懸浮細胞培養(yǎng)技術講義

1、懸浮細胞傳代及細胞計數一、細胞傳代實驗目的:掌握懸浮細胞傳代技術。進一步掌握細胞培養(yǎng)的操作技術。實驗原理:培養(yǎng)細胞生長一定時間后,需分離再培養(yǎng),否則細胞因生存空間不夠,細胞密度過大,致營養(yǎng)不足而引起細胞衰老、停止生長甚至死亡。為了維持細胞的存活和生長,必須進行再培養(yǎng),即將原培養(yǎng)瓶內細胞分離、稀釋、接種到新培養(yǎng)瓶內繼續(xù)擴大培養(yǎng)。實驗用品:(一儀器凈化工作臺、離心機、恒溫水浴箱、冰箱(4、-20、-70、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱;(二玻璃器皿吸管(彎頭、直頭、培養(yǎng)瓶、廢液缸、(三塑料器皿吸頭、槍頭、膠塞、移液管、15ml離心管、離心管架(四其他物品微量加樣槍、計數板、記號筆、移液槍(五試劑1640培

2、養(yǎng)液、PBS操作步驟:1.準備:打開培養(yǎng)液,PBS;取出離心管,擰開管蓋,管蓋倒放。從吸管筒中依次取出吸管,裝上吸頭,插入離心管備用。2.從培養(yǎng)箱內取出細胞,放在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)、密度。3.首先觀察培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)液量。用吸管分別吸出兩個孔中的細胞連同培養(yǎng)液,轉入離心管中。再另取一只吸管吸取PBS,放入培養(yǎng)板孔中,輕輕吹打孔壁,吸出轉入離心管。4.離心,設置離心機1000轉/分,4-5分鐘。5.取出離心管,輕輕吸出上清,倒入廢液缸。吸取培養(yǎng)液約7ML放入離心管,輕輕吹打細胞,使之均勻懸浮。6.吸取1ML細胞懸液1ML轉入EP管中,備計數用。7.其余的細胞分別放入六個孔中,每孔約1ML。8.

3、吸取培養(yǎng)液加入板孔中至1/3孔容量。9.鏡下觀察細胞是否分布均勻,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。二、細胞計數及生長曲線測定培養(yǎng)細胞生長過程:潛伏期指數增生期停滯期潛伏期(latent phase細胞接種后,先經過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期.此時,細胞質回縮, 胞體呈圓球形.然后細胞貼附于載體表面,稱貼壁,懸浮期結束. 細胞貼壁速度與細胞種類, 培養(yǎng)基成分,載體的理化性質等密切相關。一般情況下,原代培養(yǎng)細胞貼壁速度慢,可達10-24 小時或更多, 而傳代細胞系貼壁速度快, 通常10-30 分鐘即可貼壁。細胞貼壁后還需經過一個潛伏階段,才進入生長和增殖期.原代培養(yǎng)細胞潛伏期長,約24-96 小時或更長,

4、連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短,僅需6-24 小時。(2 指數增生期(logarithmic growth phase這是細胞增殖最旺盛的階段,分裂相細胞增多。指數增生期細胞分裂相數量可作為判定細胞生長是否旺盛的一個重要標志。通常以細胞分裂相指數(Mitotic index, MI表示,即細胞群中每1000 個細胞中的分裂相數。一般細胞的分裂指數介于0.1%-0.5%,原代細胞分裂指數較低,而連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂相指數可高達3%-5%。指數增生期的細胞活力最好時期,是進行各種實驗最佳時期,也是凍存細胞的最好時機。在接種細胞數量適宜情況下,指數增生期持續(xù)3-5 天后,隨著細胞數量不斷增多、生長空

5、間減少,最后細胞相互接觸匯合成片。正常細胞相互接觸后能抑制細胞運動,這種現象稱接觸抑制現象(contactinhibition。而惡性腫瘤細胞無接觸抑制現象,能繼續(xù)移動和增殖,導致細胞向三維空間擴展,使細胞發(fā)生堆積(piled up。細胞接觸匯合成片后,雖然發(fā)生接觸抑制,但只要營養(yǎng)充分,細胞仍能進行增殖分裂,因此細胞數仍然在增多。但是,當細胞密度進一步增大,培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少,代謝產物增多時,細胞因營養(yǎng)枯竭和代謝產物的影響,導致細胞分裂停止,這種現象稱密度抑制現象(Density Inhibition。(3停滯期(Stagnate phase細胞數量達到飽和密度后,如不及時進行傳代,細胞就會

6、停止增殖,進入停止期。此時細胞數持平,故也稱平臺期(Plateau phase。停滯期細胞雖不增殖,但仍有代謝活動。如不進行分離傳代,細胞會因培養(yǎng)液中營養(yǎng)耗盡、代謝產物積聚、pH 下降等因素中毒,出現形態(tài)改變,貼壁細胞會脫落,嚴重的會發(fā)生死亡,因此,應及時傳代。實驗目的:1.能獨立的進行細胞技術,會繪制生長曲線,了解細胞生長的發(fā)育特性。2. 學習在科研中如何應用生長曲線實驗原理:生長曲線的測定(計數法是測定細胞絕對生長數的常用方法,也是判定細胞活力的重要指標,為培養(yǎng)細胞生物學特性的基本參數之一。一般細胞傳代之后,經過長短不同的潛伏期,即進入大量分裂的指數生長期。在細胞達到飽和密度后,停止生長,

7、進入平頂期,然后退化衰亡。為了準確描述整個過程中的細胞數目的動態(tài)變化,需連續(xù)對細胞進行計數,通常計數7天。為精確起見,一般每次計數三瓶細胞并取平均值。典型的生長曲線可分為生長緩慢的潛伏期,成平臺狀的平頂期及退化衰亡四個部分。以存活細胞數對培養(yǎng)時間做圖,即生長曲線。生長曲線常用于測定藥物等外來因素對細胞生長的影響。一般在對數期的1/3-1/2處加藥。細胞技術的時間和次數依實驗目的而定。另外,測定生長曲線的常用方法還有MTT法。計數板原理:當待測細胞懸液中細胞均勻分布時,通過測定一定體積懸液中的細胞的數目,即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。操作步驟:1. 將計數板及蓋片擦拭干凈,并將蓋片蓋

8、在計數板,放在鏡下觀察。2. 制備細胞懸液:細胞從培養(yǎng)板孔轉移到離心管,離心1000轉4-5分鐘,棄去上清,加入PBS至一定體積(1ML。3. 將細胞懸液吸出少許,滴加在蓋片邊緣,使懸液充滿蓋片和計數板之間,靜置3min,注意蓋片下不要有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中。4. 計算板四大格細胞總數,壓線細胞只計左側和上方的。然后按公式計算:細胞數/mL=四大格細胞總數/4×104說明:公式中除以4,因為計數了4個大格的細胞數。公式中乘以104因為計數板中每一個大格的體積為:1.0mm(長×1.0mm(寬×0.1mm(高=0.1mm3 而 1ml=1000mm3(注意

9、:鏡下偶見有兩個以上細胞組成的細胞團,應按單個細胞計算,若細胞團10%以上,說明分散不好,需重新稀釋制備細胞懸液臺盼蘭染色操作步驟:1、制備細胞懸液,放入EP管中。2、以1:1的比例加入0.4%臺盼蘭染液,染色2一3分鐘。3、吸取少許懸液涂于載玻片上,加上蓋片。4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數,計算細胞活力。凍存與復蘇一、哺乳動物細胞冷凍保存實驗目的:(1保存種子細胞,以便隨時取用。這是保存細胞的最主要目的。(2減少細胞被微生物污染的危險性。(3減少細胞之間交叉污染的危險性。(4減少細胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變。(5避免有限細胞系出現衰老或惡性轉化。實驗原理:細胞凍存及

10、復蘇的基本原則是慢凍快融,實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑,這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性,加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外,減少細胞內冰晶的形成,從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法,這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。實驗用品:(一儀器凈化工作臺、離心機、恒溫水浴箱、冰箱(4、-20、-70、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。(二玻璃器皿吸管(彎頭、直頭、培養(yǎng)瓶、玻璃瓶(250ml、100ml、廢液缸; (三塑料器皿吸頭、槍頭、膠塞、

11、移液管(10ml、15ml離心管、凍存管(12ml (四其他物品微量加樣槍、紅血球計數板、記號筆、移液槍。(五試劑1640培養(yǎng)液、DMSO(分析純K562細胞,慢性粒細胞白血病細胞系中的一種。操作步驟:1. 準備:打開培養(yǎng)液,PBS;取出離心管,擰開管蓋,管蓋倒放。從吸管筒中依次取出吸管,裝上吸頭,插入離心管備用。2. 配制凍存液:吸取9ML培養(yǎng)液放入離心管,用移液槍吸取1ML DMSO溶液,逐滴緩慢加入離心管中。最好把離心管插在冰中。2.從培養(yǎng)箱內取出細胞,放在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)、密度。3. 吸出 1 個孔中的細胞連同培養(yǎng)液，轉入離心管中。再另取一只吸管吸取 PBS， 放入培養(yǎng)板孔中，輕

12、輕吹打孔壁，吸出轉入離心管。 4. 離心，設置離心機 1000 轉 4-5 分鐘。取出離心管，輕輕吸出上清，倒入廢液 缸。輕輕吸出余下的培養(yǎng)液，注意勿吸出細胞沉淀。 5. 吸取 1ML 配制好的凍存液加入離心管，與細胞混勻后，轉入凍存管。 6. 標注： 標明細胞種類、凍存日期，凍存人。 7. 在 4冰箱中放置 30 分鐘； 然后轉入-20， 放置 30 分鐘； 然后再轉入-80 放置 1618 小時（或過夜）；最后放入液氮中長期保存。有條件的地方， 可用凍存盒。 注意事項： （1）凍存過程需緩慢 （2）凍存細胞必須處在對數生長期，活力大于90，無微生物污染。 （3）細胞濃度控制在：1×

13、;1075×107/ml。 （4）使用合適的細胞冷凍保護劑，以保護細胞在冷凍過程中免受冰晶破壞。目 前，最常用的冷凍保護劑是DMSO(二甲基亞砜，使用終濃度為510。但是， 有些細胞系不能用DMSO作為冷凍保護劑， 如人白血病細胞系HL-60。 因為， DMSO 能 誘導HL-60 細胞分化。 在這種情況下， 可選用其它冷凍保護劑， 如甘油 （glycele） , 羥乙基淀粉等。 （5）DMSO 稀釋時會釋放大量熱量。因此，DMSO 不能直接加到細胞液中，必須 事先配制。 細胞復蘇 操作步驟： （一）準備工作 1、37水浴 2、準備一個內裝5-10 ml 細胞完全培養(yǎng)液離心管 。 （二）復蘇 1、帶手套，用鑷子將細胞冷凍管從液氮中取出，迅速放入37水浴中，手持 凍存管不斷搖動。觀察完全解凍后移入超凈臺。冷凍管在水浴中解凍時，液面不 可超過凍存