雙水相萃取技術(shù)及應(yīng)用

1、生物資源開發(fā)與利用專題 雙水相萃取技術(shù)及應(yīng)用 152310018 楊云梅 雙水相萃?。ˋqueous two phase extraction，英文縮寫ATPE）是利用物質(zhì)在互不相容的兩水相間分配系數(shù)的差異來進(jìn)行萃取的方法。如：葡聚糖（dextran）與聚乙二醇（PEG)按一定比例與水混合，溶液混濁，靜置平衡后,分成互不相溶的兩相，上相富含PEG,下相富含葡聚糖。當(dāng)兩種聚合物或一種聚合物與一種鹽溶于同一溶劑時(shí)，由于聚合物之間或聚合物與鹽之間的不相容性，當(dāng)聚合物或無機(jī)鹽濃度達(dá)到一定值時(shí)，就會(huì)分成不互溶的兩相。因使用的溶劑是水，因此稱為雙水相，在這兩相中水分都占很大比例(85一95),活性蛋白或細(xì)

2、胞在這種環(huán)境中不會(huì)失活，但可以不同比例分配于兩相,這就克服了有機(jī)溶劑萃取中蛋白容易失活和強(qiáng)親水性蛋白難溶于有機(jī)溶劑的缺點(diǎn)。雙水相萃取的優(yōu)點(diǎn)：1、 操作條件溫和，在常溫常壓下進(jìn)行；不會(huì)引起生物活性物質(zhì)的失活或變性。 2、兩相的界面張力小，萃取時(shí)兩相能高度分散,傳質(zhì)速度快。 3、排除了使用有毒、易燃的有機(jī)溶劑，能夠提供溫和的水環(huán)境，避免被萃取成分的脫水變性。 4、溶質(zhì)對(duì)目標(biāo)組分選擇性強(qiáng)，大量雜質(zhì)能與所有固形物一同除去，使分離操作5、過程簡(jiǎn)化，易于連續(xù)操作，處理量大，適合工業(yè)應(yīng)用。缺點(diǎn)：系統(tǒng)易乳化，成相聚合物的成本較高，水溶性高聚物大多數(shù)粘度較大，不易定量控制，高聚物回收困難。一

3、：雙水相萃取技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì) 目前，分離生物物質(zhì)經(jīng)常采用的雙水相系統(tǒng)主要有2類：非離子型聚合物/ 水系統(tǒng)（最常用的為聚乙二醇/葡聚糖）和非離子型聚合物/無機(jī)鹽/水系統(tǒng)（常用的如聚乙二醇/鹽體系）原因在于此2類雙水相系統(tǒng)采用的是無毒性的聚合物，且其多元醇、多元糖結(jié)構(gòu)能夠保證生物大分子的穩(wěn)定性但在實(shí)際應(yīng)用中，2類雙水相系統(tǒng)各有弊端，非離子型聚合物/水系統(tǒng)能夠保證生物活性物質(zhì)的活性,且界面吸附少，但所用聚合物材料如葡聚糖成本較大，且體系黏度大，制約大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)過程；相對(duì)于前者，非離子型聚合物/無機(jī)鹽/水系統(tǒng)成本低，體系黏度小，但該系統(tǒng)會(huì)導(dǎo)致某些敏感生物活性物質(zhì)失活，此外還會(huì)產(chǎn)生大量的高濃度鹽廢水。

4、因此，尋求新型雙水相體系成為日后的主要研究方向。目前，新型雙水相體系的開發(fā)主要有廉價(jià)的雙水相系統(tǒng)及其他新型功能雙水相系統(tǒng)。（1） 廉價(jià)雙水相系統(tǒng) 因?yàn)榫酆衔锊牧先缙暇厶堑葍r(jià)格較高，目前尋找一些廉價(jià)的聚合物是廉價(jià)雙水相系統(tǒng)開發(fā)的主要方向，如采用變性淀粉、阿拉伯樹膠等取代葡聚糖，羥基纖維素取代聚乙二醇。王雯娟2研究了采用羥丙基變性淀粉取代葡聚糖與PEG構(gòu)成雙水相系統(tǒng)來萃取菠蘿蛋白酶。 （2) 新型功能雙水相系統(tǒng) 新型功能雙水相系統(tǒng)是指系統(tǒng)中采用的聚合物易于回收或操作簡(jiǎn)便的雙水相體系。用乙烯基氧與丙烯基氧的共聚物（商品名UCON)和PET可以形成溫敏性雙水相體系。常溫條件下，PET，UCON和水混合

5、后均相體系，當(dāng)溫度加熱到40°C時(shí)，形成兩相體系，上相為PET和UCON，下相為水，這種體系可以實(shí)現(xiàn)PET和UCON的循環(huán)利用。（3）以熱分離聚合物和水組成的新型雙水相體系（溫度敏感型雙水相體系） 大多數(shù)水溶液熱分離聚合物是環(huán)氧乙烷（EO)和環(huán)氧丙烷（PO）的隨機(jī)共聚物（簡(jiǎn)稱EOPO聚合物),水-EOPO熱分離兩相體系由幾乎純水的上相和富含聚合物的下相組成。如：Triton和水形成的熱分離雙水相體系，當(dāng)溫度高于體系混濁點(diǎn)時(shí)，表面活性劑和水形成雙水相，上相為表面活性劑,下相為水。（4）正,負(fù)離子表面活性劑雙水相體系 表面活性劑雙水相體系是指采用表面活性劑為聚合物材料的雙水相體系。在一定

6、濃度和混合比范圍內(nèi)、無任何外加物質(zhì)的條件下，將陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉和陽離子表面活性劑溴化十二烷基三乙銨進(jìn)行混合，可以形成 2個(gè)互不混溶、平衡共存的水相，2相均為很稀的表面活性劑水溶液（其總質(zhì)量分?jǐn)?shù)在 1%以下）。它具有含水量比較高，兩相容易分離，表面活性劑的用量比較少，目前，國內(nèi)已有利用該系統(tǒng)分離蛋白質(zhì)，酶，氨基酸等報(bào)告。（5）離子液體雙水相系統(tǒng)的開發(fā) 離子液體是在室溫或接近室溫下以液體狀態(tài)存在的有機(jī)熔融鹽，完全由離子組成，有許多優(yōu)點(diǎn)，如液體狀態(tài)溫度范圍寬，具有良好的物理化學(xué)穩(wěn)定性，幾乎沒有蒸汽壓，無可燃性，有良好的溶解性，具有溶劑和催化劑的雙重功效。如用 C4 minBF4.NaH

7、2PO4雙水相萃取青霉素。在最優(yōu)化條件下萃取率達(dá)93.7%，同時(shí)降低了青霉素的降解率。 各種類型的雙水相體系類 型形成上相的聚合物形成下相的聚合物非離子型聚合物/ 非離子型聚合物聚乙二醇葡聚糖聚乙烯醇聚丙二醇聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮高分子電解質(zhì)/非離子型聚合物羧甲基纖維素鈉聚乙二醇高分子電解質(zhì)/高分子電解質(zhì)葡聚糖硫酸鈉羧甲基纖維素鈉聚合物/ 低分子量化合物葡聚糖丙醇聚合物/ 無機(jī)鹽聚乙二醇磷酸鉀硫酸銨二：雙水相萃取技術(shù)原理 雙水相系統(tǒng)形成的兩相均是水溶液，它特別適用于生物大分子和細(xì)胞粒子的分離。雙水相萃取已逐漸應(yīng)用于不同物質(zhì)的分離純化，如動(dòng)植物細(xì)胞，微生物細(xì)胞，病毒，葉綠體，線綠體，細(xì)胞膜，蛋白

8、質(zhì)，核酸等。溶質(zhì)在兩水相間的分配主要由其表面性質(zhì)決定，通過在兩相間的選擇性分配而得到分離。分配能力的大小可以用分配系數(shù)表示=Ct/Cb Ct， Cb分別代表上相、下相中的溶質(zhì)（分子或粒子）的濃度。研究表明，在相體系固定時(shí)，預(yù)分離物質(zhì)在相當(dāng)大的濃度范圍內(nèi)，分配系數(shù)為常數(shù)，與溶質(zhì)的濃度無關(guān)，只取決于被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)和特定的雙水相體系的性質(zhì)。 根據(jù)2相平衡時(shí)化學(xué)位相等的原則，從Brownstedt方程式求得分配系數(shù)，即 式中 M-物質(zhì)分子量 ，-系統(tǒng)表面特性系數(shù)，-波爾茲曼常數(shù)，T-溫度顯然因大分子物質(zhì)的M值很大，的微小改變會(huì)引起分配系數(shù)很大的變化。因此利用不同的表面性質(zhì)（表面自由能），可以達(dá)到

9、分離大分子物質(zhì)的目的。 雙水相形成條件和定量關(guān)系常用三角形相圖或直角坐標(biāo)相圖表示： 圖1是典型的高聚物-高聚物- 水雙水相體系的直角坐標(biāo)相圖，2種聚合物A、B以適當(dāng)比例溶于水就會(huì)分別形成有不同組成、密度的2相，輕相( 上相)組成用T點(diǎn)表示，重相(下相)組成用B點(diǎn)表示，由圖1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A，C點(diǎn)為臨界點(diǎn)或褶點(diǎn)，表示兩相差別消失。曲線TCB稱為結(jié)線，直線TMB稱為系線。結(jié)線上方是2相區(qū)，下方為單相區(qū)。所以組成在系線上的點(diǎn)，分為2相后，其上下相組成分別為T和B，T、B量的多少服從相圖的杠桿定律。即T和B相質(zhì)量之比等于系線上MB與MT的線段長(zhǎng)度之比又由于2相密

10、度相差很?。p水相體系上下相密度常在1.0-1.1kg/dm3之間），故上下相體積之比也近似等于系線上MB與MT線段長(zhǎng)度之比。性質(zhì)差異：系線的長(zhǎng)度是衡量?jī)上嚅g相對(duì)差別的尺度,系線越長(zhǎng),兩相間的性質(zhì)差別越大；反之則越小。三：影響雙水相萃取的因素 雙水相萃取受許多因素的制約，被分配的物質(zhì)與各種相組分之間存在著復(fù)雜的相互作用，作用力包括氫鍵，電荷力，范德華力，疏水作用和構(gòu)想效應(yīng)。因此，形成相系統(tǒng)的高聚物的相對(duì)分子質(zhì)量和化學(xué)性質(zhì)，被分配物質(zhì)的大小和化學(xué)性質(zhì)都有直接的影響。粒子的表面暴露在外，與相組分相互接觸，鹽離子在兩相間具有不同的親和力，由此形成的道南電位對(duì)帶電分子或粒子的分配具有很大影響。（1）聚

11、和物的分子量的影響 聚合物的分子量降低時(shí)，蛋白質(zhì)易分配于富含該聚合物的相。例如在PEGDeX系統(tǒng)中，PEG的分子量減小，會(huì)使分配系數(shù)增大，而葡聚糖的分子量減小，會(huì)使分配系數(shù)降低。這是一條普遍的規(guī)律，不論何種成相聚合物系統(tǒng)都適用。（2） 成相聚和物濃度的影響 當(dāng)接近臨界點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)均勻地分配于兩相，分配系數(shù)接近于1。 如成相聚合物的總濃度或聚合物鹽混合物的總濃度增加時(shí)，系統(tǒng)遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)，系線的長(zhǎng)度也增加，此時(shí)兩相性質(zhì)的差別也增大，蛋白質(zhì)趨向于向一側(cè)分配，即分配系數(shù)或增大超過1，或減小低于1。(3)體系中無機(jī)鹽離子的影響 鹽離子在兩相中有不同的分配，因而在兩相間形成電位差，由于各相要保持電中性，因此

12、對(duì)于帶電荷的蛋白質(zhì)等物質(zhì)的萃取來說,鹽的存在就會(huì)使系統(tǒng)的電荷狀態(tài)改變,從而對(duì)分配產(chǎn)生顯著影響。 鹽的種類對(duì)雙水相萃取也有一定的影響,因此變換鹽的種類和添加其他種類的鹽有助于提高選擇性。在不同的雙水相體系中鹽的作用也不相同。（4）體系PH的影響 pH會(huì)影響蛋白質(zhì)中可以離解基團(tuán)的離解度，因而改變蛋白質(zhì)所帶電荷和分配系數(shù)。pH也影響磷酸鹽的解離程度，若改變H2PO4-和HPO42-之間的比例，也會(huì)使相間電位發(fā)生變化而影響分配系數(shù)。pH的微小變化有時(shí)會(huì)使蛋白質(zhì)的分配系數(shù)改變23個(gè)數(shù)量級(jí)。（5）體系溫度的影響 溫度影響較小,一般溫度改變不影響產(chǎn)物的萃取。大規(guī)模操作一般在室溫下進(jìn)行,不需冷卻。這是基于：a

13、.成相聚合物PEG對(duì)蛋白質(zhì)有穩(wěn)定作用,常溫下蛋白質(zhì)不會(huì)發(fā)生變性;b.常溫下溶液粘度較低,容易相分離;c.常溫操作節(jié)省冷卻費(fèi)用.四：雙水相萃取的應(yīng)用 (1)蛋白質(zhì)、酶、多肽的純化 蛋白質(zhì)、酶、多肽在這兩相中水分都占很大比例(85一95)，因此稱為雙水相?；钚缘鞍谆蚣?xì)胞在這種環(huán)境中不會(huì)失活，但可以不同比例分配于兩相，這就克服了有機(jī)溶劑萃取中蛋白容易失活和強(qiáng)親水性蛋白難溶于有機(jī)溶劑的缺點(diǎn)。如在各種條件下，不同脫氫酶根據(jù)系數(shù)的不同而分離純化。 在一個(gè)聚乙二醇4000/葡萄糖T-500系統(tǒng)中，各種脫氫酶的分配系數(shù)K與聚乙二醇4000-NADH濃度的函數(shù)關(guān)系系統(tǒng)條件：7%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）聚乙二醇4000,6%

14、（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）葡萄糖T-500,0.05mol/L凝酸鉀，PH值7.5，溫度20最佳。 以蛋白質(zhì)的分離為例說明雙水相分離過程的原則流程: 包括三步雙水相分離: 第一步：所選擇的條件應(yīng)使蛋白質(zhì)產(chǎn)物分配在富PEG的上相中,而細(xì)胞碎片及雜質(zhì)蛋白質(zhì)等進(jìn)入下相。 第二步：分相后上相中再加入鹽使再次形成雙水相體系,核酸和多糖則分配入富鹽的下相,雜質(zhì)、蛋白質(zhì)也進(jìn)入下相,而所需的蛋白質(zhì)再次進(jìn)入富含PEG的上相。 第三步：向分相后的上相中加入鹽以再一次形成雙水相體系。在這一步中,要使得蛋白質(zhì)進(jìn)入富鹽的下相,以與大量的PEG分開。蛋白質(zhì)與鹽及PEG的分離可以用超濾、層析、離心等技術(shù)。(2)中草藥有效成分的提取 中草

15、藥是我國的國寶，已有幾千年的應(yīng)用歷史，但是有關(guān)中草藥有效成分的確定和提取技術(shù)在國內(nèi)發(fā)展一直比較緩慢，這無疑限制了中藥藥理學(xué)的發(fā)展、深化以及中藥現(xiàn)代化。近幾年來，有關(guān)雙水相萃取技術(shù)提取中草藥有效成分的文獻(xiàn)開始報(bào)道，盡管數(shù)量不多,但是已有的實(shí)例充分表明其有良好的應(yīng)用前景。將 PEG和 K2HPO4 配成一定濃度的濃溶液；在常溫下,取三七濃縮液置于10ml的離心試管中,加入一定體積的成相物質(zhì)濃溶液,振蕩搖勻,在離心機(jī)中以一定轉(zhuǎn)速離心5min,使其分相；分別讀取上下相體積,并取樣分析上下相中三七總皂苷的含量。 (3)黃毒苷的免疫測(cè)定 基于液-液體系或界面性質(zhì)而開發(fā)的分析檢測(cè)技術(shù)是一項(xiàng)潛在的有應(yīng)用價(jià)值的

16、生化檢測(cè)分析技術(shù)。這一技術(shù)已成功地應(yīng)用于免疫分析、生物分子間相互作用力的測(cè)定和細(xì)胞數(shù)的測(cè)定。如強(qiáng)心藥物異羥基毛地黃毒苷（簡(jiǎn)稱黃毒苷）的免疫測(cè)定。雙水相體系檢測(cè)螺旋霉素的電化學(xué)方法都利用生物物質(zhì)在雙水相體系的分配系數(shù)的不同為基礎(chǔ)進(jìn)行的分析。(4)稀有金屬/貴金屬分離 傳統(tǒng)的稀有金屬/貴金屬溶劑萃取方法存在著溶劑污染環(huán)境，對(duì)人體有害，運(yùn)行成本高，工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)。雙水相技術(shù)萃取技術(shù)引入到該領(lǐng)域,無疑是金屬分離的一種新技術(shù)。在聚乙二醇2000/硫酸按/偶氮胂()雙水相體系中,實(shí)現(xiàn)了Ti ()與 Zr（鋯)()的分離。分別在60ml 分液漏斗中加入不同 pH 值的緩沖溶液2ml,偶氮胂溶液0.6ml,PEG 溶液5ml和一定量的金屬離子溶液,用水定容到 1