重疊PCR(Overlap

1、重疊PCR (Overlap PCR)的基 本原理 及其簡(jiǎn)單運(yùn)用劉夢(mèng)鴿謝志能曹志秦朱建勛林福龍2016.06.08重疊延伸PCR技術(shù)(gene splicing by overlap extension PCR,簡(jiǎn)稱SOE PCR)由于采用具有互補(bǔ)末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈,從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸,將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。簡(jiǎn)介特點(diǎn)：u可簡(jiǎn)單迅速將兩個(gè)DNA片段連在一起，用于嵌合體基因的構(gòu)建。u可以進(jìn)行定點(diǎn)突變。u可以在兩基因片段間加入其他序列酶切位點(diǎn)或者標(biāo)簽。u豐富的PCR的擴(kuò)增范圍，尤其在獲得長(zhǎng)DNA片段方面，省去常規(guī)克隆的繁瑣。2目的基因5,5

2、,3,3,解旋、退火延伸第二輪擴(kuò)增大量目的基因多次次擴(kuò)增PCR圖解運(yùn)用通過(guò)酶切法得到相應(yīng)的粘性末端，再利用連接酶得到任務(wù)：兩個(gè)基因片段，或者一個(gè)基因和啟動(dòng)子、終止子要連接在一起。常用的方法1.沒(méi)有合適的酶切位點(diǎn)2.酶昂貴，使用少重疊PCR技術(shù)迅速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單易行4不可行幾個(gè)主要的運(yùn)用大于10000bp的基因基因A基因B基因A+B目的基因CDS1CDS2CDS3內(nèi)含子內(nèi)含子無(wú)內(nèi)含子的編碼序列引物的設(shè)計(jì)基因1基因2F1 引物R2引物R1引物F2 引物基因1基因2基因1基因2堿基相同區(qū)域，至少20bp基因1基因2PCR怎么樣發(fā)生反應(yīng)？PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增6反應(yīng)機(jī)理5555333355335533加入

3、酶，buffer等反應(yīng)液。PCR儀中解鏈，退火單鏈模板結(jié)合F1 引物R1引物F2 引物R2 引物無(wú)目標(biāo)產(chǎn)物5533加入F1引物、R2引物5533F1 引物R2 引物大量擴(kuò)增目的基因基因A基因B7在定點(diǎn)突變方面的應(yīng)用 G C A A A G G C A T C G A C G T T T C C G T A G C TF1引物F2引物R1引物R2引物堿基同源區(qū)域突變堿基突變堿基：可以在引物上換成任何其他堿基。堿基同源區(qū)域：保證20bp左右，這樣有利于Overlap PCR 得到目標(biāo)序列。 G C A A AC G T T TG C A A A T G C A T C G AC G T T T A

4、 C G T A G C TF1引物R1引物F2引物R2引物G C A A A T G C A T C G AC G T T T A C G T A G C TOverlap PCR得到突變后的目的基因8上述反應(yīng)體系中，反應(yīng)液的加入有兩種不同的方式u一種是先加入酶，模板（基因A和B）buffer，dNTP，水。經(jīng)過(guò)5個(gè)循環(huán)得到完整的目的基因。然后入引物，大量擴(kuò)增目的基因。雖然這樣操作繁瑣，但是可以得到特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。u另外一種是直接一步加入所有需要的反應(yīng)液。雖然此操作簡(jiǎn)單省時(shí)，但是會(huì)出現(xiàn)非特異擴(kuò)增條帶，影響膠回收，產(chǎn)量也會(huì)減少。9注意事項(xiàng)1、兩基因模板間的重疊部分不能少于20bp，否則退火時(shí)模

5、板貼不緊，得不到融合的目的基因。2、四條引物的TM值盡量保持相同或一致，利于引物的靈活使用。3、控制重疊PCR的循環(huán)次數(shù)比一般PCR少，這樣可以減少非特異性條帶。4、控制PCR模板的濃度，已經(jīng)融合模板的比例。一般控制摩爾濃度比為1:1，且質(zhì)量在20ng左右。10謝 謝11OVER-LAP PCR得到完整基因ComponentVolume前1067bp片段1 l(20ng)后1174bp片段1 l(20ng)10 LA Buffer 5 l2.5 mM dNTP 4 lLA Taq 0.5 lPCR grade water38.5 lTotal reaction volume50 l Cycling conditionsPre-denaturation:98, 2 min.Denaturation:98, 30 sec.Annealing:60, 30 sec.Extension:72,1 min.Extension:72,5 min.Finally: 4 , .5 cycle加入100 M濃度的F和R引物各0.5 l Cycling conditionsPre-denaturation:98, 2 min.Denaturation:98, 30 sec.Annealing:65, 30 sec.