疫苗學(xué)知識(shí)要點(diǎn)

1、疫苗緒論疫苗(Vaccine) ：疫苗是將病原微生物（如細(xì)菌、立克次氏體、病毒等）及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動(dòng)免疫制劑。 疫苗學(xué)(Vaccinology) ：一門關(guān)于疫苗理論、疫苗技術(shù)、疫苗研制流程、疫苗應(yīng)用、疫苗市場(chǎng)及疫苗管理與法規(guī)的學(xué)科。理論與實(shí)踐高度結(jié)合。疫苗與藥物的區(qū)別使用的人群不同：一般藥物主要用于患病人群，疫苗用于健康人 藥物的性質(zhì)：一般藥物主要為中藥、化學(xué)合成藥物和生物藥物，而疫苗均為生物藥物。 藥物作用：一般藥物主要減輕病痛，只有疫苗才能徹底控制和消滅疾病。疫苗的成份和特點(diǎn)疫苗的基本成分包括抗原、佐劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、滅活劑及其

2、他成分疫苗的成份和特點(diǎn)抗原：抗原是疫苗最主要的有效活性組分，是決定疫苗的特異免疫原性物質(zhì)。（疫苗效果）佐劑：又稱非特異性免疫增生劑。本身不具抗原性，但同抗原一起或預(yù)先注射到機(jī)體內(nèi)能增強(qiáng)免疫原性或改變免疫反應(yīng)類型 。殺菌劑/防腐劑：    用于防止外來(lái)微生物的污染。一般液體疫苗為避免在保存期間微量污染的細(xì)菌繁殖，均加入適宜的防腐劑。大多數(shù)的滅活疫苗都使用防腐劑，如硫柳汞、2苯氧乙醇、氯仿等。保護(hù)劑或穩(wěn)定劑：       為保證作為抗原的病毒或其他微生物存活并保持免疫原性，疫苗中常加入適宜的穩(wěn)定劑或保護(hù)劑，如

3、凍干疫苗中常用的乳糖、明膠、山梨醇等。滅活劑：          滅活病毒或細(xì)菌抗原的方法除了可用物理方法如加熱、紫外線照射等之外，也常采用化學(xué)方法滅活。常用的化學(xué)滅活試劑有丙酮、酚、甲醛等，這些物質(zhì)對(duì)人體有一定毒害作用，因此在滅活抗原后必須及時(shí)從疫苗中除去，并經(jīng)嚴(yán)格檢測(cè)，以保證疫苗的安全性。          疫苗在制備時(shí)還需使用緩沖液、鹽類等非活性成分。緩沖液的種類、鹽類的含量都可影響疫苗的效力、純度和安全性，因

4、此都有嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。疫苗的基本特點(diǎn)：免疫原性    免疫原性由疫苗的抗原所決定，指疫苗接種進(jìn)入機(jī)體后引起抗體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。影響免疫原性強(qiáng)弱的因素包括機(jī)體的因素和疫苗的因素。安全性    安全性包括疫苗本身的安全和接種的安全。大多數(shù)疫苗主要用于兒童和健康人群，因此其安全性要求極高。絕大多數(shù)國(guó)家以不允許因接種疫苗而發(fā)生的死亡率超過(guò)百萬(wàn)分之一作為安全標(biāo)準(zhǔn)之一。      穩(wěn)定性        疫苗必須保持

5、穩(wěn)定，以保證經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的疫苗貯存和冷藏運(yùn)輸過(guò)程后疫苗仍能保持有效的生物活性。穩(wěn)定性是衡量疫苗質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。   廣泛應(yīng)用性    當(dāng)某種傳染病流行時(shí)，對(duì)流行區(qū)域的健康人群和易感者進(jìn)行接種，在保護(hù)接種者個(gè)人的同時(shí)，隨著接種人數(shù)的增加，當(dāng)產(chǎn)生免疫的人數(shù)達(dá)到人群的80以上時(shí)，整個(gè)人群形成一個(gè)免疫屏障，形成群體免疫，避免疾病的流行與傳播。第二章第二章 疫苗學(xué)的基礎(chǔ)一、疫苗學(xué)的微生物基礎(chǔ)二、疫苗學(xué)的免疫學(xué)基礎(chǔ)三、疫苗學(xué)的傳染病學(xué)基礎(chǔ)1、細(xì)菌的致病性（1）病原菌（pathogenic bacteria）： 可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病的細(xì)菌。 條件致病

6、菌（conditional pathogenic bacteria ）： 正常條件下對(duì)宿主不呈現(xiàn)致病作用，當(dāng)機(jī)體抵抗力低下的時(shí)候可以致病。（eg.金黃色葡萄球菌）1、細(xì)菌的致病性（1）病原菌（pathogenic bacteria） 寄生：據(jù)大多數(shù)病原菌 腐生：產(chǎn)生毒素 食物 中毒 （eg.肉毒梭菌）（2）致病性（pathogenicity）： 病原菌在特定條件下引起宿主疾病。 毒力（virulence）： 致病力的強(qiáng)弱。 強(qiáng)毒、弱毒（減毒）、無(wú)毒 毒力因子：致病力的物質(zhì)基礎(chǔ)。 侵襲力 毒素（3）細(xì)菌致病的3個(gè)步驟：黏附 定殖 擴(kuò)散2、細(xì)菌的致病機(jī)制 致病機(jī)制歸根結(jié)底是由于致病相關(guān)基因決定的，

7、這些致病相關(guān)基因組成10-20kb的DNA片段，稱為致病島。（1）侵襲力（invasiveness）:病原體突破皮膚、粘膜生理屏障，在體內(nèi)定居、繁殖和擴(kuò)散。侵襲力的物質(zhì)基礎(chǔ)表面結(jié)構(gòu)： 莢膜、黏附素、菌毛侵襲蛋白：酶（2）細(xì)菌毒素（toxin）： 細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生和釋放的毒性物質(zhì)。 損傷宿主細(xì)胞 干擾生理功能一、疫苗學(xué)的微生物學(xué)基礎(chǔ)（一）細(xì)菌的致病性與毒力因子內(nèi)毒素外毒素來(lái)源革蘭陰性菌革蘭陽(yáng)性菌及少數(shù)革蘭陰性菌產(chǎn)生方式細(xì)菌崩解后釋放合成分泌到菌體外的化學(xué)成分脂多糖（LPS）蛋白質(zhì)穩(wěn)定性較穩(wěn)定，耐熱不穩(wěn)定，易被熱、酸和消化酶滅活毒性作用弱，對(duì)組織無(wú)選擇性，各種內(nèi)毒素毒性作用相似強(qiáng)，對(duì)組織細(xì)胞有高

8、度選擇性，并能引起特殊的病變和癥狀醫(yī)學(xué)抗原性弱，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體作用弱強(qiáng)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗毒素，經(jīng)0.3%0.4%甲醛液作用成類毒素2、細(xì)菌的致病機(jī)制（2）細(xì)菌毒素（toxin）： 內(nèi)毒素的治療：抗體、內(nèi)毒素拮抗劑 外毒素的治療：抗毒素、類毒素抗毒素：外毒素刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，使抗體具有免 疫保護(hù)作用。 （破傷風(fēng)抗毒素）類毒素：用甲醛處理外毒素，去除有害作用，注射后使機(jī) 體產(chǎn)生抵抗細(xì)菌的能力。 （白喉類毒素，破傷 風(fēng)類毒素 ） 3、細(xì)菌毒力的測(cè)定（1）半數(shù)致死量（median lethal dose， LD50 ）： 是指能使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在感染后一定時(shí)限內(nèi)死亡一半所需要的微生物量。（2）半數(shù)感

9、染量（median infection dose， ID50 ）: 是指能使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在感染后一定時(shí)限內(nèi)感染發(fā)病一半所需要的微生物量。4、細(xì)菌干擾或逃避宿主的防御機(jī)制（1）抗吞噬作用 分泌蛋白酶 破壞吞噬細(xì)胞 抑制吞噬 多糖莢膜，菌毛 在巨噬細(xì)胞中生存（2）抗體液免疫 偽裝抗原 金黃色葡萄球菌 結(jié)合血纖維蛋白 白色念球菌 腎小球基底膜 腎小球腎炎 結(jié)合抗體 金黃色葡萄球菌 SPA 金黃色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A、簡(jiǎn)稱SPA)是細(xì)胞壁抗原的主要成分，幾乎90%以上的菌株均含有這種成分，但不同的菌株含量差別十分懸殊。SPA占整個(gè)細(xì)胞壁蛋白成分的6.7%，通過(guò)胞

10、壁肽聚糖以共價(jià)鍵與之結(jié)合。其它葡萄球菌如表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌不含SPA（二）病毒的致病作用1、病毒的傳播方式（1）水平傳播 病毒在人群不同個(gè)體間的傳播病毒侵入機(jī)體的三大重要門戶 皮膚 呼吸道 消化道（2）垂直傳播通過(guò)胎盤或產(chǎn)道，病毒由母親傳給胎兒的方式 胎盤 產(chǎn)道2、感染的類型隱性感染 不引起臨床癥狀向外播散病毒顯性感染 出現(xiàn)臨床癥狀 急性感染 持續(xù)性感染 慢性感染 病程長(zhǎng), 病毒可檢出 如HBV潛伏感染： 經(jīng)感染后，病毒基因存在于組織細(xì)胞中，可反復(fù)激活，急性發(fā)作病毒只有在急性發(fā)作時(shí)才被檢出如 HSV、VZV慢發(fā)病毒感染：潛伏期長(zhǎng)，發(fā)病后為亞急性進(jìn)行性直至死亡2、病毒的致病機(jī)理 殺細(xì)胞性

11、感染：多見(jiàn)于無(wú)包膜病毒 穩(wěn)定狀態(tài)感染：多見(jiàn)于有包膜病毒 整合感染：多見(jiàn)于腫瘤病毒 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞的增生和轉(zhuǎn)化 免疫系統(tǒng)紊亂3、抗病毒免疫（1）非特異性免疫屏障作用巨噬細(xì)胞的作用干擾素非特異性免疫（2）特異性免疫：體液免疫：按種類：IgG IgM IgA 細(xì)胞免疫：抗病毒免疫的主要細(xì)胞T、NK二、疫苗學(xué)的免疫學(xué)基礎(chǔ)（一）體液免疫1、體液免疫： 所謂體液免疫（humoral immunity），即以B cells產(chǎn)生抗體來(lái)達(dá)到保護(hù)目的的免疫機(jī)制。 負(fù)責(zé)體液免疫的細(xì)胞是B細(xì)胞。體液免疫的抗原多為相對(duì)分子質(zhì)量在10,000以上的蛋白質(zhì)和多糖大分子，病毒顆粒和細(xì)菌表面都帶有不同的抗原，所以都能引起體液免

12、疫。2、體液免疫過(guò)程： 第一步：B細(xì)胞表面的受體分子與互補(bǔ)的抗原分子結(jié)合后，活化、長(zhǎng)大，并迅速分裂產(chǎn)生一個(gè)有同樣免疫能力的細(xì)胞群克隆(clone)、無(wú)性繁殖系。其中一部分成為漿細(xì)胞，產(chǎn)生抗體；一部分發(fā)展為記憶細(xì)胞(memory cell)。 第二步：在這一階段，抗原成為被作用的對(duì)象，效應(yīng)B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體可以與相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合，發(fā)揮免疫效應(yīng)， 體液免疫主要對(duì)抗細(xì)胞外感染。（二）細(xì)胞免疫指T細(xì)胞在接受抗原刺激后形成效應(yīng)T細(xì)胞和記憶細(xì)胞. 效應(yīng)T細(xì)胞與靶細(xì)胞特異性結(jié)合，使靶細(xì)胞通透性改變,滲透壓發(fā)生變化，最終導(dǎo)致靶細(xì)胞破裂死亡。殺傷特點(diǎn)：¡ 連續(xù)性殺傷¡ 特異性殺傷 細(xì)胞免疫

13、對(duì)抗胞內(nèi)感染。¡ MHC限制性（三）免疫記憶免疫記憶（ immunological memory ）：機(jī)體再次接觸同一種抗原后產(chǎn)生的增強(qiáng)性快速應(yīng)答，由記憶淋巴細(xì)胞承擔(dān)。 此外， 免疫記憶還具有抗原特異性和長(zhǎng)效性。免疫記憶的特點(diǎn)是具有抗原特異性和長(zhǎng)效性。記憶B細(xì)胞 10-60年（天花）記憶T細(xì)胞 10年（四）疫苗免疫劑量、途徑、次數(shù)及間隔1、免疫劑量適中 太低/太高 免疫耐受2、免疫途徑 以皮內(nèi)免疫最佳 皮下免疫次之 腹腔免疫和靜脈注射效果最差 口服易導(dǎo)致耐受 粘膜免疫（局部感染）選擇好的免疫佐劑皮下注射 皮內(nèi)免疫 靜脈免疫 腹腔免疫 口服免疫 粘膜免疫2、免疫次數(shù)和間隔 不同疫苗有所

14、不同 免疫次數(shù)2-3次 間隔時(shí)間3-4周 三、疫苗學(xué)的傳染病學(xué)基礎(chǔ)（一）傳染病的基本特征（p521.有病原體：每種傳染病都有其特異的病原體，包括病毒、立克次氏體、細(xì)菌、真菌、螺旋體、原蟲等。2.有傳染性：病原體從宿主排出體外，通過(guò)一定方式，到達(dá)新的易感染者體內(nèi)，呈現(xiàn)出一定傳染性，其傳染強(qiáng)度與病原體種類、數(shù)量、毒力、易感者的免疫狀態(tài)等有關(guān)。3.有流行性、地方性、季節(jié)性（1）流行性：按傳染病流行病過(guò)程的強(qiáng)度和廣度分為。 散發(fā)：是指?jìng)魅静≡谌巳褐猩⒃诎l(fā)生； 流行：是指某一地區(qū)或某一單位，在某一時(shí)期內(nèi)，某種傳染病的發(fā)病率，超過(guò)了歷年同期的發(fā)病水平； 大流行：指某種傳染病在一個(gè)短時(shí)期內(nèi)迅速傳播、蔓延，超

15、過(guò)了一般的流行強(qiáng)度； 暴發(fā)：指某一局部地區(qū)或單位，在短期內(nèi)突然出現(xiàn)眾多的同一種疾病的病人。（2）地方性：是指某些傳染病或寄生蟲病，其中間宿主，受地理?xiàng)l件，氣溫條件變化的影響，常局限于一定的地理范圍內(nèi)發(fā)生。如蟲媒傳染病，自然疫源性疾病。（3）季節(jié)性：指?jìng)魅静〉陌l(fā)病率，在年度內(nèi)有季節(jié)性升高。此與溫度、濕度的改變有關(guān)。4.有免疫性：傳染病痊愈后，人體對(duì)同一種傳染病病原體產(chǎn)生不感受性，稱為免疫。不同的傳染病、病后免疫狀態(tài)有所不同，有的傳染病患病一次后可終身免疫，有的還可感染?？煞譃橄聨追N感染現(xiàn)象。（1）再感染：同一傳染病在完全痊愈后，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，被同一種病原體感染。（2）重復(fù)感染：某種疾病在發(fā)病中

16、，被同一種病原體再度侵襲而受染。血吸病、絲蟲病、瘧疾最為常見(jiàn)。（3）復(fù)發(fā)：發(fā)病過(guò)程已轉(zhuǎn)入恢復(fù)期或接近痊愈，而該病原體再度出現(xiàn)并繁殖，而原癥狀再度出現(xiàn)。傷寒最為常見(jiàn)。 （4）再燃：臨床癥狀已經(jīng)緩解，但體溫尚未正常而又復(fù)上升、癥狀略見(jiàn)加重。多見(jiàn)于傷寒。（二）我國(guó)需要重視的傳染病我國(guó)目前部分傳染病發(fā)病率仍居高不下，如病毒性肝炎、流行性出血熱、細(xì)菌性痢疾等；部分曾被控制疾病出現(xiàn)流行擴(kuò)散趨勢(shì)，如肺結(jié)核、性病、血吸蟲病、脊灰；但一些新發(fā)傳染病也已在我國(guó)出現(xiàn)并造成流行，例如艾滋病、瘋牛病、SARS、禽流感、豬流感以及超級(jí)細(xì)菌。將來(lái)還有可能是南北極冰川中的遠(yuǎn)古病毒。（三）我國(guó)傳染病的分類國(guó)家法定傳染病分甲，乙

17、，丙三類。 甲類傳染病是指：鼠疫、霍亂。 乙類傳染病是指：傳染性非典型肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、脊髓灰質(zhì)炎、人感染高致病性禽流感、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、流行性乙型腦炎、登革熱、炭疽、細(xì)菌性和阿米巴性痢疾、肺結(jié)核、傷寒和副傷寒、流行性腦脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生兒破傷風(fēng)、猩紅熱、布魯氏菌病、淋病、梅毒、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾。 丙類傳染病是指：流行性感冒、流行性腮腺炎、風(fēng)疹、急性出血性結(jié)膜炎、麻風(fēng)病、流行性和地方性斑疹傷寒、黑熱病、包蟲病、絲蟲病，除霍亂、細(xì)菌性和阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉病。 疫苗接種的目的 正確的選擇疫苗（符合流行病學(xué)研究） 免疫程序 免疫接種人

18、員 免疫接種的對(duì)象（發(fā)燒、過(guò)敏、妊娠）第三章 疫苗的種類與研制技術(shù)一、疫苗的分類二、傳統(tǒng)疫苗及其研制技術(shù)三、現(xiàn)代疫苗及其研制技術(shù)四、腫瘤疫苗及其研制技術(shù)一、疫苗的分類（1）根據(jù)使用的對(duì)象：人用和獸用（2）研制技術(shù)：傳統(tǒng)和新型（3）抗原的來(lái)源：菌苗（類毒素）、毒苗、蟲苗（4）用途：預(yù)防和治療（5）根據(jù)預(yù)防疾病的種類：?jiǎn)蝺r(jià)、多價(jià)（聯(lián)合）（6）抗原的化學(xué)性質(zhì)：蛋白、核酸、多糖。（7）使用方法和接種途徑：注射疫苗、口服疫苗、滴鼻疫苗、滴眼疫苗、鼻噴疫苗、皮貼疫苗、氣霧疫苗、微膠囊疫苗、緩釋疫苗。（8）其他命名：T細(xì)胞疫苗、樹(shù)突細(xì)胞疫苗、植物疫苗、重組XXX疫苗。二、傳統(tǒng)疫苗及其研制技術(shù)（一）傳統(tǒng)疫苗的

19、主要類型 傳統(tǒng)疫苗包括滅活疫苗、減毒活疫苗和用天然微生物的某些成分制成的亞單位（組分）疫苗。 1、滅活疫苗(Inactivated vaccine) 滅活疫苗是用免疫原性強(qiáng)的病原微生物或其代謝產(chǎn)物，接種于動(dòng)物、雞胚、組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)繁殖后、經(jīng)滅活處理使其失去致病力，但仍保留完整的生物結(jié)構(gòu)和免疫原性。 疫苗中含有的菌體或病毒顆粒是“死”的，因此又稱作死疫苗。 2、弱毒疫苗（Attenuated vaccine） 弱（減）毒活疫苗是通過(guò)不同的方法手段，使病原體的毒力即致病性減弱或喪失后獲得的一種由完整的微生物組成的疫苗制品。因其中的微生物體是活的，因此也叫活苗。 3、亞單位（組分）疫苗 亞單

20、位疫苗（Subunit vaccine）（組分疫苗）指的是除去病原體中無(wú)免疫保護(hù)作用的有害成分，保留其有效的免疫原成分制成疫苗。 例如：研究者用化學(xué)試劑裂解流感病毒，提出其血凝素、神經(jīng)氨酸酶制成流感病毒亞單位苗；用腦膜炎球菌夾膜多糖制成亞單位疫苗。三類傳統(tǒng)疫苗的比較（二）傳統(tǒng)疫苗的研制技術(shù) 1、滅活疫苗研制技術(shù) （1）研制原則 用于制備滅活疫苗的菌（毒）種，應(yīng)該基本符合以下條件：必需具有很強(qiáng)的免疫原性，能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異的免疫力足以阻止相應(yīng)病原體的入侵或防止機(jī)體發(fā)生相應(yīng)的疾病；應(yīng)具有恒定的培養(yǎng)特性、生化特性、穩(wěn)定的遺傳性；應(yīng)易于在人工培養(yǎng)基上或持定的組織或細(xì)胞中培養(yǎng)并可進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)；在培養(yǎng)過(guò)

21、程中不產(chǎn)生或產(chǎn)生較小的毒性：制備類毒素的菌種在培養(yǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生大量的典型毒素；要針對(duì)不同的病原血清型選擇符合當(dāng)?shù)亓餍械木辏员ＷC所制造的疫苗具有良好的免疫效果，同時(shí)對(duì)同型菌、毒株要求選擇能產(chǎn)生最好保護(hù)效果的品種，對(duì)多血清型的病原則應(yīng)選擇抗原譜廣、保護(hù)面寬的血清型。（2）滅活劑的選用 滅活疫苗的制備技術(shù)主要是微生物病原體的培養(yǎng)、抗原的滅活與提純處理，其中滅活病原體是關(guān)鍵步驟之一。 疫苗滅活方法對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答會(huì)產(chǎn)生明顯影響現(xiàn)今生產(chǎn)滅活疫苗的滅活方法可分為物理和化學(xué)兩大類。 A、物理作用滅活 制備滅活疫苗最初采用的滅活方法是物理方法，主要有加熱、紫外線和射線滅活。 加熱滅活： 在19世紀(jì)末，基本上

22、都是采用加熱的方法對(duì)病原體進(jìn)行滅活。 加熱滅活法的原理是使蛋白質(zhì)變性從而使病原體失去傳染性。治療用布氏桿菌疫苗、傷寒疫苗同樣是通過(guò)加熱方法滅活的。紫外線滅活： 紫外線滅活主要是作用于病原體的DNA和/或RNA，使病原體的DNA形成TT二聚體，致使無(wú)法以此DNA為模板轉(zhuǎn)錄為mRNA，不能復(fù)制子代DNA與合成蛋白。從而使病原體失去感染性。 此種滅活方法的優(yōu)點(diǎn)是在DNA、RNA水平對(duì)病原體進(jìn)行滅活，最大限度地保留了抗原的完整性和免疫原性。射線滅活： 射線滅活（-射線照射 ）的原理是射線可直接破壞細(xì)菌和病毒的DNA或RNA，導(dǎo)致微生物死亡。射線滅菌的優(yōu)點(diǎn)是不升高滅菌產(chǎn)品的溫度、穿透性強(qiáng)、滅活效率高。

23、缺點(diǎn)是設(shè)備費(fèi)用較高，對(duì)操作人員存在潛在的危險(xiǎn)性。B、化學(xué)作用滅活 化學(xué)方法是現(xiàn)在應(yīng)用的主要滅活方法，使用的滅活劑有福爾馬林、丙酮、苯酚、ß-丙內(nèi)酯、乙烯亞胺 、雙乙烯亞胺等。甲醛： 福爾馬林是傳統(tǒng)的滅活劑，應(yīng)用最廣泛。 原理： 甲醛直接作用于細(xì)菌蛋白質(zhì)分子上的氨基（NH2）、硫氫基（SH）、羧基（COOH），生成次甲基衍生物，從而破壞細(xì)菌蛋白質(zhì)（尤其是酶類），但不明顯影響其免疫原性。 甲醛滅活菌體后，應(yīng)產(chǎn)生兩種免疫原：一類是天然的抗原，即構(gòu)象甲醛破壞的抗原，一類是被甲醛破壞后形成的新抗原。苯酚： 苯酚損害細(xì)胞的細(xì)胞膜使細(xì)菌溶解、蛋白質(zhì)變性、酶失活。通常用量為1-3%，細(xì)菌芽孢和病毒對(duì)

24、于苯酚的耐受性較強(qiáng)。 中和劑：2-3% 吐溫-80ß-丙內(nèi)酯 ： ß-丙內(nèi)酯（Beta-Propiolactone，BPL）現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于多種人和動(dòng)物疫苗的生產(chǎn)。其作用機(jī)理可能是作用于病原體的DNA和RNA，而不直接作用于蛋白。它能在機(jī)體內(nèi)完全分解為無(wú)毒性的ß-羥丙酸，這是一種人體內(nèi)脂肪代謝后的產(chǎn)物，對(duì)人體和動(dòng)物體無(wú)毒。缺點(diǎn)：本身具有致癌性， BPL可以改變?nèi)搜灏椎鞍椎男再|(zhì)，2、弱毒疫苗研制技術(shù) （1）利用病原自然弱毒株 某些傳染病的病原在自然界中存在著具有免疫原性的自然弱毒株。可以用于生產(chǎn)活疫苗。（2）異源免疫 異源免疫（heterologous immun

25、ity）選擇與病原有一定 “親緣”關(guān)系，在分類上同屬不同種，具有一定的交叉免疫原性，而天然宿主又不相同的微生物株系作為疫苗株。（3）人工在異源動(dòng)物或細(xì)胞上傳代致弱 在異源動(dòng)物體內(nèi)或組織細(xì)胞培養(yǎng)中連續(xù)傳代以減弱病原的致病性，以人工致弱的病原來(lái)制作活疫苗。到目前為止，用來(lái)預(yù)防人類和家畜傳染病的活疫苗的菌種和病毒種，大部分都以這種方式培育。（4）改變體外培養(yǎng)傳代的環(huán)境 在體外培養(yǎng)傳代病原株時(shí)，改變培養(yǎng)的溫度（提高或降低），或者在培養(yǎng)基中加入抑制病原的化學(xué)物質(zhì)或誘變劑以及在體外以射線處理病原微生物，這種環(huán)境不利于正常微生物的發(fā)育，但卻可能有利于某些突變株的發(fā)育，這些突變株在正常環(huán)境中不易生長(zhǎng)發(fā)育而死亡

26、，從而有助于弱毒株的培育。3、組分疫苗的研制技術(shù) 組分疫苗又可稱為裂解疫苗既可以是蛋白質(zhì)疫苗，也可以是多糖疫苗。 蛋白質(zhì)疫苗包括類毒素（滅活細(xì)菌毒素）和病毒裂解的亞單位或亞毒粒制品。 大多數(shù)多糖疫苗由來(lái)自細(xì)菌的純化了的細(xì)胞壁多聚糖組成。 結(jié)合多糖疫苗是將多聚糖用化學(xué)方法與蛋白質(zhì)連接而得到的疫苗，這種連接使多糖成為更有效的疫苗。三、現(xiàn)代疫苗及其研制技術(shù) 現(xiàn)代疫苗的主要類型： 現(xiàn)代疫苗包括合成多肽疫苗、基因工程疫苗、核酸疫苗、T細(xì)胞疫苗、樹(shù)突細(xì)胞疫苗以及避孕疫苗和腫瘤疫苗。 基因工程疫苗 基因工程亞單位疫苗 基因缺失疫苗 重組活載體疫苗（一）合成肽疫苗及其研制技術(shù) 1、概念 合成多肽疫苗（synt

27、hetic peptide vaccine）是用化學(xué)手段合成病原微生物的保護(hù)性多肽或表位并將其連接到大分子載體上，再加入佐劑制成的疫苗。優(yōu)點(diǎn)： （1）安全 （2）可在同一載體上連接多種保護(hù)性肽鏈或多個(gè)血清型的保護(hù)性抗原肽鏈。（如：口蹄疫合成肽疫苗、乙型肝炎和瘧疾合成肽疫苗 ） 缺點(diǎn)： 該類疫苗的缺點(diǎn)是制造成本較高。2、研制技術(shù)(1)多肽的化學(xué)合成 首先應(yīng)該確定天然抗原的氨基酸序列(基因測(cè)序)，選擇和確定有效肽段（中和抗體），并尋找該肽段所針對(duì)的抗原決定簇（計(jì)算機(jī)分析）。 其次應(yīng)選擇合適的合成方法。主要有兩個(gè)合成策略：片段濃縮法和固相合成法。 片段濃縮法是經(jīng)典的合成技術(shù)。首先合成數(shù)條小肽，經(jīng)純化

28、和去保護(hù)后結(jié)合成較長(zhǎng)的肽，直到最后所需的序列。 固相合成法是將肽鏈一端結(jié)合于固相載體上的方法，通過(guò)在N-末端逐步加上氨基酸的方法合成肽段。(2)載體的選擇合成的多肽可以聯(lián)接或結(jié)合到載體上。（蛋白質(zhì)、多聚體、脂多糖、脂質(zhì)體）選擇載體時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎，因?yàn)闄C(jī)體對(duì)載體的免疫應(yīng)答可能會(huì)掩蔽對(duì)肽的免疫應(yīng)答。 (3)與人體組織是否存在交叉反應(yīng)抗肽抗體可能與人體組織產(chǎn)生意想不到的交叉反應(yīng)，也可引發(fā)自身免疫反應(yīng)。 偶合或聚合反應(yīng)能產(chǎn)生新的表位，而僅僅評(píng)價(jià)肽單體不能解決該問(wèn)題。 因此，應(yīng)使用人體組織測(cè)定疫苗的最后配方及佐劑是否產(chǎn)生意外的交叉抗體。 （二）亞單位疫苗及其研制技術(shù) 1、概念基因工程亞單位疫苗又稱重組亞單位苗

29、（recombinant subunit vaccine），是指將病原體保護(hù)性抗原基因在原核或真核系統(tǒng)中表達(dá)，再以表達(dá)產(chǎn)物制成亞單位苗。 2、亞單位疫苗優(yōu)點(diǎn)（1）首先是安全性好，疫苗中不含有活性的完整病原體，接種后不會(huì)發(fā)生急性、持續(xù)或潛伏感染，可適用于一些不利于使用活疫苗的情況，如幼齡的動(dòng)物或人、妊娠動(dòng)物或人。（2）其次，這些疫苗減少或消除了常規(guī)活疫苗或死疫苗難以避免的熱原、變應(yīng)原、免疫抑制原。（3）亞單位疫苗所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以與感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相區(qū)別，因此更適合于疫病的控制和消滅計(jì)劃。（4）可以表達(dá)高度致病性的危險(xiǎn)病原體及難于進(jìn)行體外培養(yǎng)病原體的免疫原性蛋白質(zhì)，可大量發(fā)酵生產(chǎn)，增加了安全

30、性和抗原的生產(chǎn)效率。缺點(diǎn) 生產(chǎn)成本比較高（純化） 產(chǎn)品研發(fā)成本高 免疫接種成本高（多次注射）3、亞單位疫苗研制原則（1）免疫保護(hù)性基因的確定。（2）外源免疫保護(hù)性抗原表達(dá)系統(tǒng)的選擇。生物表達(dá)系統(tǒng)原核生物表達(dá)系統(tǒng)（大腸桿菌，乳酸菌，枯草桿菌）真核生物表達(dá)系統(tǒng)（酵母，絲狀真菌，哺乳動(dòng)物，昆蟲）（三）基因缺失疫苗及其研制技術(shù) 1、概念 基因缺失疫苗（deletion-mutant vaccine）是用基因工程技術(shù)將病毒或細(xì)菌的致病性基因進(jìn)行缺失，從而獲得弱毒株活疫苗。 2、基因缺失疫苗的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： （1）安全性好。 基因缺失疫苗的基因的變化，一般不是點(diǎn)突變。故其毒力更為穩(wěn)定，返祖突變機(jī)率更小

31、，疫苗安全性好。 （經(jīng)典技術(shù)培育的弱毒株常是基因點(diǎn)突變）。（2）免疫原性好 其免疫接種與強(qiáng)毒感染相似，機(jī)體可對(duì)病毒的多種抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答；免疫力強(qiáng)，免疫期長(zhǎng)，尤其是適于局部接種，誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫力，因而是較理想的疫苗。缺點(diǎn)： 基因缺失病毒在自然狀態(tài)下可能與野毒株發(fā)生重組或者發(fā)生核酸修補(bǔ)，使疫苗株原來(lái)缺失的基因恢復(fù)而重新獲得毒力。并且有的基因缺失疫苗對(duì)孕畜和仔畜的毒力偏高。 3、基因缺失疫苗研制原則 構(gòu)建基因缺失疫苗時(shí)，應(yīng)該保證缺失的基因?yàn)椴《净蚣?xì)菌復(fù)制的非必需基因，否則產(chǎn)生的病毒不具有復(fù)制能力。 四）重組活載體疫苗及其研制技術(shù) 1、概念 基因工程重組活載體疫苗（recombinant live

32、-vector vaccine）是用基因工程技術(shù)將 外源保護(hù)性抗原基因插入病毒或細(xì)菌（常為疫苗弱毒株）中使之表達(dá)的活疫苗。2、重組活載體疫苗的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： （1）具有活疫苗的免疫效力高、接種成本低的優(yōu)點(diǎn)。 （2）若選擇在毒力基因中插入外源基因，則弱毒株的毒力會(huì)進(jìn)一步降低，疫苗的安全性也更好。（3）可同時(shí)插入多個(gè)外源基因，構(gòu)建多價(jià)疫苗。缺點(diǎn)： （1）某些外源片斷表達(dá)效率低，而且容易丟失。（2）有時(shí)因機(jī)體對(duì)活載體的免疫反應(yīng)性質(zhì)，可限制再次免疫的效果。（痘病毒）3、重組活載體疫苗的種類重組病毒活載體疫苗 重組痘病毒活載體疫苗 重組腺病毒活載體疫苗 重組皰疹病毒活載體疫苗 重組小RNA病毒活載體

33、疫苗 重組細(xì)菌活載體疫苗 沙門氏菌、李斯特氏菌 乳酸菌 4、重組活載體疫苗研制原則 （1）載體的選擇載體的安全性。弱毒疫苗株在插入外源基因后可以使其致病力降低的細(xì)菌或病毒活載體（病毒或細(xì)菌）的組織嗜性應(yīng)該與其所表達(dá)外源抗原所屬微生物的組織嗜性相同或相近?；钶d體對(duì)外源基因的容量，不同病毒其外源基因含量不同，如果想要構(gòu)建多價(jià)疫苗需要一個(gè)基因組較大、容納外源基因較多的載體。 （如：痘病毒）（2）轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建構(gòu)建重組病毒活載體疫苗的關(guān)鍵是構(gòu)建一個(gè)成功轉(zhuǎn)移載體，利用其通過(guò)同源重組的作用將外源基因整合于載體病毒的基因組中。一個(gè)轉(zhuǎn)移性能良好的載體應(yīng)該具備以下條件：擁有足夠長(zhǎng)的同源臂序列（即供體和受體都具有

34、的相同的堿基序列）一般在800-1000bp左右，也有報(bào)道300bp就可以滿足同源重組的需求；一個(gè)適宜的啟動(dòng)子，啟動(dòng)子應(yīng)該與載體病毒相適應(yīng)，最好是載體病毒自身基因的啟動(dòng)子。（3）外源基因插入位點(diǎn)的選擇 原則上講外源基因的插入不應(yīng)該影響載體病毒或細(xì)菌自身的復(fù)制，所以外源基因應(yīng)該插入載體病毒或細(xì)菌基因組的非必需基因中。為了降低載體的致病力，還可以在不影響復(fù)制的情況下將外源基因插入到載體的毒力基因中。（五）核酸疫苗及其研制技術(shù) 核酸疫苗（nucleic acid vaccine）又稱基因疫苗，是指將編碼某種抗原蛋白的基因直接導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中表達(dá)并合成抗原蛋白，激起機(jī)體一系列類似于疫苗接種的

35、免疫應(yīng)答， 起到預(yù)防和治療疾病的目的。1、核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn)A、幾乎等同于感染病原體或弱毒疫苗免疫后所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。B、核酸疫苗具有共同的理化特性，。C、安全性好，D、制備簡(jiǎn)單，E 生產(chǎn)成本降低，并能加工干燥，便于儲(chǔ)藏和運(yùn)輸。2、核酸疫苗的研制技術(shù) 核酸疫苗是由編碼病原體抗原的基因和作為真核細(xì)胞表達(dá)載體的質(zhì)粒DNA組成。病原體抗原的基因單一病原體免疫保護(hù)性抗原基因多個(gè)病原體的免疫保護(hù)型基因編碼抗原決定簇的一段DNA序列質(zhì)粒DNA：用于構(gòu)建核酸疫苗的載體質(zhì)?；竟羌軉?dòng)子 增強(qiáng)子 3端多聚A信號(hào)（poly A）3、核酸疫苗的接種方式 核酸疫苗可以通過(guò)多種方式和途徑接種到機(jī)體的適當(dāng)部位，不同的接種方

36、式或途徑可影響其免疫效果。普通注射 動(dòng)物病毒和一般哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子：骨骼肌，如：股四頭肌和腓腸肌 乳清酸蛋白（WAP）啟動(dòng)子：乳腺和皮下脂肪 基因槍接種：將包裹在金粒上的質(zhì)粒DNA直接射入進(jìn)表皮細(xì)胞 （六）T細(xì)胞疫苗致病性T細(xì)胞 自身反應(yīng)性T細(xì)胞：引起自身免疫性疾病同種反應(yīng)性T細(xì)胞：導(dǎo)致同種移植排斥反應(yīng) 活化、滅活T細(xì)胞疫苗(T cell vaccination, TCV) 將自身反應(yīng)性T細(xì)胞或同種反應(yīng)性T細(xì)胞活化并滅活后作為疫苗。 可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)致病性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而消除或減輕這些細(xì)胞的致病作用。達(dá)到對(duì)自身免疫性疾病和對(duì)同種移植物排斥的防治作用。 傳統(tǒng)T細(xì)胞疫苗的應(yīng)用：用于治療系統(tǒng)性

37、紅斑狼瘡從患者血液中分離致病性T淋巴細(xì)胞 在體外培養(yǎng)形成T細(xì)胞克隆后，用射線照射經(jīng)皮下注射對(duì)患者進(jìn)行治療 首次注射后第2、6、8周重復(fù)注射治療評(píng)價(jià)此項(xiàng)治療的安全性和近期有效性方面均較理想，且一般無(wú)廣泛免疫抑制的副作用，其作用機(jī)制可能與注射后引起體內(nèi)自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞清除等相關(guān)。 與干細(xì)胞移植相比，T細(xì)胞疫苗在特異性、風(fēng)險(xiǎn)和費(fèi)用方面更具優(yōu)勢(shì)?；颊咴谥委熀螅R床癥狀和檢驗(yàn)指標(biāo)均有不同程度改善，系統(tǒng)性紅斑狼瘡病情活動(dòng)指數(shù)也得以下降。 現(xiàn)代依據(jù)MHC-I類分子特異的多肽結(jié)合基序合成的多肽在體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗原特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）將CTL克隆、

38、擴(kuò)增、篩選和鑒定后，注射入機(jī)體用于治療病毒性疾?。ㄆ撸?shù)突細(xì)胞疫苗1、樹(shù)突細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）是專職抗原遞呈細(xì)胞（APC），能有效地將抗原遞呈給T淋巴細(xì)胞，從而誘導(dǎo)CTL活化。 3、樹(shù)突細(xì)胞疫苗荷載抗原的DC具有疫苗的功能，故稱為樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗（dendritic cell vaccine）。 荷載抗原 病毒抗原HLA向CTL提呈病原體表位（8-10個(gè)氨基酸的短肽） 腫瘤細(xì)胞成分 編碼腫瘤的抗原 4、樹(shù)突細(xì)胞疫苗研制技術(shù)兩大關(guān)鍵步驟 獲得大量的DC細(xì)胞 A、 DC的分離 DC可以由CD34+或CD14+細(xì)胞中產(chǎn)生，存在于人骨髓、臍血和成年人外周血中的CD34+細(xì)

39、胞。 B、 DC的培養(yǎng) 添加必須的細(xì)胞因子：GM-CSF（granulocyte-macrophage colony stimulating factor, 粒/巨噬細(xì)胞集落刺激因子）flt3-L（flt3 ligand，酪氨酸激酶受體3配體） 致敏的DC 直接致敏 腫瘤提取物致敏DC 腫瘤細(xì)胞與DC的融合 腫瘤抗原肽或蛋白體外致敏DC核酸致敏DC ：腫瘤細(xì)胞來(lái)源的RNA致敏DC 基因轉(zhuǎn)染DC ：脂質(zhì)體、電穿孔及磷酸鈣 ；病毒載體（八）腫瘤疫苗1、腫瘤概述（1）免疫系統(tǒng)的功能對(duì)外防御 入侵的病原微生物/毒素 移植的外來(lái)細(xì)胞和組織對(duì)內(nèi)清潔 損傷衰老的細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞（2）腫瘤的概念腫瘤（Tumor

40、）是機(jī)體中的正常細(xì)胞在各種外部致病因素和內(nèi)部遺傳因素的長(zhǎng)期共同影響和作用下，發(fā)生過(guò)度增生和異常分化所形成的新生物。2、腫瘤與免疫系統(tǒng)（1）腫瘤抗原腫瘤抗原（tumor antigen）泛指在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中新出現(xiàn)或過(guò)度表達(dá)的新抗原物質(zhì)。 腫瘤特異性抗原：只存在于腫瘤細(xì)胞而不存在與正常細(xì)胞 腫瘤相關(guān)抗原：存在與腫瘤細(xì)胞與某些正常細(xì)胞 （2）腫瘤免疫細(xì)胞免疫為主，體液免疫為輔體液免疫激活補(bǔ)體系統(tǒng)溶解腫瘤細(xì)胞 抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用 抗體的調(diào)理作用 抗體封閉腫瘤細(xì)胞上的某些受體 抗體使腫瘤細(xì)胞的粘附特性改變或喪失 腫瘤細(xì)胞疫苗 腫瘤細(xì)胞疫苗是從機(jī)體腫瘤組織中提取腫瘤細(xì)胞，經(jīng)滅活處理后使瘤

41、細(xì)胞喪失致瘤性，但仍保持其免疫原性，然后對(duì)機(jī)體進(jìn)行主動(dòng)免疫。 通常采用在疫苗中加入誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子，如IL-2 、IL4和GM-CSF等。 （2）基因修飾腫瘤細(xì)胞疫苗 轉(zhuǎn)染分子有：MHC I 類分子 共同刺激信號(hào)B7分子 各種細(xì)胞因子及其受體（九）避孕疫苗又稱抗生育疫苗，是采取人工方法通過(guò)注射或口服生育相關(guān)抗原，在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體或免疫細(xì)胞，干擾精卵結(jié)合能力或阻止著床，造成一定時(shí)間內(nèi)可逆性的、無(wú)不良反應(yīng)的不孕的一類疫苗。人絨毛絨促性腺激素（hCG） 其作用與促黃體激素（LH）相似，可刺激和維持黃體功能，促使其分泌雌激素和孕酮，以維持子宮內(nèi)膜增生和形成蛻膜變化，有利于受精卵生長(zhǎng)。 下丘

42、腦促性腺釋放激素（GnRH） 是由下丘腦合成的一個(gè)10肽激素。它調(diào)節(jié)垂體的性腺激素：促黃體激素（LH）和促濾泡激素（FSH）的合成，是精子和卵子發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)性物質(zhì)。 促黃體生成素（LH） 由垂體產(chǎn)生的一種激素。在男性中能刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌男性雄激素，在女性中刺激卵巢分泌女性雌激素。 促濾泡激素（FSH） 作用于男性的生精上皮，刺激青春期男性精子的生成。作用于女性卵巢促進(jìn)卵泡顆粒層細(xì)胞增生分化，促進(jìn)卵巢長(zhǎng)大。 第四章 免疫佐劑一、免疫佐劑的概念免疫佐劑（immunoadjuvant）又稱佐劑或非特異性免疫增強(qiáng)劑。 其本身不具有抗原性，同抗原一起或預(yù)先注射到機(jī)體， 能增強(qiáng)抗原的免疫原性或者改變

43、抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)類型。二、免疫佐劑的簡(jiǎn)史弗氏完全佐劑 由石蠟油、去垢劑羊毛脂和滅活的分枝桿菌（卡介苗）組成的弗氏佐劑。 弗氏不完全佐劑 弗氏不完全佐劑用于加強(qiáng)免疫刺激。為了減少副作用，不含結(jié)核分枝桿菌成分。三、免疫佐劑的分類礦物質(zhì) 油乳佐劑 微生物佐劑 脂質(zhì)體和Novasomes中草藥類 細(xì)胞因子 藥物類佐劑生物降解聚合微球 四、免疫佐劑的作用機(jī)制1、抗原物質(zhì)與佐劑混合后，改變了抗原的物理性狀，可儲(chǔ)備抗原，使抗原物質(zhì)緩慢釋放，延長(zhǎng)抗原作用時(shí)間。2、佐劑吸附抗原后，增加抗原表面積，使抗原易于被巨噬細(xì)胞吞噬。3、佐劑能刺激吞噬細(xì)胞對(duì)抗原的處理，可與抗原提呈細(xì)胞（APC）作用促進(jìn)抗原的提

44、呈。4、佐劑可以增強(qiáng)免疫細(xì)胞之間的相互作用，增強(qiáng)輔助T細(xì)胞的作用，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。5、可刺激淋巴細(xì)胞分裂和漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體，使無(wú)免疫原性的物質(zhì)變成有效免疫原。6、改變抗體產(chǎn)生的類型以及產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)，并使其增強(qiáng)。7、提高機(jī)體初次免疫和再次免疫抗體的滴度。 第五章 疫苗的設(shè)計(jì)¢ 一、疫苗靶抗原的選擇¢ 二、疫苗靶抗原的表達(dá)設(shè)計(jì)¢ 三、疫苗靶抗原的純化設(shè)計(jì)¢ 四、疫苗流行病學(xué)設(shè)計(jì)一、疫苗靶抗原的選擇可以刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫保護(hù)性應(yīng)答的抗原物質(zhì)。免疫保護(hù)性抗原：一種病原體相關(guān)的抗原表位，能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，以抵御該病原體的感染。 對(duì)于全病原體疫

45、苗不需要考慮靶抗原選擇的問(wèn)題。需要考慮的是菌種和毒種的選育。抗原多肽選擇的基本原則1、盡可能是在蛋白表面 2、保證該段序列不形成-helix 3、N,C端的肽段比中間的肽段更好 4、避免蛋白內(nèi)部重復(fù)或接近重復(fù)段的序列 5、避免同源性太強(qiáng)的肽段 6、序列中不能有太多的Pro，但有一兩個(gè)Pro有好處，可以使肽鏈結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定一些，對(duì)產(chǎn)生特異性抗體有益。二、疫苗靶抗原表達(dá)系統(tǒng)設(shè)計(jì)1、目的基因的來(lái)源，如果是大腸桿菌來(lái)源的基因，選擇大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)較好，這主要是考慮到與目的基因來(lái)源相同的宿主對(duì)于保證蛋白的活性較有利且基因遺傳密碼的偏愛(ài)性較一致。2、生產(chǎn)

46、的成本和工藝放大要求。3、  研究周期和可操作性。4、蛋白的用途和用量5、  蛋白的天然性質(zhì)。大腸桿菌的分泌很難進(jìn)入培養(yǎng)基，通常是在周質(zhì)空間積累6、 知識(shí)產(chǎn)權(quán)的考慮三、疫苗靶抗原的純化設(shè)計(jì)滅活疫苗或減毒疫苗來(lái)源于經(jīng)減毒或滅活工藝而得的活病原體，疫苗由全顆粒菌體或病毒組成，其純制過(guò)程主要在于去除病毒核酸和雜蛋白，一般只涉及簡(jiǎn)單分離。四、疫苗流行病學(xué)設(shè)計(jì)（一）調(diào)查對(duì)象的選定1、地域分布2、高危人群3、易感年齡4、高發(fā)季節(jié)（二）現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查的設(shè)計(jì)原則重復(fù)、對(duì)照、隨機(jī)、雙盲（三）現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查時(shí)間初次免疫-傳染病流行的前1-2月加強(qiáng)免疫-傳染病流行的前1-2周（

47、四）觀察時(shí)期短期效果 一個(gè)流行季節(jié)/年度長(zhǎng)期效果 流行年度/更長(zhǎng)時(shí)間第六章 疫苗的檢定和評(píng)價(jià)正規(guī)的生產(chǎn)部門質(zhì)量保證（QA） 質(zhì)量保證就是按照一定的標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)產(chǎn)品的承諾、規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)量檢定（QC） 又稱質(zhì)量控制，是為了通過(guò)監(jiān)視質(zhì)量形成過(guò)程，消除質(zhì)量環(huán)上所有階段引起不合格或不滿意效果的因素。疫苗質(zhì)量檢測(cè)體外檢定（ in vitro） 體內(nèi)檢定（in vivo）疫苗的體外檢定疫苗的微生物學(xué)檢測(cè)疫苗的化學(xué)、物理和生物化學(xué)環(huán)節(jié)研制流水線測(cè)定 半成品 成品1、無(wú)菌檢驗(yàn)死苗的成品和半成品無(wú)細(xì)胞的疫苗：基因工程亞單位疫苗、 核酸疫苗、多糖疫苗 疫苗制造時(shí)的關(guān)鍵試劑A、抽樣原則：監(jiān)測(cè)方法的靈敏度和疫苗的有效使用

48、劑量。（不僅限于此項(xiàng)檢驗(yàn)）原液或半成品抽樣，應(yīng)該至少有總量的0.1%或者不少于10ml，每開(kāi)一次瓶，應(yīng)再抽樣一次； 成品超過(guò)20瓶，抽樣比例不少于10%；若每瓶裝1ml，則全部用于檢測(cè)。超過(guò)1ml抽取代表性比例，不超過(guò)10ml。 疫苗制造的無(wú)菌用水，應(yīng)在輸水線不同部位每日抽檢。B、無(wú)菌實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基用靈敏細(xì)菌作培養(yǎng)基有效性檢查。常用的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌：芽胞菌和無(wú)芽胞菌。C、培養(yǎng)方法不含防腐劑/殺菌劑：小于5ml/包裝，每批混合10個(gè)包裝單位大于5ml/包裝，每批混合7個(gè)包裝單位含防腐劑/殺菌劑：取液體培養(yǎng)基量2-5%的樣品檢菌陽(yáng)性： 1、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察、染色鑒定、生化鑒定 2、取雙倍樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)D、支

49、原體檢查需要進(jìn)行檢查的制品： 1、培養(yǎng)病毒的宿主細(xì)胞：主細(xì)胞庫(kù)，工作細(xì)胞庫(kù)； 2、病毒的種子批； 3、體外培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的活病毒在純化和過(guò)濾前的半成品； 4、體外培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的活病毒用于制備滅活疫苗，在滅活前半成品。細(xì)胞庫(kù)是用來(lái)培養(yǎng)生產(chǎn)連續(xù)多批生物制品的細(xì)胞系統(tǒng)。原始細(xì)胞庫(kù)主細(xì)胞庫(kù)工作細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞庫(kù)背景資料：1）來(lái)源：組織來(lái)源，培養(yǎng)方法，傳代過(guò)程，培養(yǎng)和保存情況及所用培養(yǎng)基等；2）特性：形態(tài)、生長(zhǎng)特性、倍增時(shí)間；3）遺傳特征：表型、基因特征、細(xì)胞核型及標(biāo)記染色體；若是生產(chǎn)用工程細(xì)胞，則需要有載體構(gòu)建資料或細(xì)胞融合資料，基因拷倍數(shù)，穩(wěn)定性等指標(biāo)；4）外源因子檢測(cè)報(bào)告：有無(wú)支原體、細(xì)菌、真菌、病毒和逆

50、轉(zhuǎn)錄病毒等污染。1、 原始細(xì)胞庫(kù)（Primary Cell Bank，PCB）：只作為種子細(xì)胞保存，一般情況不取出。是一定量經(jīng)過(guò)充分鑒定的原始細(xì)胞，組成均一，凍存于液氮罐內(nèi)，約10-20支。其中一支可用于制備主細(xì)胞庫(kù)。2 、主細(xì)胞庫(kù)(Master Cell Bank，MCB)：經(jīng)過(guò)充分鑒定一定量的由原始細(xì)胞庫(kù)篩選獲得的亞克隆細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)傳代次數(shù)810代，組成均一，凍存于液氮罐內(nèi)，用于制備工作細(xì)胞庫(kù)。3 工作細(xì)胞庫(kù)(Working Cell Bank，WCB)：由有限傳代水平的主細(xì)胞庫(kù)制備而來(lái)的均一性細(xì)胞，按生產(chǎn)條件傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)傳代次數(shù)8-10代，凍存于液氮罐內(nèi)用于生產(chǎn)，一旦移出后不再返回

51、原種子貯存庫(kù)中。4、雜病毒的檢查（1）組織培養(yǎng)法：選定無(wú)病毒的細(xì)胞系，連續(xù)傳代2-3次，接種待測(cè)樣品，用懷疑病毒的特異性抗體進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。（2）電子顯微鏡檢查。 （3）PCR或者RT-PCR檢查：病毒污染數(shù)量不多。 （4）接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，觀察發(fā)病情況。（二） 、疫苗的成份的化學(xué)、物理和生物化學(xué)測(cè)定依據(jù)：中國(guó)生物制品化學(xué)鑒定規(guī)范要求：靈敏、快速、準(zhǔn)確目的：區(qū)分有效成份和雜質(zhì)內(nèi)容：物理性狀、抗原含量、純度測(cè)定、有害物質(zhì)含量特點(diǎn)：每種制品要求不同，新增項(xiàng)目需要通過(guò)認(rèn)證并編 入規(guī)程。（一）疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià) 流行病學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn) 臨床實(shí)驗(yàn)新疫苗研制在做I期臨床實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

52、1、疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用最多的是小鼠1、價(jià)格便宜2、易于操控，可使用數(shù)量較多，用于統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果分析3、免疫背景和遺傳背景清晰選用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的原則：A、針對(duì)研究的目的安全性實(shí)驗(yàn)：對(duì)毒性物質(zhì)敏感的動(dòng)物免疫效果實(shí)驗(yàn)：免疫系統(tǒng)與疫苗應(yīng)用的目標(biāo)動(dòng)物 相近的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。（人，本動(dòng)物）B、接種途徑：模擬自然感染C、經(jīng)濟(jì)允許且可充分供應(yīng)：小動(dòng)物，長(zhǎng)期使用D、操作方便保護(hù)性免疫力實(shí)驗(yàn)：主動(dòng)保護(hù)性免疫力實(shí)驗(yàn) 不同劑量的疫苗以適當(dāng)途徑接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，適當(dāng)時(shí)間后，以適當(dāng)劑量的活病原體攻擊實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，與未免疫的正常動(dòng)物做對(duì)比，計(jì)算免疫組的發(fā)病率和致死率。被動(dòng)保護(hù)性免疫力實(shí)驗(yàn) 不同劑量的疫苗以適當(dāng)途徑接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，適當(dāng)時(shí)間后，取含抗體的血清或有免疫力的細(xì)胞接種同種或異種動(dòng)物，以適當(dāng)劑量的活病原體攻擊實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，與未免疫的正常動(dòng)物做對(duì)比，計(jì)算免疫組的發(fā)病率和致死率。（二）疫苗的安全性評(píng)價(jià)1、毒性實(shí)驗(yàn)：（毒理學(xué)）疫苗中的某些成份，會(huì)引起對(duì)機(jī)體或體外培養(yǎng)細(xì)胞的毒害性反映2、毒力實(shí)驗(yàn)：殘余毒力：病原微生物變異后失去了主要的致病力， 但有時(shí)仍能引起機(jī)體輕微的病理反應(yīng)。毒力返祖：病原微生物變異后失去了