分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)1

1、實(shí)驗(yàn)三 細(xì)胞傳代一、目的學(xué)習(xí)細(xì)胞傳代方法，擴(kuò)增細(xì)胞，建立細(xì)胞系。二、概述培養(yǎng)細(xì)胞傳代根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長的細(xì)胞用消化法傳代；局部貼壁生長的細(xì)胞用直接吹打可傳代；懸浮生長的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心別離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。三、材料一儀器1. 凈化工作臺2. 離心機(jī)3. 恒溫水浴箱4. 冰箱4、-205. 倒置相差顯微鏡6. 培養(yǎng)箱二玻璃器皿1. 吸管彎頭、直頭2. 玻璃瓶250ml、100ml3. 培養(yǎng)瓶4. 廢液缸（三） 塑料器皿1. 吸頭2. 槍頭3. 膠塞4. 15ml離心管5. EP管四其他物品1. 微量加樣槍2. 紅血球計(jì)數(shù)板五試劑1. D-H

2、anks液2. 小牛血清3. RPMI16404. 雙抗青霉素、鏈霉素5. 胰蛋白酶0.08%或EDTA或兩者混合液6. 1NHCl7. 4%NaHCO3四、操作步驟（一） 貼壁細(xì)胞的消化法傳代：1. 吸除或倒掉瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。2. D-Hanks液洗23次。3. 向瓶內(nèi)參加適量消化液胰蛋白酶或與EDTA混合液輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞外表，然后吸掉或倒掉消化液后再加適量新的消化液，輕輕搖動再倒掉大局部消化液，僅留少許進(jìn)行消化。也可不采用上述步驟直接加消化液進(jìn)行消化。4. 消化最好在37或室溫25以上環(huán)境下進(jìn)行。消化25min后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后

3、，應(yīng)立即終止消化。5. 吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶把殘留消化液沖掉，然后再加培養(yǎng)液。如僅用胰蛋白酶可直接加少許含血清的培養(yǎng)液，終止消化。6. 用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，吹打過程要順序進(jìn)行，從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束，以確保所有底部都被吹到，使細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液。吹打時動作要輕柔不要用力過猛。 7. 計(jì)數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。（二） 懸浮細(xì)胞的傳代懸浮細(xì)胞傳代可離心收集細(xì)胞后傳代，或直接傳代。離心傳代法：1. 將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到15ml離心管內(nèi)；2. 離心8001000rpm，5min；3. 棄去上清，

4、加新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管吹打形成細(xì)胞懸液；4. 計(jì)數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。直接傳代即讓懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清液吸掉1/22/3，然后用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后再傳代。(三)、局部貼壁細(xì)胞的傳代局部貼壁不牢的細(xì)胞，如Hela細(xì)胞等，不經(jīng)消化處理直接吹打可使細(xì)胞從壁上脫落下來，而進(jìn)行傳代。對絕大局部貼壁生長的細(xì)胞，因直接吹打?qū)?xì)胞損傷較大，細(xì)胞常有較大數(shù)量的喪失，因而需消化后，才能吹打傳代。五、考前須知1. 胰蛋白酶要預(yù)溫，溫度37左右為宜。2. 離心轉(zhuǎn)速要適宜，轉(zhuǎn)速過低，不能有效別離細(xì)胞，離心速度過大，時間過長，會擠壓細(xì)胞造成損傷甚至死亡。3. 要定時觀察細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)污染，應(yīng)及時

5、處理。審實(shí)驗(yàn)四 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇一、目的學(xué)習(xí)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的方法，掌握長期保存體外培養(yǎng)細(xì)胞的技術(shù)。二、概述細(xì)胞培養(yǎng)的傳代及日常維持過程中，在培養(yǎng)器具、培養(yǎng)液及各種準(zhǔn)備工作方面都需大量的消耗，而且細(xì)胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時進(jìn)行細(xì)胞凍存十分必要。細(xì)胞冷凍儲存在-70冰箱中可以保存一年之久；細(xì)胞儲存在液氮中，溫度達(dá)-196，理論上儲存時間是無限的。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的根本原那么是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性

6、，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，防止由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷。三、材料一儀器1. 凈化工作臺2. 離心機(jī)3. 恒溫水浴箱4. 冰箱4、-20、-705. 倒置相差顯微鏡6. 培養(yǎng)箱7. 液氮冰箱二玻璃器皿1. 吸管彎頭、直頭2. 培養(yǎng)瓶3. 玻璃瓶250ml、100ml4. 廢液缸三塑料器皿1. 吸頭2. 槍頭3. 膠塞4. 移液管10ml5. 15ml離心管6. 凍存管12ml四其他物品1. 微量加樣槍2. 紅血球計(jì)數(shù)板

7、3. 記號筆4. 醫(yī)用橡皮膏5. 移液槍五試劑1. D-Hanks液2. 小牛血清3. 培養(yǎng)液4. 雙抗青霉素、鏈霉素5. 胰蛋白酶0.08%6. 1NHCl7. 7.4%NaHCO38. DMSO分析純或無色新鮮甘油四、操作步驟一細(xì)胞凍存1. 配制含10%DMSO或甘油、1020%小牛血清的凍存培養(yǎng)液；2. 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長的細(xì)胞消化下來，懸浮生長的細(xì)胞那么直接將細(xì)胞移至15ml離心管中、；3. 離心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，參加適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5×106/m

8、l1×107/ml；5. 將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管11.5 ml；6. 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時間及操作者；7. 凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1-2/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25以下時，可增至-5-10/ min；到-100時，那么可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20冰箱2h ，然后放入-70冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。（二） 細(xì)胞復(fù)蘇1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37溫水中，并不時搖動令其盡快融化。2. 從37水浴中取出凍存管，翻開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻；3. 離心， 1000rpm，5min；4

9、. 棄去上清液，參加含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。五、考前須知1從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但最好為對數(shù)生長期細(xì)胞。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液；2將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護(hù)工作，以免凍傷；3凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。審實(shí)驗(yàn)五 細(xì)胞生長曲線、四唑鹽試驗(yàn)MTT比色試驗(yàn)一 細(xì)胞生長曲線一、目的學(xué)習(xí)細(xì)胞生長曲線的測定方法，觀察細(xì)胞生長根本規(guī)律。二、概述：細(xì)胞生長曲線是觀察細(xì)胞生長根本規(guī)律的重要方法。只有具備自身穩(wěn)定生長特性的細(xì)胞才適合在觀察細(xì)胞生長變化的實(shí)驗(yàn)

10、中應(yīng)用。因而在細(xì)胞系細(xì)胞和非建系細(xì)胞生長特性觀察中，生長曲線的測定是最為根本的指標(biāo)。細(xì)胞生長曲線的測定一般可利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行。三、材料一儀器1. 凈化工作臺2. 離心機(jī)3. 恒溫水浴箱4. 冰箱4、-205. 倒置相差顯微鏡6. 培養(yǎng)箱37、5%CO2、飽和濕度二玻璃器皿1. 吸管彎頭2. 培養(yǎng)瓶3. 玻璃瓶250ml、100ml4. 廢液缸三塑料器皿1. 吸頭2. 槍頭3. 24培養(yǎng)板4. 膠塞四其他物品1. 微量加樣槍2. 紅血球計(jì)數(shù)板五試劑1. D-Hanks液2. 小牛血清3. RPMI16404. 雙抗青霉素、鏈霉素5. 0.08%胰酶四、操作步驟1. 取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，采用一

11、般傳代方法進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液；2. 計(jì)數(shù)，精確地將細(xì)胞分別接種于2130個大小一致的培養(yǎng)瓶內(nèi)或培養(yǎng)孔以24孔培養(yǎng)板為宜，每瓶或孔細(xì)胞總數(shù)要求一致，參加培養(yǎng)液的量也要一致。3. 每天或每隔一天取出3瓶孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值。培養(yǎng)35d常要給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換液。4. 以培養(yǎng)時間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸對數(shù)，描繪在半對數(shù)座標(biāo)紙上，連接成曲線后即成該細(xì)胞的生長曲線。五、考前須知1 細(xì)胞生長曲線雖然最為常用，但有時其反映數(shù)值不夠精確，可有2030%的誤差，需結(jié)合其它指標(biāo)進(jìn)行分析。2 現(xiàn)在很多實(shí)驗(yàn)室利用培養(yǎng)板采用MTT法進(jìn)行生長曲線測定，較為簡便。3 標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞生長曲線近似“S形，一般在傳代后第一天細(xì)胞數(shù)

12、有所減少，再經(jīng)過幾天的潛伏適應(yīng)期，然后進(jìn)入對數(shù)生長期，到達(dá)平臺期后生長穩(wěn)定，最后到達(dá)衰老。4 在生長曲線上細(xì)胞數(shù)量增加1倍時間稱為細(xì)胞倍增時間，可以從曲線上換算出。二、四唑鹽試驗(yàn)MTT比色試驗(yàn)一、目的學(xué)習(xí)四唑鹽比色試驗(yàn)，檢測細(xì)胞存活和生長情況。二、概述四唑鹽是一種能接受氫原子的染料，簡稱MTT?；罴?xì)胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性的MTT復(fù)原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。三、材料一儀器1. 凈化工作臺2.

13、離心機(jī)3. 恒溫水浴箱4. 冰箱45. 倒置相差顯微鏡6. CO2培養(yǎng)箱7. 振蕩混合儀8. 酶聯(lián)免疫檢測儀9. 移液槍10. 電磁力攪拌機(jī)11. 微孔濾器二玻璃器皿1. 吸管2. 小燒杯100ml3. 廢液缸三塑料器皿1. 吸頭2. 槍頭3. 96孔培養(yǎng)板4. 15ml離心管5. 50ml離心管6. 膠塞四其他物品1. 微量加樣槍2. 紅血球計(jì)數(shù)板五試劑1. D-Hanks液2. 小牛血清3. RPMI16404. 雙抗青霉素、鏈霉素5. 0.08%胰酶6. 二甲基亞砜DMSO7. um的微孔濾器除菌，分裝，4保存?zhèn)溆?，兩周?nèi)有效。四、操作步驟1. 接種細(xì)胞：用0.08%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)

14、細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔103104個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200ul。2. 培養(yǎng)細(xì)胞：將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)時間取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?. 呈色：每孔參加MTT溶液5mg/ml20ul，37孵箱中繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。對于懸浮生長的細(xì)胞，需離心1000rpm，5min，然后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔參加150ul DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。4. 比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。以時間為橫軸，光吸收值為終軸繪制

15、細(xì)胞生長曲線。五、考前須知1 選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，對每一種細(xì)胞都應(yīng)測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，然后確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時間。2 防止血清干擾，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。3 設(shè)空白對照，與試驗(yàn)平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔。最后比色時，以空白孔調(diào)零。實(shí)驗(yàn)八核蛋白的免疫熒光定位一、目的學(xué)習(xí)免疫熒光定位技術(shù)，定位細(xì)胞核蛋白。二、概述 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是采用熒光素標(biāo)記的抗體(或抗原)作為探針，檢測待測組織、細(xì)胞標(biāo)本中的靶抗原(或抗體)，形成的抗原抗體復(fù)合物帶有熒光素，在熒光顯微鏡下，由于受高壓汞燈光源的紫外光照射

16、，熒光素發(fā)出明亮的熒光，這樣就可以分辨出抗原(或抗體)的所在位置及其性質(zhì)，并可利用熒光定量技術(shù)計(jì)算抗原的含量，以到達(dá)對抗原物質(zhì)定位、定性和定量測定的目的。三、材料1. 熒光顯微鏡 2. 22×3. 載玻片4. 100%甲醇5. 1% normal goat serum (NGS) in PBS6. 一抗：鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原抗體Proliferative cell nuclear antigen antibody, PCNA7. 二抗：FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgM四、操作步驟1. 在22×22mm的1.5號蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞。理想條件下細(xì)胞應(yīng)長到50%-70%集合。2. 在-2

17、0用100%甲醇固定細(xì)胞3分鐘。3. 用PBS + 1% NGS洗三次，每次10分鐘。4. 在濕盒里以適當(dāng)濃度的一抗室溫溫育1小時。如果用22×22mm蓋玻片，那么在蓋玻片上加30ul稀釋的抗體，并且將蓋玻片倒置在玻璃載玻片上，然后將載玻片放到濕盒里，在室溫溫育。5. 用PBS + 1% NGS洗三次，每次10分鐘。6. 在濕盒里與稀釋為4ug/ml的熒光標(biāo)記二抗室溫溫育1小時。7. 用PBS洗四次，每次10分鐘。8. 用封片劑將蓋玻片封在載波片上，用干凈的指甲油將蓋玻片封邊，防止蓋玻片滑動。五、考前須知1. 要在蓋玻片一邊角落做記號，以知道細(xì)胞在蓋玻片的那一面。2. 一抗的濃度需要

18、經(jīng)過實(shí)驗(yàn)摸索確定。審實(shí)驗(yàn)九TOTAL RAN 提取一、目的 掌握RNA的提取過程二、概述有亞硫氫胍及巰基乙醇時，制組織勻漿，可使內(nèi)源的RNA酶失活，n-月桂肌氨酸將核蛋白復(fù)合物變性。用酸平衡的苯酚：氯仿：異戊醇抽提后，RNA脫離DNA及蛋白，從混合液中層析到水相。抽提后，用異丙醇將RNA沉淀濃縮模板mRNA 的質(zhì)量直接影響到cDNA 合成的效率。由于mRNA 分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),容易受RNA 酶的攻擊反響而降解,加上RNA 酶極為穩(wěn)定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴(yán)格防止RNA 酶的污染,并設(shè)法抑制其活性,這是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。三、材料及試劑1. Invitrogen TriZOLRNA 提取試劑

19、盒2. 異丙醇3. 70酒精4. DEPC5. 低溫離心機(jī)四、操作步驟 1. 全血細(xì)胞：溶血：加300ul的肝素或EDTA二鈉抗凝的全血到含RBC Lysis Solution 900ul 的1.5ml EP管, 室溫靜置1min,期間，輕輕顛倒混勻10次。13000 16000 rpm離心20秒。棄上清液，將管底的白色沉淀用槍頭吹散，使白細(xì)胞在殘留的液體中懸浮。2. 組織細(xì)胞：將凍存或新鮮的組織，參加液氮讓組織塊完全冷凍，充分碾磨。參加1ml的TriZOL，分混勻，室溫靜置5min。3. 取106-7細(xì)胞參加1ml的TriZOL中，充分混勻，室溫靜置5min。4. 再參加200ul的氯仿，充

20、分混勻，室溫靜置5min。4，13000rpm離心15min。5. 取上清液500ul，參加等量的異丙醇。充分混勻室溫靜置5min。4，13000rpm離心10min。6. 棄上清液，參加75%的酒精500ul，4，13000 rpm離心10分鐘 。7. 棄上清液，參加20ul的DEPC水，混勻。8. 紫外分光光度計(jì)測定OD260/280，比值大于1.8即可。五、考前須知所有的組織中均存在RNA 酶,人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實(shí)驗(yàn)過程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換使用一次性手套。所用的玻璃器皿需置于枯燥烘箱中200烘烤2 小時以上。但凡不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用

21、0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理,再用蒸餾水沖凈。DEPC 是RNA 酶的化學(xué)修飾劑,它和RNA 酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反響而抑制酶活性。DEPC 與氨水溶液混合會產(chǎn)生致癌物,因而使用時需小心。試驗(yàn)所用試劑也可用DEPC 處理,參加DEPC 至0.1%濃度,然后劇烈振蕩10 分鐘,再煮沸15 分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否那么DEPC 也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA 活性。但DEPC 能與胺和巰基反響,因而含Tris 和DTT 的試劑不能用DEPC 處理。Tris 溶液可用DEPC 處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌,可用DEPC 處理水配制,并盡可能用

22、未曾開封的試劑。除DEPC 外,也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復(fù)合物、RNA 酶抑制蛋白等。此外,為了防止mRNA 或cDNA 吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需經(jīng)硅烷化處理。細(xì)胞內(nèi)總RNA 制備方法很多,如異硫氰酸胍熱苯酚法等。許多公司有現(xiàn)成的總RNA 提取試劑盒,可快速有效地提取到高質(zhì)量的總RNA。別離的總RNA 可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特點(diǎn),當(dāng)RNA 流經(jīng)oligo (dT)纖維素柱時,在高鹽緩沖液作用下,mRNA 被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上,然后逐漸降低鹽濃度洗脫,在低鹽溶液或蒸餾水中,mRNA 被洗下。經(jīng)過兩次oligo(dT)纖維素柱

23、,可得到較純的mRNA。純化的mRNA 在70%乙醇中-70可保存一年以上。審實(shí)驗(yàn)十基因組DAN 提取一、目的 掌握提取DNA原理及方法二、概述 DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L。DNA在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA天然狀態(tài)的DNA 是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取DNA 時，先把DNP抽提出來，再把P除去，再除去細(xì)胞中的糖，RNA 及無機(jī)離子等，從中別離DNA 。 DNP和RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響而不同。DNP在

24、低濃度鹽溶液中，幾乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化鈉溶解度最低，僅為在水中溶解度的1%，隨著鹽濃度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化鈉中的溶解度很大，比純水高2倍。RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小，在氯化鈉中溶解度較大。因此，在提取時，常用此法別離這兩種核蛋白。苯酚/氯仿作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子外表又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，屢次重復(fù)操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA 。此法的特點(diǎn)是使提取的DN

25、A保持天然狀態(tài)，真核細(xì)胞DNA的別離通常是在EDTA及SDS一類去污劑存在下， 用蛋白酶K消化細(xì)胞獲得。諸多生物試劑公司現(xiàn)已有各種類型DNA提取試劑盒出售。三、材料及試劑1. GENTRO DNA提取試劑盒2. 異丙醇3. 70酒精四、操作步驟一、從全血中提取DNA1. 溶血：加300ul的肝素或EDTA二鈉抗凝的全血到含RBC Lysis Solution 900ul 的1.5ml EP管, 室溫靜置1min,期間，輕輕顛倒混勻10次。13000 16000 g離心20秒。2. 棄上清液，將管底的白色沉淀用槍頭吹散，使白細(xì)胞在殘留的液體中懸浮。3. 加300ul的Cell Lysis Sol

26、ution于EP管中, 充分混勻。4. 加100ul的Protein Precipitation Solution于EP管中, 充分混勻。13000 16000 g離心3分鐘 。5. 取上清液，加300ul的異丙醇，充分混勻顛倒50次，可見白色絮狀沉淀，13000 16000 g離心1分鐘 。6. 棄上清液，參加70%的酒精500ul，13000 16000 g離心1分鐘 。7. 棄上清液，參加DNA Hydration Solution 50ul, 充分混勻，655分鐘使DNA 完全溶解。8. 紫外分光光度計(jì)測定OD260/280，比值大于1.8即可。二、從組織中提取DNA9. 取液氮冷凍的

27、葉片2-3片， 在液氮冷凍下迅速研磨成粉末。10. 將粉末放入到1.5 ml離心管中，然后參加緩沖液“S750ul, 充分混勻。11. 將離心管置于65水浴中1-2小時，水浴過程中溫和混勻幾次。12. 取出離心管, 每管參加等體積的酚氯仿(V/V=1:1)溶液600-700ul，混勻后離心，10000rpm, 10分鐘。13. 上清液移入另一離心管中，參加等體積的氯仿，混勻后，10000rpm, 6分鐘。14. 將上清液移入另一離心管中，參加倍體積的異丙醇，輕輕混勻，靜置一段時間，然后用槍頭勾出DNA,并用70乙醇沖洗2次。15. 勾出的DNA，真空枯燥后將其溶于500ul 1x TE中。16

28、. 參加3ul RNA 酶溶液，37保溫1 小時。 17. 參加等體積的酚-氯仿溶液, 輕輕混勻后, 10000rpm離心6分鐘。18. 取上清液，參加等體積的氯仿，輕輕混勻后，10000rpm離心6分鐘。19. 取上清液，入1/10體積3M醋酸鈉，混勻后，參加2倍體積冷的無水乙醇或95乙醇。20. 輕輕混勻靜置一會兒后，用槍頭勾出DNA, 用70乙醇沖洗2次后，真空枯燥。21. 依所提DNA量參加20-50ul的1x TE溶解DNA。22. 測定DNA 的濃度，取少量樣品跑電泳, Agarose 膠的濃度為0.8%。23. 樣品在4下保存?zhèn)溆?。? 提DNA 所用試劑配方：1. 1. 1M

29、Tris.Cl   (1L：800ml H2O中加121.1g Tris, 用HCl調(diào)pH 至后定溶至1升， 滅菌)2. 0.5M EDTA pH8 (1L: 800ml H2O中加186.1g EDTANa2 2H2O，用NaOH調(diào) pH至，定溶至 1 升)3. 20% SDS    (2L: 在2L熱水中緩慢加 400g SDS， 邊加邊攪拌，溶解后放置熱地方保存)4. 5M NaCl (1L: 750ml H2O中加292.2g NaCl，溶解后定溶至1升， 滅菌)5. 5. 緩沖液“S 配1L緩沖液“S1) 100mM Tris.Cl pH8.5 1M T

30、ris.Cl 100ml2) 100mM NaCl 5M NaCl 20ml3) 50mM EDTA pH8.0 0.5M EDTA 100ml4) 2% SDS 20% SDS 100ml5) H2O 680ml6. 100x TE (1L: 800ml H2O中加121.1g Tris, 37.2 EDTA Na2 2H2O, 用HCl調(diào) pH至8.0, 定溶， 滅菌)7. 50x TAE(1L: 500ml H2O中加242g Tris，溶解后加和冰醋酸，定溶)8. 蛋白酶K溶液的配制(用20mMTris.Cl, pH8, 2mMCaCl2的緩沖液配制濃度為10ug/ul 的蛋白酶K溶液

31、； 或用超純水配制成相同的濃度)9. RNase (用水溶解RNase, 終濃度10mg/ml, 煮沸20分鐘，緩慢冷卻， 分裝，-20下 保存)10. 10. 3M NaAc pH5.2   (1L: 600ml H2O中參加408.24gNaAc 3H2O , 溶解后，用冰醋酸調(diào)pH至， 然 后定溶1L ，滅菌)五、考前須知不同要求時可選擇不同抽提方法提取DNA實(shí)驗(yàn)十二核酸純度、濃度與分子量測定一、目的了解測定核酸濃度、純度的原理和操作方法。二、概述凝膠電泳是別離和純化DNA片段最常用的技術(shù)。瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，45開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔

32、徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性條件下帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的DNA，其分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。線性DNA樣品在凝膠中的遷移率與DNA的對數(shù)值成反比，可在電泳中參加核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)來確定電泳后核酸的分子量。溴化乙錠(ethidium bromide，EB)是一種熒光染料，在凝膠電泳中，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下發(fā)出熒光,其強(qiáng)度與DNA量成正比。同時核酸最大吸收波長在260 nm，在此波長下，吸光度1 A相當(dāng)于一定濃度的核酸，可以通過A260/A2

33、80 的比值，來測定所得核酸的純度。三、材料 電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，點(diǎn)樣板，微波爐，瓊脂糖，TBE電泳緩沖液，TE buffer，溴化乙錠EB，載樣緩沖液，紫外分光光度儀，凝膠圖象分析儀等四、操作步驟一、紫外分光光度Spectrophotometer法：1. 將分光光度計(jì)翻開，預(yù)熱10分鐘。2. 將核酸溶液中取2µl，加或純水使體積成為100µl。3. 將稀釋溶液參加石英管，以TE buffer或純水為標(biāo)準(zhǔn)倒入另一管。4. 在波長260、280nm處測定吸光值。5. 比擬在260nm及280nm之讀值。三Ethidium bromide染色法：利用一系列不

34、同濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液0、5、10、20、30、40、50 ng/ml，或濃度的DNA marker，和未知濃度DNA樣品一起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以EB染色后，在凝膠圖象分析儀上觀察，比擬標(biāo)準(zhǔn)濃度及未知濃度的亮度，來求取DNA 的含量；比擬DNA樣品與DNA marker條帶位置，推知DNA 樣品分子量。實(shí)驗(yàn)步驟主要包括制膠、點(diǎn)樣以及電泳等過程。 1. ×TBE電泳緩沖液三角瓶中，搖勻，在微波爐上加熱至瓊脂糖完全溶解。參加溴化乙錠EB至終濃度0.5ug/ml，并搖勻。 2. 用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖倒入，室溫冷卻凝固。 3. ×TBE電泳緩沖液至

35、液面覆蓋凝膠1-2mm。4. 用移液器吸取DNA樣品8l與 2l 的載樣緩沖液混勻，小心參加點(diǎn)樣孔，藍(lán)色樣品混合物將沉入點(diǎn)樣孔下部。同時點(diǎn)10l DNA Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。 5. 翻開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到條帶由負(fù)極向正極移動，約半小時后即可觀察。 6. 在凝膠圖象分析儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)比擬被擴(kuò)增產(chǎn)物的大??；同時比擬標(biāo)準(zhǔn)濃度及未知濃度的亮度，求取DNA 的含量。五、考前須知1、表示DNA/RNA的純度高。假設(shè)數(shù)值，表示純度低，這時由OD260測得的DNA含量較不可信，核酸溶液中含有較多蛋白質(zhì)，因此最好將前述所得核酸再重新抽取。2. 測定26

36、0nm吸光值，代表值如下：1) ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/ml2) ss DNA (single stranded DNA or simgle-stranded RNA) = 40 mg/ml3) oligonucleotide = 33 mg/ml3. EB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。實(shí)驗(yàn)十五PCR及RT-PCR一、目的 掌握聚合酶鏈?zhǔn)椒错?PCR) 及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒错?RT-PCR)的根本方法二、原理 PCR用于擴(kuò)增位于兩段序列之間的DNA區(qū)段。在由Taq DNA聚合酶催化的一系列合成反響中，使用兩段寡核苷酸作為反響的引物。

37、一般情況下，這兩段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分別與模板DNA兩條鏈上的各一段序列互補(bǔ)，而這兩段模板序列又分別位于待擴(kuò)增的兩側(cè)。反響時它包括三個根本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA 片段在94下解鏈; (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA 聚合酶合成DNA 的最適溫度下,以目的DNA 為模板進(jìn)行合成.由這三個根本步驟組成一輪循環(huán),理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA 擴(kuò)增一倍圖4,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA 又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)25-35 輪循環(huán)就可

38、使DNA 擴(kuò)增達(dá)106 倍。 RNA的多聚酶鏈?zhǔn)椒错慠T-PCR是以RNA為模板，聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄反響reverse transcription, RT與PCR，可用于檢測單個細(xì)胞或少數(shù)細(xì)胞中少于10個拷貝的特異DNA，為RNA病毒檢測提供了方便；并為獲得與擴(kuò)增特定的RNA互補(bǔ)的cDNA提供了一條極為有利和有效的途徑。RNA擴(kuò)增包括兩個步驟：在單引物的介導(dǎo)下和逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成RNA的互補(bǔ)鏈cDNA；加熱后cDNA與RNA鏈解離，然后與另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成雙鏈靶DNA，最后擴(kuò)增靶DNA。 在RT-PCR中關(guān)鍵步驟是RNA的逆轉(zhuǎn)錄，cDNA的PCR與一般PCR條件一樣。由

39、于引物的高度選擇性，細(xì)胞總RNA無需進(jìn)行分級別離，即可直接用于RNA的PCR。但RT-PCR對RNA制品的要求極為嚴(yán)格，作為模板的RNA分子必須是完整的，并且不含DNA、蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)。RNA中即使含有極微量的DNA，經(jīng)擴(kuò)增后也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增；蛋白質(zhì)未除凈，與RNA結(jié)合后會影響逆轉(zhuǎn)錄和PCR；殘存的RNase極易將膜板RNA降解掉。硫氰酸胍GaSCN-CsCl法或酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法可提得理想的RNA制品，尤以后者方法為佳，適合一般實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種，即禽類成髓細(xì)胞性白血病病毒Avian myeloblastosis virus, AMV和莫洛尼鼠類白血病病毒Molon

40、ey murine leukemia virus, MO-MLV的逆轉(zhuǎn)錄酶RT。一般情況下用Mo-MLV-RT較多，但模板RNA的二級結(jié)構(gòu)嚴(yán)重影響逆轉(zhuǎn)錄時，可改用AMV-RT，因后者最適溫度為72，高于Mo-MLV-RT的最適溫度37，而較高的反響溫度有助于消除RNA的二級結(jié)構(gòu)。 一步法擴(kuò)增one step amplification是為了檢測低豐度mRNA的表達(dá)，利用同一種緩沖液，在同一體系中參加逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、Taq酶、4種dNTP直接進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)Taq酶不僅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙重作用在同一體系中直接以mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和其

41、后的PCR擴(kuò)增，從而使mRNA的PCR步驟更為簡化，所需樣品量減少到最低限度，臨床小樣品的檢測非常有利。用一步法擴(kuò)增可檢測出總RNA中小于1ng的低豐度mRNA。該法還可用于低豐度mRNA的cDNA文庫的構(gòu)建及特異cDNA的克隆，并有可能與Taq酶的測序技術(shù)相組合，使得自動反轉(zhuǎn)錄、基因擴(kuò)增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測序在一個試管中進(jìn)行。三、材料一、儀器1. DNA擴(kuò)增儀，亦稱PCR儀2. 臺式高速離心機(jī)3. 電泳儀、電泳槽4. Pharmacia Biotech公司的ImageMaster VDS凝膠成像儀二、塑料器皿Eppendorf管、Tip頭三、其他物品1. 微量加樣槍(0.510 ul、540

42、ul和40200各1支)2. Eppendorf管架四、DNA模板 含有靶序列的DNA可以單鏈或雙鏈形式參加PCR混合液。雖然DNA的大小并不是關(guān)鍵的因素，但當(dāng)使用極高分子量的DNA(如基因組DNA)時，假設(shè)用切點(diǎn)罕見的限制酶(Sal I 或Not I)先進(jìn)行消化，那么擴(kuò)增效果更好，閉環(huán)靶序列DNA的擴(kuò)增效率略低于線狀DNA，因此用質(zhì)粒作反響模板時最好先將其線狀化，但這也不是非常必要。模板DNA中靶序列的濃度因情況而異，而且往往非實(shí)驗(yàn)者所能控制。盡管如此，仍值得按靶序列量遞減(1ng、等)的方式設(shè)置一組對照反響，以檢測擴(kuò)增反響的靈敏度是否符合要求。五、試劑1. 10×PCR緩沖液(不

43、含MgCl2)2. 5mmol/LdNTPs,4種dNTP每種濃度均為3. Taq DNA聚合酶(5u/ul)4. MgCl2，25mmol/L5. 5×TBE電泳緩沖液6. 10g/L溴化乙錠7. 1%2%瓊脂糖凝膠(濃度視待擴(kuò)增的DNA片段大小而定)8. 兩對套疊式引物四、操作步驟(一)、以DNA為模板的PCR擴(kuò)增反響1. 按以下次序，將各成分在0.2ml Eppendorf管中混合：1) 模板DNA(100mg/L) 5.0ul 2) 10×PCR緩沖液 5.0ul 3) 4.0 ul 4) 引物(5端,30pmol/L) 5) 引物(3端,30pmol/L) 6) MgCl2(25mmol/L) 7) Taq 酶(5u/ul) 。8) 用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積至50 ul 2. 將溶液混勻，15 000r/