MTT法檢測細(xì)胞活力

1、MTT法檢測細(xì)胞活力法檢測細(xì)胞活力甘肅中醫(yī)藥大學(xué)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)MTT法目的和意義法目的和意義檢測細(xì)胞存活和生長情況檢測細(xì)胞存活和生長情況用于評價藥物產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用用于評價藥物產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用原理原理 四唑鹽（噻唑藍(lán)）是一種能接受氫原子的染料，簡稱四唑鹽（噻唑藍(lán)）是一種能接受氫原子的染料，簡稱MTT 活細(xì)胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性的活細(xì)胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性的MTT還原為難還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的紫藍(lán)色結(jié)晶物，用酶）能溶解細(xì)胞中的紫藍(lán)色結(jié)晶

2、物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，從而反映細(xì)胞的增殖情況?；罴?xì)胞數(shù)量，從而反映細(xì)胞的增殖情況。 在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與活細(xì)胞數(shù)成正結(jié)晶物形成的量與活細(xì)胞數(shù)成正比。比?；罴?xì)胞+MTT琥珀酸脫琥珀酸脫氫酶氫酶紫藍(lán)色結(jié)晶物 Formazan貼壁細(xì)胞操作步驟貼壁細(xì)胞操作步驟 1. 接種細(xì)胞：用接種細(xì)胞：用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含血胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含血清的培養(yǎng)液配成清的培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液單個細(xì)胞懸液，以每孔，以每孔2000-3000個細(xì)胞接個細(xì)胞

3、接種于種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積孔培養(yǎng)板中，每孔體積90 ul。 （邊緣孔用（邊緣孔用PBS或空白或空白培養(yǎng)基填充）。培養(yǎng)基填充）。 2. 培養(yǎng)細(xì)胞：將培養(yǎng)板移入培養(yǎng)細(xì)胞：將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在孵箱中，在37、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（及飽和濕度條件下培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板孔平底板，大約，大約12h），加入濃度梯度的藥物。原則上，細(xì)胞貼壁后即），加入濃度梯度的藥物。原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，每孔加藥可加藥，每孔加藥10 ul，一般設(shè)，一般設(shè)5個復(fù)孔。個復(fù)孔。 3. 5%CO2，37孵育分別孵育孵育分別孵育24小時后，倒置顯微鏡下觀小時后，倒

4、置顯微鏡下觀察。察。 4. 每孔加入每孔加入10ul MTT溶液（溶液（5mg/ml，即，即0.5%MTT），繼續(xù)），繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)4h。若藥物與。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用心用PBS沖沖2-3遍后，再加入含遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。的培養(yǎng)液。 5. 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。 6. 每孔加入每孔加入100ul二甲基亞砜（置搖床上低速振蕩二甲基亞砜（置搖床上低速振蕩10min，使，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸處測量各孔的吸光值。光值。

5、 7.同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、培養(yǎng)液、（細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）、二甲基亞砜）懸浮細(xì)胞操作步驟懸浮細(xì)胞操作步驟： 1）將細(xì)胞離心收集后，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度大約）將細(xì)胞離心收集后，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度大約1104/ml，每孔先加，每孔先加細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液90ul,相應(yīng)梯度的藥物每孔相應(yīng)梯度的藥物每孔10ul；共；共100ul加入到加入到96孔板（邊緣孔板（邊緣孔用孔用PBS填充）。每板設(shè)對照。同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、填充）。每板設(shè)對照。同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、培養(yǎng)液、甲基

6、亞砜），對照孔（細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），、二甲基亞砜），每組設(shè)每組設(shè)5個個復(fù)孔。復(fù)孔。 2）置）置37，5%CO2孵育孵育24小時，倒置顯微鏡下觀察。小時，倒置顯微鏡下觀察。 3）每孔加入）每孔加入10 ul MTT溶液（溶液（5 mg/ml，即，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 4）每孔加三聯(lián)裂解液（每孔加三聯(lián)裂解液（10gSDS，異丁醇異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用雙蒸用雙蒸水溶解配成水溶解配成100ml）過夜，）過夜， 第二天早晨置搖床上低速振蕩第二天早晨置搖床上低速振蕩10 min，使，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢

7、測儀OD570nm測量各孔的吸光值。測量各孔的吸光值。藥物的配制 濃度 體積 過濾MTT的配制的配制 MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4C避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用度長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。尤其當(dāng)避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。時就絕對不能再用了。 MTT有致癌性，用的時候小心有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套有條件最好帶那種透明的簿

8、膜手套.配配成的成的MTT需要無菌，需要無菌，MTT對菌很敏感；往對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有孔板加時不避光也沒有關(guān)系，因為時間較短。關(guān)系，因為時間較短。實驗結(jié)果SS軟件進(jìn)行方差分析，p0.05時為相差顯著，p0.01時為相差非常顯著?？梢砸詴r間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生線曲線，專門公式求IC50（半數(shù)抑制濃度）。或計算抑制率。OD對照組-OD實驗組抑制率% = OD對照組100 %實驗結(jié)果公式如下： lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大劑量I:lg(最大劑量/相臨劑量)P:陽性反應(yīng)率之和Pm:最大陽性反應(yīng)率Pn:最小陽性反應(yīng)率舉例 藥物濃度0.

9、1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001umol/l，稀釋倍數(shù)為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 計算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025注意事項注意事項 1 選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。在進(jìn)行在進(jìn)行MTT試驗前，對每試驗前，對每一種細(xì)胞都應(yīng)測其貼壁率、

10、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)一種細(xì)胞都應(yīng)測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，然后確定試驗中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和條件下的生長曲線，然后確定試驗中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時間。培養(yǎng)時間。2 設(shè)空白對照，設(shè)空白對照，與試驗平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空與試驗平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔。最后比色時，以空白孔調(diào)零。白對照孔。最后比色時，以空白孔調(diào)零。 實驗前應(yīng)明確的問題實驗前應(yīng)明確的問題 1.選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，一般情況下，96孔培養(yǎng)孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長滿時約有板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長滿時約有105個細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞個細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼

11、壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗前，要進(jìn)行試驗前，要進(jìn)行預(yù)實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件預(yù)實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時間下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能保證，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。降低，太少觀察不到差異。2.藥物濃度的設(shè)定。藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別

12、人的結(jié)果一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃再定個比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度和時間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。度根本不是藥物的有效濃度和時間。3. 時間點的設(shè)定。時間點的設(shè)定。在不同時間點的測定在不同時間點的測定OD值，輸入值，輸入excel表，最后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變表，最后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點

13、應(yīng)該就是最好的時間點（因為這個時候的細(xì)胞增殖時間點應(yīng)該就是最好的時間點（因為這個時候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）。抑制表現(xiàn)的最明顯）。4.培養(yǎng)時間。培養(yǎng)時間。100ul的培養(yǎng)液對于的培養(yǎng)液對于10的的45次方的增次方的增殖期細(xì)胞來說，很難維持殖期細(xì)胞來說，很難維持68h，如果營養(yǎng)不夠的話，如果營養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會由增殖期漸漸趨向細(xì)胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在我們是在48h換液的。換液的。 5.MTT法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細(xì)胞絕對數(shù)。能測定細(xì)胞絕對數(shù)。做做MTT時，盡量無菌操作，因時，盡量無菌

14、操作，因為細(xì)菌也可以導(dǎo)致為細(xì)菌也可以導(dǎo)致MTT比色比色OD值的升高。值的升高。 7.實驗時應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對照孔，加藥孔。實驗時應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對照孔，加藥孔。調(diào)零孔加調(diào)零孔加培養(yǎng)基、培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。 8.避免血清干擾。避免血清干擾。用含用含15胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時，胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時，高的血清物質(zhì)會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增高的血清物

15、質(zhì)會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10胎牛血清的培胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。關(guān)于細(xì)胞的接種關(guān)于細(xì)胞的接種(鋪板鋪板) 細(xì)胞過了細(xì)胞過了30代以后就不要用了代以后就不要用了;培養(yǎng)板要用好的（最好進(jìn)口培養(yǎng)板要用好的（最好進(jìn)口板），不好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)實驗。板），不好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)實驗。 接種時最好按照預(yù)實驗摸索出的密度接種接種時最好按照預(yù)實驗摸索出的密度接種, 且而細(xì)胞過密或且而細(xì)胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增

16、值率線性關(guān)系不佳者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關(guān)系不佳。故而。故而MTT細(xì)胞密度多采用細(xì)胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。孔。 細(xì)胞密度要根據(jù)不同細(xì)胞的特點來定。細(xì)胞密度要根據(jù)不同細(xì)胞的特點來定。 懸浮細(xì)胞每孔的細(xì)懸浮細(xì)胞每孔的細(xì)胞數(shù)可達(dá)到胞數(shù)可達(dá)到105,貼壁細(xì)胞可為貼壁細(xì)胞可為103-104。 MTT本身就是比較粗的實驗，增殖率本身就是比較粗的實驗，增殖率10%左右的波動都不左右的波動都不算奇怪。特別是新手，算奇怪。特別是新手，20的波動也是常見的，所以很可的波動也是常見的，所以很可能是技術(shù)原因引起的，特別是能是技術(shù)原因引起的，特別是種板技術(shù)一定要過關(guān)種板技術(shù)一定要

17、過關(guān)。 注意注意細(xì)胞懸液一定要混勻細(xì)胞懸液一定要混勻，已避免細(xì)胞沉淀下來，導(dǎo)致每，已避免細(xì)胞沉淀下來，導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。加孔中的細(xì)胞數(shù)量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。另外，吹散次數(shù)過樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。另外，吹散次數(shù)過多也會影響細(xì)胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。多也會影響細(xì)胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。如何清除上清如何清除上清 直接吸出：直接吸出：加加DMSO前要把液體吸掉，但培養(yǎng)液里的紫色結(jié)晶可能前要把液體吸掉，但培養(yǎng)液里的紫色結(jié)晶可能會吸去，可在這之前先用平板離心機離心會吸去，可在這之前先用平板離心

18、機離心96孔板，孔板，2000r，5分鐘，分鐘，然后吸掉上清然后吸掉上清(如果是懸浮細(xì)胞，則推薦此法如果是懸浮細(xì)胞，則推薦此法,懸浮細(xì)胞要離心懸浮細(xì)胞要離心2500rpm10min.且其做且其做MTT最好用圓底型最好用圓底型96孔板孔板,清除上清時注意清除上清時注意不要把下面的結(jié)晶顆粒吸掉不要把下面的結(jié)晶顆粒吸掉,建議各孔吸棄建議各孔吸棄150-160ul即可即可)。 翻轉(zhuǎn)倒扣法：翻轉(zhuǎn)倒扣法：可以直接將板翻轉(zhuǎn)倒扣（墊幾層濾紙）可以直接將板翻轉(zhuǎn)倒扣（墊幾層濾紙）23次，比次，比用用“吸吸”的辦法更不容易使細(xì)胞脫離出來?？梢暂p拍，或者傾斜一點的辦法更不容易使細(xì)胞脫離出來?？梢暂p拍，或者傾斜一點幫助吸液，但前提是細(xì)胞貼壁要比較牢。幫助吸液，但前提是細(xì)胞貼壁要比較牢。加入加入DMSO 在同一批實驗中最好不要更換在同一批實驗中最好不要更換DMSO。加加DMSO前把孔中液體盡量棄前把孔中液體盡量棄干凈如果培養(yǎng)液沒棄干凈，空白孔也要留有等量的培養(yǎng)液，這樣在檢干凈如果培養(yǎng)液沒棄干凈，空白孔也要留有等量的培養(yǎng)液，這樣在檢測時可以盡量去除培