青島大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目

1、青島大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目季度檢查報(bào)告 2019 年 7 月 8 日項(xiàng)目名稱淫羊藿素抗AD炎癥反應(yīng)的藥效評價(jià)及機(jī)制研究項(xiàng)目編號G201811065068項(xiàng)目級別國家級學(xué)院（部）醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院負(fù)責(zé)人(姓名/學(xué)號)黃琳琳 2016210316指導(dǎo)教師陳文芳其他成員(姓名/學(xué)號)鄭欣慧 2016210301伏慧敏 2016210260 劉慧 2016210213徐蒙莉 2016210263一、項(xiàng)目進(jìn)展情況及取得成果（按照項(xiàng)目研究工作計(jì)劃逐一對照填寫）項(xiàng)目進(jìn)展情況（ ）按計(jì)劃進(jìn)行、（ ）進(jìn)度提前、（ ）進(jìn)度滯后主要研究階段(起止時(shí)間)研究內(nèi)容完成情況2018.07-2018.11不同濃度淫羊

2、藿素（ICT）對LPS誘導(dǎo)的海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活產(chǎn)生的炎性反應(yīng)的保護(hù)作用已完成2018.12-2019.04GPER信號通路是否參與了ICT的抗炎機(jī)制已完成2019.04-2019.10利用免疫印記、免疫組化等方法進(jìn)一步驗(yàn)證GPER是ICT抗炎作用的靶點(diǎn)且探究其下游信號通路已部分完成項(xiàng)目研究成果（已取得的成果）序號項(xiàng)目成果名稱成果形式1234二、項(xiàng)目中期報(bào)告（項(xiàng)目執(zhí)行的進(jìn)展情況，取得了哪些成績，是否達(dá)到預(yù)期效果，以及在項(xiàng)目的開展過程中還存在哪些問題。）1.第一階段：淫羊藿素 (ICT) 對LPS誘導(dǎo)的AD小鼠炎癥模型的保護(hù)作用(1)進(jìn)展： 選用8周齡左右的雄性ICR小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，應(yīng)用

3、腦立體定位，將脂多糖 (LPS) 2.5ul注入小鼠右側(cè)側(cè)腦室，制備AD炎癥模型。注射坐標(biāo)為：前囟 (AP)，-0.1mm;旁開 (ML)，-1mm;深度(DV)，-3mm。造模完成后，連續(xù)灌胃給藥ICT12天，并在灌胃給藥第8天起，連續(xù)5天進(jìn)行水迷宮檢測，觀察其學(xué)習(xí)記憶能力。而后取出左右側(cè)海馬組織，檢測炎性因子TNF-、IL-1和炎性因子限速酶COX-2、iNOS的基因表達(dá)，觀察不同濃度的ICT（5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg）對炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用,選出最佳保護(hù)劑量。(2)結(jié)果：水迷宮結(jié)果顯示，與Control組相比，LPS模型組小鼠的潛伏期增加、目的象限時(shí)間比及平臺穿越次數(shù)減

4、少（P<0.001）；Real time PCR結(jié)果顯示，LPS模型組海馬區(qū)炎性因子IL-1、TNF-及炎性因子限速酶iNOS、COX-2的基因表達(dá)上升（P<0.001，P<0.05）；不同劑量的ICT（5mg/kg, 10mg/kg, 20mg/kg）對LPS均有不同程度的保護(hù)作用，能夠明顯降低小鼠的潛伏期、增加目的象限時(shí)間比及平臺穿越次數(shù)（P<0.01，P<0.05）（見圖1），降低炎性因子的基因表達(dá)（P<0.001， P<0.01，P<0.05）（見圖2），其中10mg/kgICT組對LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的抑制作用最明顯。 圖1 不同劑量I

5、CT對LPS誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷的保護(hù)作用Fig. 1 Protective effects of different dosage of ICT against LPS-induced learning and memory ability deficits in mice After LPS injection, different dosages of ICT were administered by intragastric (i.g.) for 12 consecutive days. On the 7th day, performing 5 days of water maz

6、e training and testing. Data represent the mean±SEM, n=6. *P<0.001 compared with the control group, #P<0.05, #P<0.01compared with the LPS group.圖2 不同劑量ICT對LPS誘導(dǎo)的海馬區(qū)TNF、IL-1、COX-2及iNOS基因表達(dá)的抑制作用Fig. 2 Inhibitory effects of different dosages of ICT on LPS-induced gene expressions of TNF、I

7、L-1、COX-2 and iNOS in hippocampusAfter the water maze experiment completed, taking the right hippocampus for RT-PCR experiment, detect to gene expression of TNF、IL-1、COX-2 and iNOS. Data represent the mean ± SEM, n=6. *P<0.05, *P<0.001 compared with the control group, #P<0.05, #P<0.

8、01, #P<0.001 compared with the LPS group.2.第二階段：GPER參與ICT抗炎機(jī)制的初步研究（1）進(jìn)展：將小鼠隨機(jī)分為5組，分別為對照組，LPS組，LPS+ICT組，LPS+ICT+G15組， LPS+G15組。LPS造模完成后，側(cè)腦室埋管。隨后每天在灌胃ICT 1h前通過埋管位置注射GPER的特異性阻斷劑G15，連續(xù)12天。同樣進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測不同處理組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，然后斷頭取腦，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測小鼠COX-2，iNOS的基因表達(dá)。（2）結(jié)果：與ICT給藥組相比，G15+ICT組小鼠的水迷宮實(shí)驗(yàn)其潛伏期明顯增加、目的象限時(shí)間比

9、及平臺穿越次數(shù)減少（P<0.05）（見圖3）；海馬區(qū)炎性因子限速酶 COX-2、iNOS的基因表達(dá)均增加（P<0.01，P<0.05）（見圖4）。此外，G15+LPS組與LPS組相比，以上各指標(biāo)均無明顯差異。圖3 GPER的特異性阻斷劑G15 對ICT改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的阻斷作用Fig.3 The blocking effects of G15 on ICT-improved learning and memory ability in AD miceAfter LPS injection, ICT was administered intragastrically e

10、very day after injection of G15 for 12 consecutive days. On the 7th day, performing 5 days of water maze training and testing. Data represent the mean ± SEM, n=6. *P<0.001 compared with the control group, #P<0.05, #P<0.001 compared with the LPS group, P<0.05 compared with the 10mg/k

11、g ICT + LPS group.圖4 GPER的特異性阻斷劑G15 對ICT抑制炎性因子iNOS和COX-2基因表達(dá)的阻斷作用Fig.4 ICT inhibited the gene expressions of iNOS and COX-2 via GPER in hippocampusAfter the water maze experiment completed, taking the right hippocampus for RT-PCR experiment, detect to gene expression of COX-2 and iNOS. Data represen

12、t the mean ± SEM, n=6. *P<0.05, *P<0.001 compared with the control group, #P<0.05, #P<0.01, compared with the LPS group, P<0.05, P<0.01 compared with the 10mg/kg ICT + LPS group.3. 第三階段：利用免疫印記、免疫組化等方法進(jìn)一步驗(yàn)證GPER是ICT抗炎作用的靶點(diǎn)（1）實(shí)驗(yàn)方法：利用上述五組小鼠海馬組織，應(yīng)用Western-blot技術(shù)，檢測海馬內(nèi)炎性因子iNOS及COX-2

13、的蛋白表達(dá)。（2）結(jié)果Western blot結(jié)果顯示ICT可以抑制LPS誘導(dǎo)的COX-2及iNOS的蛋白表達(dá)（P<0.001）；與LPS+ICT組相比，G15+ICT組小鼠海馬區(qū)的COX-2及iNOS的蛋白表達(dá)均增加（P<0.01，P<0.001），表明ICT的抗炎保護(hù)作用可以被G15所阻斷。此外，G15+LPS組與LPS組相比，以上各指標(biāo)均無明顯差異（如圖5）。圖5 GPER介導(dǎo)ICT對AD小鼠海馬區(qū)炎性因子蛋白表達(dá)的抑制作用3.預(yù)期效果：上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果達(dá)到預(yù)期效果，接下來按計(jì)劃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。三、經(jīng)費(fèi)使用明細(xì)情況項(xiàng)目獲批總經(jīng)費(fèi)： 10000 元已使用項(xiàng)目研究經(jīng)費(fèi)： 6000 元已報(bào)銷金額： 0 元未報(bào)銷金額： 6000 元項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)開支情況名目用途金額備注論文版面費(fèi)專利申請費(fèi)調(diào)研、差旅費(fèi)打印、復(fù)印費(fèi) 資料費(fèi)試劑等耗材費(fèi)實(shí)驗(yàn)用材料，抗體，PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒等4000元器件、軟硬件測試、小型硬件購置費(fèi)購買實(shí)驗(yàn)老鼠等2000