淺論白藜蘆醇誘導(dǎo)大鼠原代脂肪細(xì)胞凋亡及機(jī)制

1、淺論白藜蘆醇誘導(dǎo)大鼠原代脂肪細(xì)胞凋亡及機(jī)制                作者：陳思凡， 周妮曼， 鄭琳， 柯梁汝， 單智銘， 馮翔【摘要】  【目的】 探討白藜蘆醇(Res)對(duì)大鼠原代脂肪細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制?！痉椒ā?培養(yǎng)大鼠原代脂肪細(xì)胞，添加不同劑量的Res干預(yù)，用Hoechst 33258染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài);用DNA Ladder實(shí)驗(yàn)觀察DNA斷裂的條帶;檢測(cè)各組培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi)的乳酸脫氫酶(LDH)含量，計(jì)算LDH漏出率

2、;用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率;Western blot檢測(cè)相關(guān)位點(diǎn)，包括沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)、細(xì)胞色素C(Cytochrome C)、半胱天冬氨酸酶家族(Caspase 9和Caspase 3)的蛋白質(zhì)表達(dá)。【結(jié)果】 經(jīng)過Res干預(yù)后，細(xì)胞核染色質(zhì)高度凝集，電泳后出現(xiàn)180 200 bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段。細(xì)胞LDH漏出率升高，呈劑量-反應(yīng)關(guān)系(P 0.05或P 0.01)。Res作用后細(xì)胞凋亡率明顯上升，呈劑量-反應(yīng)關(guān)系(P 0.01)。Sirt1、Cytochrome C、活化的Caspase 9及Caspase 3表達(dá)水平上升，胞漿Cytochrome C釋放也增加?！窘Y(jié)論

3、】 Res促進(jìn)原代脂肪細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過增加Sirt1表達(dá)，經(jīng)由線粒體凋亡途徑，作用于Caspase 9和Caspase 3。 【關(guān)鍵詞】  白藜蘆醇; 凋亡; 沉默信息調(diào)節(jié)因子1; 細(xì)胞色素C; 半胱天冬氨酸酶Abstract： 【Objective】 To explore the effect and mechanism of resveratrol (Res) on apoptosis of rat primary adipocytes. 【Methods】 Rat primary adipocytes were cultured and treated with re

4、sveratrol in different dosages. Adipocytes were stained by Hoechst 33258， and cell morphological transformation was examined with fluorescent microscope. DNA Ladder assay was used to further confirm cell apoptosis. The LDH content in medium and cells was measured to calculate the LDH leaking ratio.

5、The number of apoptotic cells were assayed with flow cytometry. The expression of silent information regulator 1 (Sirt1)， Cytochrome C， Cleaved Caspase 9， Cleaved Caspase 3 were examined using Western blot. 【Results】 Res induced the apoptosis of rat primary adipocytes in a dose dependent manner. Nuc

6、lear fragmentation and condensation were observed by Hoechst 33258 staining and DNA Ladder assay. Res also increased the LDH leaking ratio， the number of apoptotic cells and the expression levels of Sirt1 and Cytochrome C， Cleaved Caspase 9， Cleaved Caspase 3. 【Conclusion】 Res could induce the apopt

7、osis of rat primary adipocytes. The underlying mechanisms may be enhancing expression of Sirt1， Cytochrome C， Cleaved Caspase 9 and Cleaved Caspase 3 which are related to cell apoptosis.既往研究認(rèn)為，肥胖的形成與脂肪的合成或分解代謝紊亂密切相關(guān)，而新的研究顯示，前脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞的凋亡，對(duì)于減少機(jī)體過度的脂肪堆積，改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)及預(yù)防與治療代謝綜合征都具有實(shí)際意義1。白藜蘆醇(Resveratrol，Re

8、s)是一種多酚類化合物，存在于多種天然植物如葡萄、虎杖中，在新鮮葡萄皮中含量最高。Res有廣泛的生物學(xué)功能，在機(jī)體中有包括抗癌、抗炎癥、保護(hù)心血管系統(tǒng)、清除自由基、改善胰島素抵抗和抑制血小板凝集等作用。研究發(fā)現(xiàn)，Res可以抑制多種癌細(xì)胞的增殖，并且促進(jìn)其凋亡，具有腫瘤化學(xué)預(yù)防的作用。然而，目前有關(guān)Res對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡作用的研究仍相對(duì)較少。沉默信息調(diào)節(jié)因子1 (Silent information regulator 1， Sirt1)是一種去乙?；福诩?xì)胞凋亡過程中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，Res可以通過增加Sirt1的表達(dá)，經(jīng)由線粒體凋亡途徑，激活Caspase家族的蛋白，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的

9、凋亡。本實(shí)驗(yàn)以大鼠原代脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)Res對(duì)其凋亡的影響及Sirt1、Cytochrome C、Caspase 9、Caspase 3的蛋白表達(dá)變化，為探討Res對(duì)原代脂肪細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。1 材料和方法1.1 材 料白藜蘆醇(用DMSO溶解，配置成80 mmol/L的儲(chǔ)備液，DMSO在培養(yǎng)基的終濃度低于0.1%)，DMSO，型膠原酶，Hoechst 33258，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;高糖DMEM培養(yǎng)基，新生牛血清，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;DNA marker，DNA Ladder檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海Beyotime公司;LDH檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所;

10、細(xì)胞凋亡測(cè)定試劑盒，購(gòu)自美國(guó)BD公司;兔抗Sirt1單克隆抗體，購(gòu)自英國(guó)abcam公司;兔抗Cytochrome C、Cleaved Caspase 9、Cleaved Caspase 3單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)CST公司;兔抗GAPDH單克隆抗體，購(gòu)自武漢Boster公司;細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒，BCA試劑盒，HRP標(biāo)記的抗兔二抗，購(gòu)自上海Beyotime公司。1.2 方 法雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量160 180 g，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。原代脂肪細(xì)胞分離與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過程：取大鼠1只，麻醉處死后無菌分離附睪脂肪組織，以眼科剪剪200 300次，剪碎至1 mm3以下，用1.5 g/L的型膠原酶消化

11、細(xì)胞，放入水浴搖床，100 120 r/min，37 水浴消化約40 min，100目的網(wǎng)過濾，靜置于離心管約5 min，脂肪細(xì)胞自然上浮，將成熟的脂肪細(xì)胞用培養(yǎng)基重復(fù)洗2次，在培養(yǎng)管中加入無酚紅的DMEM培養(yǎng)基(100 mL/L新生牛血清、100 IU/mL青霉素、100 IU/mL鏈霉素)，觀察細(xì)胞狀況。取3只SD大鼠，按以上方法分離培養(yǎng)原代脂肪細(xì)胞，按照下面的實(shí)驗(yàn)方法添加不同劑量的Res，在37 、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、95%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱里進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù)試驗(yàn)。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞用20、40、80 mol/L的Res作用12 h，對(duì)照組添加相等量的DMSO作為參照，藥物處理完畢

12、后用PBS洗滌2次，用甲醇/冰醋酸(3：1)于4 固定10 min，洗滌后用Hoechst 33258(濃度為5 mg/L)避光染色15 min。用PBS洗滌1次。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取約6 000個(gè)細(xì)胞均勻涂在載玻片上，用甘油封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照(激發(fā)波長(zhǎng)340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)420 nm)。細(xì)胞經(jīng)過20、40、80 mol/L的Res干預(yù)6 h或12 h后，按照DNA Ladder 試劑盒說明書，利用離心柱抽提法，抽提并純化各組細(xì)胞的DNA，取20 ?滋L的DNA樣品，加6 × DNA上樣緩沖液(體積分?jǐn)?shù)30%甘油，0.25 %溴酚藍(lán))，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的瓊脂糖凝膠(含0

13、.5 ?滋g/mL溴化乙錠)中進(jìn)行電泳(40 V，電泳約3 h)，染料泳動(dòng)至2/3處。在凝膠成像分析儀上對(duì)凝膠進(jìn)行拍照，觀察DNA Ladder的形成。收集各組的培養(yǎng)基和細(xì)胞，細(xì)胞在PBS中重懸，通過超聲裂解細(xì)胞，按照LDH檢測(cè)試劑盒說明書，檢測(cè)并計(jì)算各組培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi)的乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)含量。LDH漏出率(%) = c培養(yǎng)基(LDH)/(c培養(yǎng)基(LDH) + c細(xì)胞內(nèi)(LDH)。細(xì)胞經(jīng)20、40、80 mol/L的Res干預(yù)12 h后，收集各組細(xì)胞，按照細(xì)胞凋亡率測(cè)定試劑盒的方法，分別添加Annexin V和7-AAD，處理后在流式細(xì)胞儀上測(cè)定細(xì)

14、胞凋亡率。用NP40裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，按照碧云天的試劑盒說明書抽提細(xì)胞漿蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。灌制質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的分離膠和5%的濃縮膠，恒壓120 V、80 mA預(yù)電泳10 min，上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干式轉(zhuǎn)移，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗按照1：1 000的稀釋度于4 下孵育過夜，二抗(1：5 000)室溫孵育1 h，暗房中滴加發(fā)光底物混合物2 mL于膜上，用X線片曝光、顯影、定影。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理每個(gè)組別設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照組，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。數(shù)據(jù)輸入SPSS 11.0軟件中，用方差分析方法(ANOVA)及Bonferroni法進(jìn)行組間差異比

15、較的統(tǒng)計(jì)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn) = 0.05，P 0.05代表兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化細(xì)胞用Hoechst 33258染色，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的細(xì)胞核呈現(xiàn)彌散均勻的藍(lán)色熒光，20、40 mol/L Res組的細(xì)胞核形態(tài)與對(duì)照組相比無明顯差異(圖略)，而80 mol/L Res組的細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、邊緣化，有部分細(xì)胞核裂解成碎塊(圖1)。2.2 DNA Ladder電泳結(jié)果DNA Ladder電泳結(jié)果顯示，不同劑量Res作用細(xì)胞6 h后，未出現(xiàn)明顯的DNA小片段條帶，而作用12 h后，40、80 mol/L劑量組則出現(xiàn)180 200 bp整數(shù)倍的DNA片段條

16、帶，表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(圖2)，說明Res引起細(xì)胞核染色質(zhì)DNA斷裂，進(jìn)一步證明Res促進(jìn)細(xì)胞凋亡。2.3 各組的LDH漏出率用20、40、80 mol/L的Res干預(yù)細(xì)胞12 h后，與對(duì)照組相比，DMEM培養(yǎng)基中的LDH含量升高，細(xì)胞內(nèi)的LDH含量下降(P 0.05或P 0.01，圖3A)。Res組的LDH漏出率明顯高于對(duì)照組(P 0.05或P 0.01)。隨著劑量的增加，LDH漏出率也升高(圖3B)。2.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果顯示，Res作用12 h后，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為7.5 %，而20、40、80 mol/L的Res組細(xì)胞凋亡率分別是12.9%、19.4%、

17、30.9%，與對(duì)照組相比明顯增加，呈劑量依賴性(P 0.01)，相應(yīng)地，活細(xì)胞百分比從對(duì)照組的91.8% 分別下降到85.4%、76.9%、63.7%，而壞死細(xì)胞率則較低，80 mol/L組僅為5.4 %。這些結(jié)果說明Res促進(jìn)原代脂肪細(xì)胞的凋亡作用。2.5 有關(guān)因子或酶的蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Res組的Sirt1、胞漿Cytochrome C、Cleaved Caspase 9和Caspase 3的蛋白表達(dá)水平上升，細(xì)胞的總Cytochrome C表達(dá)水平也有一定程度的升高(圖5)。3 討 論3.1 白藜蘆醇促進(jìn)大鼠原代脂肪細(xì)胞凋亡研究發(fā)現(xiàn)，多種植物化學(xué)物質(zhì)

18、可促進(jìn)脂質(zhì)代謝，抑制脂質(zhì)合成，抑制前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，促進(jìn)前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的凋亡等，從而減少機(jī)體的脂肪堆積，這對(duì)于防治肥胖有重要意義。近年來，有關(guān)植物化學(xué)物質(zhì)對(duì)于前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的凋亡作用的研究成為熱點(diǎn)。作為一種植物化學(xué)物，Res可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，如通過對(duì)線粒體膜的破壞及Caspase家族相關(guān)蛋白的激活可導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞的凋亡，同時(shí)Res也能抑制肝癌細(xì)胞HepG2的生長(zhǎng)增殖且促進(jìn)其凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中，我們證實(shí)Res可以促進(jìn)大鼠原代脂肪細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞核體積縮小，出現(xiàn)固縮，晚期核質(zhì)高度濃縮融合成團(tuán)，染色質(zhì)發(fā)生邊集并斷裂成小分子的DNA片段。我們通過Hoech

19、st 33258熒光染料染色發(fā)現(xiàn)，Res處理過的脂肪細(xì)胞細(xì)胞核呈致密濃染的固縮形或碎塊狀熒光，部分細(xì)胞核碎裂，而DNA Ladder實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Res處理后電泳圖上出現(xiàn)“梯形條帶”，證實(shí)Res可促進(jìn)細(xì)胞染色質(zhì)DNA斷裂。LDH是存在于細(xì)胞漿內(nèi)參與糖酵解最后一步即丙酮酸和乳酸相互轉(zhuǎn)化時(shí)的一種催化酶。如果細(xì)胞膜受損，LDH會(huì)從細(xì)胞內(nèi)漏出，因此通過測(cè)定LDH漏出率可以間接評(píng)價(jià)細(xì)胞的凋亡程度。經(jīng)20、40、80 mol/L的Res作用后，脂肪細(xì)胞的LDH漏出率呈劑量依賴性升高，說明Res通過細(xì)胞凋亡作用破壞細(xì)胞膜的完整性。流式細(xì)胞儀測(cè)定的結(jié)果證實(shí)，Res可劑量依賴地升高脂肪細(xì)胞的凋亡率，而且細(xì)胞壞死

20、率相對(duì)較低，說明Res主要促進(jìn)細(xì)胞凋亡而非壞死。         3.2 白藜蘆醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能的機(jī)制線粒體凋亡途徑在細(xì)胞凋亡中起著重要作用，而Caspase家族是誘發(fā)和執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號(hào)分子。在細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，線粒體膜電位下降，釋放出細(xì)胞色素 C，進(jìn)一步剪切活化Caspase 9和Caspase 3，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡。研究證實(shí)，Res可經(jīng)由線粒體凋亡途徑，活化Caspase家族而促進(jìn)細(xì)胞凋亡：Res可抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖，引起細(xì)胞周期阻滯，同時(shí)下調(diào)線粒體膜電

21、位，增加Caspase 3的活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡;MCF-7細(xì)胞經(jīng)Res處理后，Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bcl-2/Bax比值下降，線粒體膜電位也下降，誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，但卻與Caspase家族的活化無關(guān)10。用Res處理腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，Caspase 3活性增加，而且Res誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡能被選擇性Caspase 3抑制劑(Z-DEVD-FMK)阻斷11。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)Res處理后細(xì)胞色素C、Cleaved Caspase 9和Caspase 3的蛋白表達(dá)都上升，說明Res可以經(jīng)由線粒體凋亡途徑，激活Caspase家族，從而導(dǎo)致脂肪細(xì)胞凋亡。在大量實(shí)驗(yàn)研究中，Res被發(fā)現(xiàn)可以增

22、加細(xì)胞Sirt1的表達(dá)12。Res可作為Sirt1的特異性激活劑，劑量響應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明，11 mol/L的Res可以使Sirt1的去乙酰作用增加一倍，而在100 200 mol/L濃度可使Sirt1的去乙酰效應(yīng)達(dá)到飽和13。Sirt1與基因轉(zhuǎn)錄沉默、細(xì)胞生長(zhǎng)周期調(diào)節(jié)、能量代謝包括糖異生和脂質(zhì)累積、胰島素分泌、血管生成、神經(jīng)保護(hù)、病毒感染以及壽命期限延長(zhǎng)等細(xì)胞生物學(xué)功能都有著密切的關(guān)系14。在影響細(xì)胞存活或凋亡方面，Sirt1同樣具有重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1主要定位于細(xì)胞核中，在凋亡信號(hào)刺激下，可通過去乙酰化作用于p53和FOXO3，促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡15。而在一些腫瘤細(xì)胞中，Sir

23、t1也被觀察到可在細(xì)胞漿中表達(dá)，細(xì)胞漿的Sirt1表達(dá)水平上升，可通過激活Caspase家族，促進(jìn)細(xì)胞凋亡16。研究表明，Res通過增加Sirt1表達(dá)，抑制前脂肪細(xì)胞的分化，也可促進(jìn)豬脂肪細(xì)胞的凋亡17-18。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Res升高脂肪細(xì)胞的Sirt1表達(dá)，Sirt1可能通過誘導(dǎo)線粒體的去極化，降低線粒體膜穩(wěn)定性，增加其通透性，使線粒體中細(xì)胞色素C釋放增加，從而逐步啟動(dòng)Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)和放大凋亡過程。但Sirt1如何作用于線粒體從而啟動(dòng)凋亡程序，Sirt1的下游蛋白是什么?這些機(jī)制有待進(jìn)一步的探討。綜上所述，Res可誘導(dǎo)原代脂肪細(xì)胞的凋亡，從而減少脂肪在機(jī)體的堆積?！緟⒖嘉墨I(xiàn)

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