(zhǔn)字H10940156，生產(chǎn)批號(hào)040103) ，配制成0.001 8/L水溶液。試劑：D半乳糖由上海華舜生物工程有限公司提供（批號(hào)707222）。A140，Sigma公司提供（Lot:088K49512）。TNF，IL1

9、免疫組化試劑盒，均由武漢博士德生物工程有限公司提供。pv6001/2二步法免疫組化試劑盒由北京中山生物技術(shù)有限公司提供。1.3  儀器腦立體定位儀（NARISHIGE SN-2型 日本）、MORRIS水迷宮系統(tǒng)（DMS2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）、攝影顯微鏡（OLYMPUS日本）等。2   方法2.1  分組方法140只Wistar大鼠隨機(jī)分成7組：空白組、假損傷組、模型組、抗腦衰對(duì)照組、哈伯因?qū)φ战M、中藥治療高、低劑量組，每組20只。2.2  模型制備2假損傷組腹腔注射生理鹽水，余組均給予D半乳糖（50 mg/kg·d）腹腔注射4周

10、，造成亞急性衰老；4周后在腦內(nèi)注射凝聚態(tài)A1401，TNF蛋白表達(dá)檢測(cè)    行為學(xué)測(cè)試完畢，大鼠迅速處死取腦，固定，選取注射部位，修塊，再固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，采用免疫組化（PV二步法）檢測(cè)IL1，TNF蛋白表達(dá)，光鏡下觀察鼠腦海馬細(xì)胞蛋白表達(dá)。其中滴加一抗（均150比例稀釋），滴加二抗（均是山羊抗兔）工作液，陰性對(duì)照為一抗加PBS。2.5  數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)采用±s表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS11.0軟件中進(jìn)行，采用方差分析，多組間兩兩比較用LSD法。3  實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1  地黃飲子對(duì)AD大鼠Mo

11、rris水迷宮行為學(xué)-空間探索實(shí)驗(yàn)的影響結(jié)果見表12。表1  大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）與空白組、假損傷組比較，P0.01；與模型組比較，*P0.05，*P0.01表2  大鼠空間探索試驗(yàn)結(jié)果（略）與空白組、假損傷組比較，P0.01；與模型組比較，*P0.05，*P0.01；與西藥對(duì)照組比較，#P0.05；組內(nèi)第四象限與其它象限比較，0P0.05，00P0.01結(jié)果表明，與空白組比較，模型組潛伏期延長(zhǎng)、過(guò)臺(tái)次數(shù)減少，差異顯著（P0.01），表明模型鼠空間探索能力下降。給藥組中，治療組和對(duì)照組均能縮短潛伏期、增加過(guò)臺(tái)次數(shù)，與模型組相比具有明顯差異（P0.05或P0.01），說(shuō)

12、明治療有效。各治療組和對(duì)照組第四象限與其它象限游泳距離之間比較也有差異（P0.05），而模型組大鼠象限游泳距離差異無(wú)顯著性（P0.05）。表明正常組和各治療組大鼠對(duì)原平臺(tái)象限的記憶較模型組好。同時(shí)我們計(jì)算出各組大鼠在原平臺(tái)象限第四象限游泳的時(shí)間(t4)和距離(l4)與總游泳時(shí)間(總)即60 s和總距離(L總)之比(t4/t總，l4/L總)。經(jīng)分析各治療、對(duì)照組與空白組t4/t總、l4/L總比較均有差異（P0.05或P0.01），中藥高劑量組大鼠與西藥對(duì)照組l4/L總比較有差異（P0.05），說(shuō)明地黃飲子對(duì)癡呆大鼠有改善記憶作用，低劑量組已經(jīng)顯效，高劑量組效果更為明顯，且優(yōu)于西藥對(duì)照組。3.2&

13、#160; 地黃飲子對(duì)AD大鼠腦IL1，TNF蛋白的影響蛋白表達(dá)的判斷標(biāo)準(zhǔn)：海馬CA1區(qū)IL1蛋白陽(yáng)性表達(dá)，胞核和胞漿均呈棕黃色細(xì)微顆粒狀。在海馬CA1區(qū)可見明顯的TNF陽(yáng)性表達(dá)，胞體較小，呈卵圓形、梭形或三角形，胞漿濃染，突起較少，大多為小膠質(zhì)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用CMIAS多功能真彩色病理圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，將圖像輸入計(jì)算機(jī)，計(jì)算陽(yáng)性目標(biāo)總面積與統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積比值，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果如表3及圖16 (200×) 所示。表3  各組大鼠海馬神經(jīng)元IL1，TNF蛋白表達(dá)的影響（略）與空白組、假損傷組比較P0.01；與模型組比較，*P0.05,*P0.01;n=8結(jié)果顯示

14、，模型組IL1，TNF均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，與空白組和假損傷組相比差異顯著（P0.01）。表明AD動(dòng)物模型誘導(dǎo)腦組織IL1，TNF蛋白表達(dá)增強(qiáng)。經(jīng)治療后各組IL1，TNF蛋白含量均顯著下降，其西藥對(duì)照組及高劑量組效果最為顯著（P0.01），低劑量、中藥對(duì)照組也顯示出良好的療效（P0.05），說(shuō)明地黃飲子高劑量與哈伯因均能有效抑制海馬神經(jīng)元升高的相關(guān)炎性蛋白表達(dá)，尤以地黃飲子效果最佳，且具有劑量差別。圖1  免疫組化ILI海馬空白組200×  （略）圖2  免疫組化ILI海馬模型組200×（略）圖3  免疫組化ILI海馬中藥高劑量組200&#

15、215;（略）圖4  免疫組化TNF海馬模型組200×（略）圖5  免疫組化TNF 海馬中藥高劑量組200× （略）圖6  免疫組化TNF海馬西藥對(duì)照組200×（略）4  討論現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)AD發(fā)病早期，炎癥反應(yīng)有利于A的清除，對(duì)神經(jīng)有保護(hù)作用。但過(guò)度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞（特別是位于老年斑附近）能分泌細(xì)胞因子，主要有IL1，IL1，IL6，S100、TNF，IFN和一些早期補(bǔ)體成分等。可見神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及其產(chǎn)生的多種炎性產(chǎn)物介導(dǎo)了這一個(gè)病理?yè)p傷過(guò)程。在A刺激下，小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL1是始動(dòng)環(huán)節(jié)，IL1除上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)其它

16、細(xì)胞因子外，尚誘導(dǎo)補(bǔ)體、急性期蛋白、氧自由基、NO，APP等生成增加。這些分子各自通過(guò)作用于膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元，促進(jìn)其它炎性分子的產(chǎn)生，這種交互作用促進(jìn)了慢性炎癥反應(yīng)的形成和炎性產(chǎn)物水平持續(xù)升高，對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)與神經(jīng)可塑性、損傷與變性及各種死亡機(jī)制產(chǎn)生廣泛的影響4。TNF-在炎癥反應(yīng)中是激活細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)的主要物質(zhì)，它還可直接作用與星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致髓鞘和少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，引起少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮比TNF-更大細(xì)胞毒性作用5。本實(shí)驗(yàn)中，地黃飲子治療組能縮短潛伏期、增加過(guò)臺(tái)次數(shù)，第四象限與其它象限游泳距離之間比較也有差異，說(shuō)明地黃飲子對(duì)癡呆大鼠有改善空間探索記憶作用，低劑量組已經(jīng)顯

17、效，高劑量組效果更為明顯。地黃飲子高劑量組IL1，TNF含量顯著下降，說(shuō)明地黃飲子能有效抑制海馬神經(jīng)元升高的相關(guān)的炎癥蛋白表達(dá)，且具有劑量差別。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中認(rèn)識(shí)到6，7：A能誘導(dǎo)腦組織產(chǎn)生大量自由基，MDA含量明顯升高，降低 SOD，CAT和GSHPx活性，使Ca2+大量?jī)?nèi)流。地黃飲子可以通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶活性起間接抗氧化作用，提高CAT和GSHPx協(xié)同作用以使細(xì)胞內(nèi)H2O2 濃度保持在穩(wěn)定水平,緩解其毒性。因此我們推測(cè)，地黃飲子有效成分有可能通過(guò)消除自由基的產(chǎn)生，提高抗氧化酶活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜通透性，保持鈣穩(wěn)態(tài)的作用，來(lái)下調(diào)海馬神經(jīng)元TNF，IL1蛋白表達(dá)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活性，減輕海馬神經(jīng)元的炎

18、癥損傷，從而改善癡呆大鼠空間探索記憶能力?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Selkod DJ.Alzheimers disease: a central role for amyloidJ.Neuropathol Exp Neurol,1994,53：438.2 謝 寧，宋 琳，牛英才，等.地黃飲子對(duì)老年性癡呆模型鼠腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及超微結(jié)構(gòu)的影響J.中國(guó)臨床康復(fù)，2005，10(7)：93.3 張魁華,賴世隆，王 奇，等.補(bǔ)腎益智方對(duì)老年性癡呆模型動(dòng)物空間探索學(xué)習(xí)記憶功能的改善作用J.中草藥，2002，33（12）：1093.4 韋道祥,陳俊拋.小膠質(zhì)細(xì)胞與阿爾茨海默病J.國(guó)外醫(yī)學(xué)·老年醫(yī)學(xué)分冊(cè),2000，11：248.5 Velzaquez P,et al.Asparate residue i