高血壓病證結(jié)合動(dòng)物模型及其肝火亢盛證的生物學(xué)基礎(chǔ)研

1、高血壓病證結(jié)合動(dòng)物模型及其肝火亢盛證的生物學(xué)基礎(chǔ)研究-北京中醫(yī)藥大學(xué)2013年博士論文目的構(gòu)建穩(wěn)定的高血壓病證結(jié)合動(dòng)物模型,探尋臨床四診信息和模型動(dòng)物的相似性和關(guān)聯(lián)性,尋找能夠反映高血壓肝火亢盛證動(dòng)物模型相對(duì)應(yīng)的替代指征,明確其較為穩(wěn)定的證候時(shí)間窗。結(jié)合高血壓疾病與證候特征性基因共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)和高血壓病證候與理化指標(biāo)的文獻(xiàn)研究結(jié)果,建立高血壓肝火亢盛證宏觀與微觀相結(jié)合的特征性證候判別模式,初步揭示高血壓肝火亢盛證的生物學(xué)基礎(chǔ),為高血壓病的客觀化診斷提供依據(jù),為高血壓中醫(yī)藥研發(fā)及藥效學(xué)評(píng)價(jià)提供可靠的載體,搭建中醫(yī)基礎(chǔ)研究與臨床研究溝通的橋梁。方法1采用GenCLip2.0online platfor

2、m實(shí)時(shí)從Pubmed全文數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與原發(fā)性高血壓相關(guān)的所有文獻(xiàn),對(duì)高血壓病異常表達(dá)基因進(jìn)行功能聚類分析,構(gòu)建高血壓疾病和證候的特異性基因共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)。2結(jié)合KEGG通路富集分析、GO-ANALYSIS等文獻(xiàn)挖掘技術(shù),探尋高血壓密切相關(guān)基因調(diào)控通路及蛋白信號(hào)分子,進(jìn)一步構(gòu)建高血壓與應(yīng)激相關(guān)基因的共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)。3運(yùn)用復(fù)雜系統(tǒng)熵?cái)?shù)據(jù)挖掘技術(shù),對(duì)高血壓常見(jiàn)證型與理化指標(biāo)之間的復(fù)雜關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析,從密切關(guān)聯(lián)的指標(biāo)中探尋不同證型高血壓病的共性病理改變以及反映不同證型特有病理特征的核心指標(biāo)。4采用目前文獻(xiàn)報(bào)道的與人類原發(fā)性高血壓最為相似的2種高血壓疾病模型：自發(fā)性高血壓大鼠模型及應(yīng)激性高血壓大鼠模型,通過(guò)全面

3、動(dòng)態(tài)宏觀表征采集、行為學(xué)試驗(yàn)以及微觀理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)檢測(cè),進(jìn)行疾病的穩(wěn)定性評(píng)價(jià),并結(jié)合臨床四診信息與動(dòng)物表征的等效轉(zhuǎn)化,進(jìn)行證候?qū)傩缘谋孀R(shí)。5基于現(xiàn)代社會(huì)人們所遭受的各種慢性社會(huì)、心理應(yīng)激等高血壓危險(xiǎn)因子,分別給予高血壓肝火亢盛證大鼠慢性溫和應(yīng)激和反復(fù)強(qiáng)烈應(yīng)激,觀測(cè)其應(yīng)激狀態(tài)下的宏觀表征、行為學(xué)及微觀理化指標(biāo)的變化。6采用Elisa法檢測(cè)大鼠血清中文獻(xiàn)研究結(jié)果所提示的與高血壓證候密切相關(guān)的微觀理化指標(biāo),免疫組織化學(xué)法對(duì)大鼠腦區(qū)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行定位分析,高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行定量分析。7運(yùn)用氫核磁共振(1H-NMR)技術(shù)對(duì)高血壓肝火亢盛證大鼠及其應(yīng)激狀態(tài)下血漿中的內(nèi)源性小分子代謝

4、產(chǎn)物的進(jìn)行全面鑒定和差異性比較分析。結(jié)果1基因?qū)用娓哐獕杭膊∨c證候及應(yīng)激調(diào)控基因的文獻(xiàn)研究結(jié)果原發(fā)性高血壓(EH)密切相關(guān)前100位基因功能聚類分析結(jié)果：動(dòng)態(tài)血壓(晝夜節(jié)律)主要受ACE,AGT,AGTR1,ALB,AVP,B2M,CAT,CRP, EEF1A2,FLNA,LEP,NOVA2,PTH,REN,SOD1,TNF等基因調(diào)控；調(diào)控腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)系統(tǒng)及交感神經(jīng)系統(tǒng)活性的基因：ACE, ACE2, ADIPOQ, AGT, AGTR1, ALB, APOE, AVP, CCL2, CRP, CYP11B2, DBP, EDN1, EEF1A2, ELN, EPO, FOXD

5、3, HMGCR, ICAM1, IGF1, IL1B, IL6,REN等；與血管內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的基因有ACE,ADIPOQ, AGT, AKT1, ALB, APOE, B2M, CALCA, CAT, CCL2, CD59, CRP, MAPK1, MME, NOS1, NOS3等。EH密切相關(guān)基因KEGG_PATHWAY通路富集結(jié)果：Renin-angiotensin system:ACE, REN, ACE2, MME, AGT, LNPEP, AGTR1; Aldosterone-regulated sodium reabsorption: MAPK1, HSD11B1, NR3C

6、2, HSD11B2, IGF1, INSR; Cytokine-cytokine receptor interaction Calcium signaling pathway:EDNRA,AGTR1, ADRB2, NOS1, ADRB1, NOS3, NOS2, HTR2A; NOD-like receptor signaling pathway:MAPK1, CARD8, IL6, TNF, CCL2, IL1B。EH前100位基因中有61位基因與機(jī)體對(duì)外界應(yīng)激的反應(yīng)、機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)以及應(yīng)激保護(hù)等機(jī)制相關(guān),其中20位基因與機(jī)體對(duì)外界的應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。以高血壓密切關(guān)聯(lián)基因?yàn)楸尘盎?以高

7、血壓肝火亢盛證診斷標(biāo)準(zhǔn)中癥狀所對(duì)應(yīng)的西醫(yī)名稱為關(guān)鍵詞進(jìn)行基因聚類分析,發(fā)現(xiàn)其中與高血壓肝火亢盛證密切關(guān)聯(lián)的基因主要為RAAS系統(tǒng)關(guān)鍵級(jí)聯(lián)基因REN, ACE, AGT以及細(xì)胞色素P450家族CYP2D6。2微觀理化指標(biāo)層面高血壓證候相關(guān)理化指標(biāo)文獻(xiàn)研究結(jié)果文獻(xiàn)研究結(jié)果提示與高血壓肝火亢盛證型關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的理化指標(biāo)主要有超聲心動(dòng)、丙二醛、血栓素A2、前列腺素、血栓素B2、ACE、內(nèi)皮素等;甘油三酯、低密度脂蛋白、頸動(dòng)脈斑塊積分、高密度脂蛋白及頸動(dòng)脈內(nèi)膜中膜厚度等指標(biāo)與高血壓痰濕壅盛證型關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)提示該證型的脂質(zhì)代謝紊亂最為顯著；高血壓陰虛陽(yáng)亢證中24h動(dòng)態(tài)血壓信息量化值最大,提示改證型血壓變異性最

8、為顯著；而陰陽(yáng)兩虛證中與LEVF值的降低相關(guān)性最強(qiáng),提示該證型心功能下降最為顯著。3高血壓動(dòng)物模型疾病的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)：應(yīng)激性大鼠模型血壓隨應(yīng)激強(qiáng)度及時(shí)間的增加波動(dòng)明顯,血壓呈短暫性的升高,去除應(yīng)激因子2周后,血壓低于140mmHg診斷標(biāo)準(zhǔn)。其病情與應(yīng)激強(qiáng)度及時(shí)間有明顯的相關(guān)性,且有自然恢復(fù)趨勢(shì)。自發(fā)性高血壓大鼠12周齡時(shí)血壓已明顯升高SBP波動(dòng)在176mmHg,血壓隨周齡增長(zhǎng)持續(xù)升高,至14-18周齡達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定的水平,疊加反復(fù)強(qiáng)烈應(yīng)激后,血壓升高幅度更大。病情相對(duì)穩(wěn)定,因此可作為中醫(yī)證候觀察及中藥藥效學(xué)評(píng)價(jià)的首選模型。4高血壓動(dòng)物模型證候?qū)傩耘袆e：自發(fā)性高血壓大鼠于14-18周齡出現(xiàn)易激惹程度

9、評(píng)分明顯增加,旋轉(zhuǎn)耐受時(shí)間縮短,耳、爪部血管數(shù)量增多及充盈度增加,舌、爪部圖像R值升高、舌質(zhì)干少津、被毛干枯蓬亂,便質(zhì)干硬、排便時(shí)間延長(zhǎng),曠場(chǎng)試驗(yàn)總活動(dòng)距離、穿格次數(shù)及直立次數(shù)明顯增加。參照高血壓證候診斷標(biāo)準(zhǔn),基于臨床證候診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行動(dòng)物宏觀表征表征等效轉(zhuǎn)化的方法,初步認(rèn)為SHR14-18周齡符合肝火亢盛證的診斷標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)激性高血壓大鼠,組內(nèi)個(gè)體差異較大,應(yīng)激后大鼠血壓升高的程度與應(yīng)激時(shí)間并不同步,而宏觀表征及行為學(xué)等表現(xiàn)組內(nèi)差異更為明顯,癥狀輕重程度不一,證候的穩(wěn)定性、均一性較差。5高血壓肝火亢盛證大鼠及其應(yīng)激狀態(tài)下外周血管活性物質(zhì)差異性分析14-18周齡SHR(肝火亢盛證)大鼠血清Ang、N

10、E、TXB2、ET、NPY、HCY、CORT含量均與12、13、20周齡(非肝火亢盛證)相比有明顯差異,而5-HT、CGRP、6-Keto-PGF1等指標(biāo)未見(jiàn)明顯差異。高血壓肝火亢盛證大鼠應(yīng)激干預(yù)后血清中ET、Ane、HCY、NPY、5-HT、NE、CORT等水平明顯高于無(wú)干預(yù)組高血壓肝火亢盛證大鼠。6高血壓肝火亢盛證大鼠及其應(yīng)激狀態(tài)下中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量分析高血壓肝火亢盛證大鼠海馬組織內(nèi)除E含量與正常大鼠無(wú)明顯差異外,其他指標(biāo)NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT含量均較正常組大鼠顯著升高,且應(yīng)激狀態(tài)下高血壓肝火亢盛證大鼠NE含量升高更為顯著。7高血壓肝火亢盛證大鼠及其應(yīng)激

11、狀態(tài)下1H-NMR血漿代謝產(chǎn)物的比較分析1H-NMR圖譜及模式識(shí)別分析發(fā)現(xiàn)：自發(fā)性高血壓大鼠與正常組大鼠OPLS/O2PLS-DA積分矩陣圖沿第一主成分t(1)軸方向均可完全分開(kāi),且無(wú)明顯交叉和重疊,表明自發(fā)性高血壓大鼠與正常組大鼠血漿成分代謝產(chǎn)物譜有顯著性差異。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)14-18w高血壓肝火亢盛證大鼠給予應(yīng)激干預(yù)后：反復(fù)強(qiáng)烈應(yīng)激組與無(wú)干預(yù)組血漿成分代謝產(chǎn)物有明顯差異,而正常組大鼠給予應(yīng)激干預(yù)后不論是溫和應(yīng)激還是反復(fù)強(qiáng)烈應(yīng)激組血漿代謝產(chǎn)物與對(duì)照組相比均無(wú)明顯差異。結(jié)論1本研究采用文獻(xiàn)挖掘與數(shù)據(jù)挖掘相結(jié)合的方法,構(gòu)建了高血壓疾病基因網(wǎng)絡(luò),證候關(guān)聯(lián)基因及關(guān)聯(lián)微觀理化指標(biāo),從基因?qū)用婧臀⒂^理化指標(biāo)層面為高血壓證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究提供了新的方法。2選擇與人類原發(fā)性高血壓發(fā)病機(jī)制相似的自發(fā)性高血壓大鼠模型和應(yīng)激性高血壓大鼠模型,通過(guò)全面動(dòng)態(tài)宏觀表征采集和行為學(xué)評(píng)價(jià),以高血壓臨床證候診斷標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)進(jìn)行臨床信息與動(dòng)物表征的等效轉(zhuǎn)化,初步辨識(shí)其證候?qū)傩?并結(jié)合微觀理化指標(biāo)及代謝組學(xué)與證候的相關(guān)性分析,建立了宏觀表征與微觀指標(biāo)相結(jié)合的高血壓肝火亢盛證判別模式。3高血壓肝火亢盛證大鼠及其應(yīng)激狀態(tài)下微觀理化