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1、雞傳染性支氣管炎診斷技術(shù)和疫苗研究進展宋遠(yuǎn)鴻'，毛響德2(1.山東省蒼山縣畜牧局，山東蒼山277700；2,北京康牧獸醫(yī)藥械中心)中國圖書分類號:S858.31文獻標(biāo)識碼:A文章編號：1006799X(2011)01003404雞傳染性支氣管炎(AvianInfectiousbronchitis,IB)是由傳染性支氣管炎病毒(A.vianInfectiousbronchitisvirus,IBV)引起的雞的一種急性高度接觸性呼吸道疾病,主要以張口呼吸、咳嗽、氣管羅音、腺胃腫大、出血、“花斑腎”為主要特征。自1931年Schalk等首次報道了經(jīng)典的呼吸型禽傳染性支氣管炎(IB)并確定為病

2、毒性疾病以來，已有腸型、腺胃型、腎型等多種病型相繼報道。該病可感染所有日齡的雞，已發(fā)展成為影響?zhàn)B禽業(yè)發(fā)展的重要疾病之一，因此對該病的研究具有非常重要的意義。1IBV的檢測方法IBV新的血清型不斷增加和變異株的不斷出現(xiàn)，給IB的診斷和防制帶來了很大的困難。如何進行快速、準(zhǔn)確的診斷IB以及調(diào)整免疫程序是非常關(guān)鍵的。由于IB癥狀不典型，易與多種疾病混淆，IB的確診只能靠實驗室診斷,包括病毒的分離鑒定、血清學(xué)診斷方法等,也有些新興的分子生物學(xué)方法。1.1病原學(xué)診斷一般可根據(jù)病史從感染雞的氣管、肺臟、腎臟、扁桃體、泄殖脫等組織采樣，接種雞胚或氣管環(huán)進行病毒分離。一般認(rèn)為氣管是早期分離IBV的首選部位，但

3、感染后1014d就不易分離到。同時在消化系統(tǒng)，特別是盲腸、扁桃體組織或糞便中分離到病毒的成功率也是較高的。李康然等建議按如下程序分離IBV病毒效果較好:采集病料一過濾雙抗于4T46h后接種9-100齡雞胚48h后雞胚盲傳35代，HA檢查陰性,NDV干擾試驗陽性，侏儒胚陽性等進一步做IBV鑒定。然后還要根據(jù)理化特性、核酸型鑒定、生物學(xué)特性、血清學(xué)鑒定等進一步鑒定。1.2血清學(xué)診斷1.2.1瓊脂擴散實驗(AGP)：Roussan31證實以感染IBV的雞胚絨毛尿囊膜制備AGP抗原用以檢測IBV的抗體是可行的,且以感染1620h的材料制備抗原最佳。AGP具有足夠的靈敏性和特異性。AGP抗體陽性率與病毒

4、的致病性、病毒的感染劑量、雞的日齡及感染時抗體的存在狀態(tài)有關(guān)。1.2.2中和試驗(VN)：VN實驗是鑒定IBV的經(jīng)典方法，鑒定結(jié)果有很強的實際意義。中和試驗可在雞胚、雞胚腎細(xì)胞(CEKC)或氣管環(huán)培養(yǎng)物上進行，廣泛用于IB野毒株的分離和鑒定及血清分型。通過對IBV在CEKC和氣管環(huán)組織培養(yǎng)物上的適應(yīng)性的比較,認(rèn)為比CEKC更適用。但其也有操作復(fù)雜、費時、費力、價格昂貴、結(jié)果判斷具有主觀性等缺點。1.2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(EIJSA)：自1981年Junquardt首次成功應(yīng)用ELISA以來，ELISA廣泛應(yīng)用于IBV抗體的檢測。它比其他方法要靈敏,有研究證實它是VN實驗的23倍、AGP實驗的

5、188倍。江經(jīng)緯以致病性較強的傳染性支氣管炎毒株IBVM41株為研究對象，通過免疫保護試驗，抗體檢測試驗說明IBV人工發(fā)病模型可用于評價IB毒株的致病性和評價弱毒疫苗的保護效力，該ELISA方法可以用作檢測IB疫苗抗體水平。1.2.4免疫熒光法（IFA）：該法可用于抗原檢測及抗原組織定位的研究。檢測抗原的步驟:將病料滴在載玻片上，固定后，滴加IBV抗體,37P下在濕盒內(nèi)作用1h,沖洗20min,加入熒光素標(biāo)記的二抗，室溫下作用lh,沖洗如上，鏡檢。免疫熒光抗體法在檢測雞傳染性支氣管炎中具有快速、便捷的特點，尤其在IBV的抗原定位中應(yīng)用更為廣泛，而且結(jié)果的判定具有直觀性。朱建國等選用了一株反應(yīng)譜

6、廣的單抗作一抗，建立了單抗介導(dǎo)的間接熒光抗體法，用于檢測雞胚尿囊細(xì)胞中的IBV,其具有很高的特異性，能夠迅速做出定性檢測，應(yīng)用IFA鑒定IBV型特異性和群特異性抗原，準(zhǔn)確率達(dá)70%o2分子生物學(xué)診斷技術(shù)2.1RT-PCRRT-PCR技術(shù)是一種選擇性體外擴增DNA或DNA片段的方法，具有特異、快速、靈敏、簡便等優(yōu)點，目前該方法在NDV檢測和診斷中的應(yīng)用也很廣泛。將從商品肉雞場采取的IBV樣品，反轉(zhuǎn)錄成DNA后，用PCR擴增,然后用熒光定量PCR+HRM系統(tǒng)，檢測IBV3PTR從而得到了230435bp的目的產(chǎn)物。而對華東地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒M、N基因用RT-PCR檢測方法證明RT-PCR技術(shù)

7、具有敏感、特異、快速等特點，適用于不同來源及不同血清型IBV的檢測。2.2核酸探針該技術(shù)具有很高的敏感性。原理是利用合成的特異核酸探針與PCR擴增的待檢IBV基因片段雜交，如果IBV基因片段與已知核昔酸并標(biāo)記同位素的探針互補，則兩者結(jié)合,X底片就會顯影；反之則不顯影，具有很高的敏感性。Kwon應(yīng)用PCR和生物素標(biāo)記的DNA探針檢測了接種IBV的SPF雞氣管中的IBV基因組，證實此法比電鏡（EM）觀察病毒法要靈敏。以地高辛（DIG）標(biāo)記雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）pol基因的保守片段制成'核酸探針，結(jié)果表明，利用DIG探針檢測IBV的RT-PCR產(chǎn)物，特異性和敏感性強，可重復(fù)，能克服R

8、T-PCR非特異性反應(yīng)和探針Northern雜交的不穩(wěn)定性。利用核酸探針的群特異性，根據(jù)傳支病毒基因組中相對最為保守的N基因設(shè)計引物，檢測結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，且在檢測時，不需要特殊的儀器設(shè)備。因此，特別適宜于基層對IBV的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。3IBV的疫苗研究進展3.1IB弱毒疫苗弱毒疫苗是由抗原性很好的毒株通過雞胚連續(xù)25代以上傳代獲得的。一般以Mas-sachusetteIBV是世界范圍內(nèi)分布最廣泛的血清型，并且該型能對異型毒株也產(chǎn)生較好的免疫力，該血清型的H52、H120應(yīng)用最為廣泛,其次為Conn疫苗株?；钜呙绲膬?yōu)點是能有效刺激機體的體液與細(xì)胞免疫，方便生產(chǎn)且成本低。缺點是其致弱程度難

9、以掌握，疫苗的運輸、貯藏和使用等條件的要求高，但最主要的是疫苗株有一定的致病力和傳播能力,接種疫苗后引起輕度的呼吸道反應(yīng)，并且當(dāng)雞群中存在致病性支原體時，會成為慢性呼吸道病暴發(fā)激發(fā)因素。3.2IB核酸疫苗弱毒疫苗常常能有效地刺激機體的免疫系統(tǒng)，激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫兩種免疫力，且局部免疫后能引起較高的局部抗體（IgA）應(yīng)答。因此，在保護商品化產(chǎn)蛋雞方面具有良好的應(yīng)用價值。步志高等以克隆的國內(nèi)類M41地方流行株IBV纖突糖蛋白S1基因為免疫原基因，構(gòu)建了DNA免疫表達(dá)質(zhì)粒，并對其免疫原性進行了初步分析，結(jié)果表明，該表達(dá)質(zhì)?？赏瑫r誘導(dǎo)機體形成針對IBV的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。白天、王紅寧等通過對

10、傳染性支氣管DNA疫苗在雞體內(nèi)的分布與安全性檢測證實DNA疫苗的安全性好。唐夢君等將禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)的M基因和禽白介素18(IL-18)基因分別插入雙順反子質(zhì)粒pIRES-EGFP/DsRed中，構(gòu)建IBVM和IL-18基因的共表達(dá)質(zhì)粒pIRES-M/IL18及表達(dá)M基因的pIRES-M質(zhì)粒。結(jié)果表明，禽源IL-18基因與IBVM基因共表達(dá)可增強雞體對DNA疫苗的免疫應(yīng)答，提高對IBV強毒的抵抗力。3.3活病毒載體疫苗活病毒載體疫苗是用基因工程方法將一種病原免疫相關(guān)基因整合進另一種載體基因組DNA的復(fù)制非必須片段中構(gòu)成的重組活載體疫苗。常作為活載體疫苗的有禽痘病毒、皰疹病毒、反轉(zhuǎn)

11、錄病毒、轉(zhuǎn)基因植物等。如Zhou等用膿桿菌系統(tǒng)構(gòu)建含有IBVS1基因的載體轉(zhuǎn)化馬鈴薯，在馬鈴薯中表達(dá)了IBVS1糖蛋白并免疫鼠和雞，通過3次免疫后,免疫雞受到部分保護，此結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯表達(dá)的IBVS1糖蛋白也可作為防治IBV的疫苗。WangX等用重組雞痘病毒表達(dá)了M41株的S1基因，免疫雞受到部分保護。實驗結(jié)果表明，翅下免疫接種效果更好，另一方面，雞患急性傳染性支氣管炎時，誘導(dǎo)產(chǎn)生旺盛的細(xì)胞毒細(xì)胞活性，這種細(xì)胞反應(yīng)與感染疾病的最初下降有關(guān)。將共表達(dá)雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)Sl基因和雞干擾素)基因的重組雞痘病毒(rFPV-IFN)S1)接種4周齡SPF雞，免疫3周后用同源(LX4株

12、)及異源強毒株(LTJ951)攻毒，評價重組疫苗對異源病毒的保護作用。結(jié)果可以說明，重組疫苗能對同源強毒株產(chǎn)生較好的免疫保護，但不能對遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)的強毒株產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。4小結(jié)目前1BV的診斷方法有很多，其中RT-PCR技術(shù)是用于實驗室診斷最常用的方法之一,但是每一種方法均有其優(yōu)點和缺點，我們應(yīng)該根據(jù)實際需要，結(jié)合實際條件和操作經(jīng)驗，選擇適宜的檢測方法或?qū)追N方法結(jié)合，做出最終的判斷。IBV疫苗中的弱毒苗和滅活苗依然存在,像容易散毒,引發(fā)不同毒株間重組現(xiàn)象的發(fā)生，免疫持續(xù)時間短以及免疫效果差等不足。新興基因工程苗較傳統(tǒng)疫苗具有安全、省時、省力、能夠克服某些病原不能用傳統(tǒng)方法研制疫苗的弱點，

13、并具有誘人的研究價值和廣闊的應(yīng)用前景，但也仍存在免疫保護效果不佳、臨床效果不明等缺點。所以當(dāng)前生產(chǎn)上仍然采用減毒活苗和滅活苗為主相結(jié)合的方法去預(yù)防和控制該病。主要參考文獻1BoursnellME,BrownTD,FouldsIJ,etaLCompletionofthesequenceofthegenomeofthecoronavimsavianinfectiousbronchitisvinisfJ.JGeneVirol,1987,68：57-77.2 ZarirahMZulperi,AROmar,SSArshad.SequenceandphylogeneticanalysisofSI,S2,M

14、,andNgenesofinfectiousbronchitisvimsisolatesfromMalaysiaJ.VirusCenesetaL2009,38(3):383-391.3 RoussanDerghamA,Khawaldeh,aal.InfectiousbronchitisvirusinJordanianchickens：Seroprevalenceanddc-tectionJ.CanadianVeterinaryJournal,2009,50(1)：77-80.4 江經(jīng)緯，譚碧珊，解明.克隆和表達(dá)傳染性支氣管炎S蛋白復(fù)合抗原表位作為的備單克隆抗體的免疫原J.廣東畜牧獸醫(yī)科技,20

15、07,32(1):38-39.5朱建國.用單克隆抗體介序的熒光抗體技術(shù)檢測雞尿囊細(xì)胞內(nèi)傳染性支氣骨炎病毒的研究J.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,1996,1(1):6-8.6時莉，肖朝廷，宋空遠(yuǎn)，等.我國部分地區(qū)1996-2008年傳染性支氣管炎病毒分離株膜蛋白基因的遺傳變異與系統(tǒng)進化分析口.中國動物傳染病學(xué)報,2009,17(2)：31-37.植酸酶在生長豬飼料中的應(yīng)用研究付惠玲（平羅縣畜牧技術(shù)推廣中心，寧夏平羅753400）>中國圖書分類號:Q556文獻標(biāo)識碼:A文章編號:1006799X（2011）01-0037-05磷是生命體的重要組成部分，現(xiàn)代動物生產(chǎn)條件下，磷已成為配合飼料必須考慮的、添

16、加量較大的重要營養(yǎng)素。常規(guī)植物飼料原料中含磷十分豐富，但其中約2/3的磷是以植酸璘的形式存在的。豬、禽等單胃動物體內(nèi)缺少內(nèi)源植酸酶或植酸酶的活性極低，不能充分水解植酸磷。不能被單胃動物利用的植酸磷排泄出來后被環(huán)境中的微生物降解為無機磷，其中一部分通過地表徑流和滲透進入江河湖泊,造成水體的富營養(yǎng)化，導(dǎo)致藻類和其他浮游微生物大量生長繁殖，水體的溶氧量降低，水質(zhì)惡化，從而引起魚類和其它水生動物大量死亡，因此大量排放到環(huán)境中的磷會對生態(tài)平衡帶來很大的影響O植酸酶是催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸（鹽）的一類酶的總稱,屬磷酸單酯水解酶。植酸酶具有特殊的空間結(jié)構(gòu)，能夠依次分離植酸分子中的磷,將植酸（鹽）降

17、解為肌醇和無機磷，同時釋放出與植酸（鹽）結(jié)合的其它營養(yǎng)物質(zhì)。本文將從植酸酶的研究情況，對豬生長發(fā)育及其生理指標(biāo)的影響、影響植酸酶活性的因素等方面立體地對植酸酶做介紹。I植酸酶的研究歷史與現(xiàn)狀植酸酶（phytase）是一種專一性水解植酸成為肌醇與無機磷酸的單脂水解酶，主要存在于植物籽實中，最早由Suzuki于1907年在米糠中發(fā)現(xiàn)。1968年，植酸酶首次作為添加劑被應(yīng)用于飼料中，在促進動物生長、提高機體對植酸磷的利用效率等方面都表現(xiàn)出良好效果，因而受到人們的普遍關(guān)注（Nelson,1968）o此后,研究者對植酸酶在改善飼料轉(zhuǎn)化效率、降低糞磷排泄和促進機體對日糧養(yǎng)分如蛋白質(zhì)的吸收利用，促進動物生長等方面進行了研究,均取得良好效果。近年來，通過基因工程的方法獲得耐酸、耐熱的植酸酶工程菌是目前植酸酶的研究熱點。具體方法包括植酸酶新基因的克隆，植酸酶的分子改造，晶體分析和植酸酶的轉(zhuǎn)基因研究等。2