補腎益智方對老年性癡呆大鼠突觸傳遞長時程增強的影響

1、    補腎益智方對老年性癡呆大鼠突觸傳遞 長時程增強的影響         摘要：觀察補腎益智方(蛇床子、枸杞子、女貞子、人參等組成)對老年性癡呆(又稱阿爾茨海默病，Alzheimer's disease,AD)模型大鼠突觸傳遞長時程增強現(xiàn)象(long_term potentiation,LTP)的影響，旨在探討該方治療AD作用的神經(jīng)生物學機制。應(yīng)用D-半乳糖致亞急性衰老合并Meynert基底核損毀建立AD模型大鼠，用補腎益智方對AD大鼠灌胃治療4周，采用

2、電生理學方法，檢測大鼠海馬齒狀回強直刺激誘發(fā)的LTP的變化。結(jié)果表明：強直刺激后，各組間興奮性突觸后電位增強差異不明顯(P>0.05)，補腎益智方高、低劑量組群體峰電位幅度增強較模型組明顯提高(P<0.01或P<0.001)。提示補腎益智方對AD大鼠齒狀回LTP具有改善作用。主題詞：阿爾茨海默病/中藥療法；癡呆，老年性/中藥療法；補腎藥/治療應(yīng)用；補腎益智方/藥理學；海馬/藥物作用；突觸傳遞/藥物作用；疾病模型，動物；大鼠中分類號：R749.1+6文獻標識碼：A文章編號：1007-3213(2000)02-0109-04 學習記憶能力的損害是老年性癡呆(又稱阿爾茨海默病，Al

3、zheimer's disease,AD)患者重要的病理生理特點，至今對其仍無有效防治措施。本研究在采用現(xiàn)已公認的D-半乳糖致亞急性衰老作用1形成腦老化的基礎(chǔ)上，再以鵝膏蕈氨酸(ibotenic acid,IBO)損毀Meynert基底核(nucleus basalis of Meynert nbM)2建立AD大鼠模型，觀察補腎益智方對該AD模型大鼠海馬齒狀回突觸傳遞長時程增強(long_term potentiation,LTP)的改變，旨在探討補腎益智方的作用機制。1材料和方法1.1材料IBO，sigma公司產(chǎn)品；D_半乳糖，上海試劑二廠；石杉堿甲，上海紅旗制藥廠(批號為97010

4、1)；補腎益智方，由蛇床子、枸杞子、女貞子、人參等組成，經(jīng)廣東省中醫(yī)院制劑室制成1.2kg/L濃縮液。1.2分組、造模與給藥20月齡老年Wistar大鼠60只，分為老年正常對照組(N=10，簡稱正常組)和造模組(N=50)，造模結(jié)束后，存活的35只造模組大鼠再隨機分為模型對照組(N=10，簡稱模型組)、補腎方高劑量組(N=9，簡稱高劑量組)、補腎方低劑量組(N=8，簡稱低劑量組)和石杉堿甲對照組(N=8，簡稱石彬堿甲組)。所有大鼠均由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。造模組大鼠腹腔注射D-半乳糖6周(48mg.kg-1.d-1)，然后用IBO(5g/L)損毀雙側(cè)nbM3。手術(shù)后1周，高劑量組和低

5、劑量組大鼠分別灌胃高、低劑量的補腎益智方(相當于生藥6g.kg-1.d-1和生藥3g.kg-1.d-1)，石杉堿甲組以石杉堿甲灌胃(0.3mg.kg-1.d-1)，均連續(xù)灌胃4周。正常組均以生理鹽水進行腹腔和腦內(nèi)注射作為對照。1.3電生理學灌胃結(jié)束后，大鼠再以戊巴比妥鈉(35mg/kg)麻醉，固定于腦立體定位儀之上進行電極埋植手術(shù)。記錄電極植于齒狀回顆粒細胞層，刺激電極植于內(nèi)嗅皮層穿通通路(perforant path,PP)，參考電極為固定在顱骨上的小螺絲釘。記錄電極和刺激電極均緩慢插入，直到選一固定強度而能記錄出最大群體峰電位(population spike,PS)的部位。檢測刺激為單個

6、方波，波寬0.1ms，選取能誘發(fā)最大PS幅度1/21/3的強度。當PS值穩(wěn)定于基線至少15min后給予強直刺激(tetanic stimulation,TS)誘發(fā)LTP。強直刺激結(jié)束后，每隔3min檢測1次PS，電位疊加4次平均，記錄時間持續(xù)120min，電位由屏幕顯示、檢測，以PS峰值和興奮性突觸后電位(excited postsynaptic potentials,EPSPs)斜率作為評價指標，以PS的強直刺激前后電位比p(ps，i/ps，f)的百分率來反映LTP的變化。1.42結(jié)果2.1PS增強的比較強直刺激穿通通路后，PS的初潛期和峰潛期都比刺激前縮短(表1)，但各組間初潛期和峰潛期刺

7、激前后相比較差異不明顯(P>0.05)，1為正常組大鼠強直刺激前后誘發(fā)電位原始記錄。    左：強直刺激前；右：強直刺激后1強直刺激前后正常組大鼠誘發(fā)電位示例組別N/只tPS初潛期/mstPS峰潛期/ms強直刺激前強直刺激后強直刺激前強直刺激后正常組103.60±0.253.21±0.294.50±0.314.21±0.46模型組103.68±0.233.36±0.134.72±0.324.37±0.30高劑量組93.62±0.123.35±0.24

8、4.80±0.224.34±0.31低劑量組83.63±0.143.27±0.104.75±0.174.37±0.27石杉堿甲組83.71±0.223.31±0.254.55±0.344.22±0.28     強直刺激后各組動物PS幅度的增加都能超過20%，表明各組動物海馬齒狀回都有LTP的形成，但方差分析表明各組間PS幅度增強差異有顯著性(F=15.826，P<0.001)。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，模型組雖然有一定的增強，但相比正常組大大降低(P<0

9、.01，見表2)，高劑量組、低劑量組強直刺激后PS幅度增強明顯大于模型組(P<0.01和P<0.001)，石杉堿甲組相比模型組也明顯增強(P<0.01)；高劑量組、低劑量組與石杉堿甲組和正常組之間比較，PS的幅度差異不明顯。從時程觀察(見2)，模型組在強直刺激后的90min內(nèi)PS幅度的增強都能超過20%，但隨后一直低于20%，表明模型組LTP的維持能力下降；低劑量組在強直刺激后的36min內(nèi)，PS峰值的增強明顯大于正常組(P<0.01或P<0.05)，此外，強直刺激后21min內(nèi)，低劑量組與高劑量組、石杉堿甲組與正常組之間PS幅度增強差異有顯著性(P<0.0

10、5)。2.2強直刺激后各組EPSPs增強的比較強直刺激后，各組動物EPSPs的增強均比PS的增強要小(表2)，模型組EPSPs的增強低于其他4組，但各組之間并無顯著性差異(F=8.57，P>0.05)。 表2強直刺激后各組PS幅度和EPSPs斜率增強的比較組別N/只pps幅度/%SEPSPs斜率/%正常組10158.53±17.98135.10±15.17模型組10128.11±4.76*117.47±15.30高劑量組9163.03±15.71#138.28±24.96低劑量組8176.85±13.92#139.52

11、±16.94石杉堿甲組8164.97±29.60#140.89±14.89*與正常組比較，P<0.01；#與模型組比較，P<0.01，#P<0.001 3討論諸多的研究提示，學習記憶的神經(jīng)生物學基礎(chǔ)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性，其中，神經(jīng)元突觸的可塑性又是中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性中非常敏感的環(huán)節(jié)。海馬LTP的研究是目前研究與學習記憶有關(guān)的突觸功能可塑性的熱點。LTP現(xiàn)象被認為反映了突觸水平的記憶過程，一些損害學習記憶的因素可減低或阻斷LTP的形成，而易化LTP的因素或藥物能提高動物的學習記憶能力4，因此，從學習記憶和突觸可塑性變化的關(guān)系出發(fā)，探查海馬突觸功能

12、可塑性在AD時的相應(yīng)變化及治療藥物影響，可能會為篩選有效的改善AD等疾病防治藥物的研究提供一個較新的角度，但目前有關(guān)這方面的研究還不多。AD的主要病理特征為腦內(nèi)出現(xiàn)大量老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及膽堿能系統(tǒng)逐漸喪失等，其發(fā)病機制十分復(fù)雜。所以目前制備AD動物模型的方法雖然有多種，但每種方法均只能造成某些方面的病理改變，這種狀況為評價治療AD的藥物作用帶來不便。為了貼近AD多因素的病理特征，本研究采用D-半乳糖致亞急性衰老(D-半乳糖引起自由基代謝紊亂，使腦組織形態(tài)、生化及臨床檢測指標呈現(xiàn)老化特征1)，并以IBO損毀Meynert基底核的膽堿能神經(jīng)元來建立AD大鼠模型。我們的早期工作已表明3，5，

13、該AD模型能呈現(xiàn)多種病理改變，更符合AD多因素的發(fā)病機制，是進行有效中藥治療研究的合適模型。    2強直刺激后LTP的時程比較Nalbantoglu等最近的研究表明，表達淀粉樣前體蛋白C-末端的轉(zhuǎn)基因AD大鼠不僅空間學習記憶能力受損，而且海馬腦片CA1區(qū)LTP的維持能力受損6。本實驗中，AD大鼠海馬PP-DG通路誘發(fā)的PS峰值雖有一定的增強，但增強幅度大大低于正常組，并且在強直刺激后的120min內(nèi)PS幅度的增加已經(jīng)下降到20%以下，表明AD大鼠在體齒狀回LTP的產(chǎn)生及維持能力亦顯著下降，這與Nalbantoglu等在海馬CA1區(qū)的研究結(jié)果是相似的。本

14、實驗結(jié)合有關(guān)的研究工作表明，突觸傳遞功能可塑性的下降很可能是AD病人學習記憶能力下降的原因之一。補腎益智方高、低劑量組和石杉堿甲組大鼠海馬齒狀回產(chǎn)生的LTP均比模型組顯著提高，提示補腎益智方和石杉堿甲具有改善AD大鼠突觸傳遞的能力，說明補腎益智方的組方切中AD的腎虛、氣血不足的病理機制，具有補腎填精、益髓健腦、益氣養(yǎng)血活血之效能。我們以前的研究提示，補腎益智方能夠保護AD模型鼠腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)，該方灌胃組大鼠腦內(nèi)膽堿酯酶(AchE)陽性神經(jīng)纖維密度呈現(xiàn)廣泛和非特異性增高3，膽堿能系統(tǒng)在LTP及學習記憶中的作用已被一些研究所證實，海馬CA1和齒狀回的LTP可被東莨菪堿抑制，而膽堿酯酶則能增強LTP

15、7。據(jù)此推測，本實驗中補腎益智方改善AD大鼠LTP的形成與影響膽堿能系統(tǒng)的功能有關(guān)。尤其值得注意的是，在強直刺激后的30min左右時間，低劑量組和石杉堿甲組PS的增強明顯大于其他各組，可能低劑量的補腎益智方和石杉堿甲在易化短時程增強方面具有明顯的作用，但具體的機制目前還不清楚，需要進一步研究?；痦椖浚簢摇熬盼濉笨萍贾攸c攻關(guān)項目(NO：96-906-09-02)；國家醫(yī)藥技術(shù)創(chuàng)新博士項目(NO：98-B-13)作者簡介：第一作者，饒燕女，1972年8月出生，碩士，助教；饒燕（廣州中醫(yī)藥大學老年腦病研究所中心，廣州510405）賴世?。◤V州中醫(yī)藥大學老年腦病研究所中心，廣州510405）胡鏡清

16、（廣州中醫(yī)藥大學老年腦病研究所中心，廣州510405）王奇（廣州中醫(yī)藥大學老年腦病研究所中心，廣州510405）參考文獻：1張熙，張葆樽，楊新平，等.D-半乳糖誘導擬衰老動物模型的記憶行為改變J.中國老年學雜志，1996，16(4)：2302Rasool CG,Svendsen CN,Selkoe DJ.Neurofibrillary degeneration of cholinergic and noncholinergic neurons of the basal forebrain in Alzheimer's diseaseJ.Ann Neurol,1986，20:4823胡鏡

17、清，賴世隆，王奇，等.補腎益智方對阿爾茨海默病大鼠模型腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用J.廣州中醫(yī)藥大學學報，1999，16(3)：2014Bliss T V P,Collingridge GL. A synaptic model of memory:long_term potentiation in the hippocampusJ.Nature,1993，361:315胡鏡清，賴世隆，王奇，等.D-半乳糖加速衰老合并Meynert核損毀大鼠學習記憶能力變化的初步觀察J.中華老年醫(yī)學雜志，2000，19(2)：56Nalbantoglu J,Tirado_Santiago G,Lahsaini A， et al.Impaired learning and LTP in mic