觀察分析不同環(huán)境因素對小鼠應激反應的作用.docx

1、.論著*觀察分析不同環(huán)境因素對小鼠應激反應的作用周小江，邵青，張新創(chuàng)(蘭州生物制品研究所有限責任公司甘肅省疫苗工程技術研究中心，蘭州730046)摘要：目的觀察小鼠在領用、運輸過程中的環(huán)境變化引起的小鼠應激反應，并根據(jù)體重變化、蔗糖水偏嗜度變化、曠場行為得分來分析小鼠應激反應對機體產生的影響。方法SPF級BALB/c、IH、KM小砒隨機分為試騎組和對照組，在模擬外部5種剌激試驗后，記錄體或、蔗糖水和純水消耗量并計算出蔗糖水偏嗜度、曠場活動數(shù)據(jù)°結果3種小鼠試驗組在刺激后的體重比對照組明顯減輕;曠場活動計數(shù)有相對應的變化;試驗組蔗糖水偏嗜度比對照組下降明顯，結果均有統(tǒng)計學意義(P<

2、;0.05)o結論研究初步表明試驗前的應激刺激會影響實驗小鼠的精神狀態(tài)。關鍵詞：應激;動物福利；蔗糖水偏嗜度;曠場實騎中圖分類號：Q958.11文獻標志碼：A文章編號：1005-5673(2013)02-0033-04ObservationandanalysiseffectfromdifferentenvironmentalfactorsonthestressresponseinmiceZHOUXiao-jiang,SHAOQing,ZHANGXinYhuang(LanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.Ltd,CerUerforGansuProvincia

3、lVaccitieEngineeringResearchtIxinzhou730046,China)Abstract:ObjectiveTheobservationwascarriedoutontheeffectofenvironmentalchangesuponmiceduringreceptionandtransportationofthem.andtheintensityofthestressresponseinmicewasanalysedbasedonchangeinbodyweight,changeinaddicteddegreeforpreferencetosucroseandt

4、hescoresbyopen-fieldbehavior.MethodsTheBALB/c,NIH,KMmiceinSPFlevelwererandomlydividedintoexperimentalandcontrolgroups,respectively,recordedingbodyweight,consumptionofsucrosewaterandpurewater,preferencetosucrose,anddatafromopen-fieldactivityafterthefiveexternalstimulativetestsweresimulated.ResultsHie

5、bodyweightsofmiceafterstimulationinthreetestgroupsaresignificantlylowerthanthoseinthecontrolgroup,andthecorrespondingchangesoccurredinthescoresofopen-fieldactivityandthesucrosepreferenceintestgrouparesignificantlydecreasedincomparisonwiththoseinthecontrolgroup,andthedifferencesarestatisticallysignif

6、icant(P<0.05).ConclusionInthisstudythestressstimulationoccuredbeforethetest,whichwillaffectthementalstateoftheexperimentalmice.Keywords：Stress;Animalwelfare;Sucrosepreference;Open-fieldtest隨著中國實驗動物飼養(yǎng)管理標準化程度的提高，實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境不斷得到改善,SPF飼養(yǎng)設施廣泛應用到實驗動物行業(yè)中，為實驗動物的質量提供了保證。但由于在實驗動物從運輸?shù)皆囼炃暗倪^程中受外界多種因素的影響，會引起實驗動物的

7、應激反應,導致實驗動物行為發(fā)生變化，影響實驗動物在試驗中的試驗數(shù)據(jù)。收稿日期：2012-12-03；修回日期：2013-0116作者簡介:周小江(1968-).男.醫(yī)學生物程師，主要從事實驗動物微生物檢測工作C應激(Stress)是機體對不協(xié)調狀態(tài)或環(huán)境穩(wěn)定受到威脅時所做出的反應。一般伴有神經、內分泌、免疫和行為的變化來完成身體對應激的應答。目前，國內對實驗動物在離開動物飼養(yǎng)設施到動物試驗前這一過程中所產生的一系列應激反應越來越受到關注。有文獻報道實驗動物在外界應激刺激后，對實驗動物自身的免疫系統(tǒng)存在著干擾，從而影響動物試驗的結果，'51o通過實驗室模擬動物運輸、外界溫濕度變化以及人為

8、不規(guī)范操作等因素引起的應激,在體重、蔗糖偏嗜度、曠場行為試驗的數(shù)據(jù)變化來觀察實驗動物從離開動物飼養(yǎng)設施到試驗前這一過程的應激程度，確定對實驗動物機體的影響。同時通過實驗室模擬外界環(huán)境因素變化的方法，避免了不確定因素的發(fā)生和干擾，有利于觀察和研究單一因素對實驗動物的影響,旦存在著從試驗項目設計、易于操作和控制、人為干擾因素少等優(yōu)點，為在這個領域的研究提供一些參考數(shù)據(jù)和試驗方法。1材料和方法11材料1.1.1實驗動物SPF級BALB/c、NIH、KM小鼠均獲自蘭州生物制品研究所有限責任公司（以下簡稱蘭州公司）實驗動物室，生產許可證號:SCXK（甘）2012-0001,使用許可證號:SYXK（t）-

9、）2012-0002o1.1.2天平、搖床、批筒、孵育箱、冰箱等均為蘭州公司實驗動物室檢測組常用設備，均經甘肅省氣象計最檢定站校驗合格。1.2試驗方法1.2.1稱重方法將SPF級BALB/c、N1H、KM小鼠分別設置為試驗組和對照組,每蛆隨即挑選1。只小鼠，雌雄各半。體重稱重時間為:首次:兩組小鼠稱取體重;剌激前：72h蔗糖水、純化水雙瓶適應性飼養(yǎng)后，稱取體重;刺激1:禁食禁水18h后稱取體重;刺激2：蔗糖水、純化水雙瓶飼養(yǎng)24h后試驗組進行模擬五項刺激試驗，對照組正常飼養(yǎng)后稱取體重;刺激3：重復刺激2試驗稱取體重；刺激后:重復刺激2試驗稱取體重;恢復后:停止刺激并蔗糖水、純化水雙瓶飼養(yǎng)72h

10、后稱重。1.2.2糖水偏嗜度試驗力將兩組小鼠進行72h蔗糖水、純化水雙瓶適應性飼養(yǎng)。蔗糖水濃度為1%;純化水為蘭州公司培養(yǎng)基室制作，為防止小鼠對蔗糖水的依賴性，每12h兩種水交換位置。刺激試驗前禁食禁水18h,五項刺激試驗開始，加入蔗糖水、純化水分別為100mL雙瓶飼養(yǎng)。剌激試驗72h后通過量筒計量糖水、純化水消耗量并計算出糖水偏嗜度（%）。糖水偏嗜度（%）=糖水消耗量/（糖水消耗量+純化水消耗量）x100%o1.2.3曠場行為試驗曠場（Openfield）試驗箱為蘭州公司自制木箱，根據(jù)小鼠身長其設計大小為40cmx40cmx30cm,內外均為黑色，用白線平均分為25個方格的曠場箱。計分方法:

11、試驗期間觀察動物每走一格為1分，雙足離地站立為1分，前爪整理毛發(fā)為I分，爬墻一次為1分，記錄時間為3min。1.2.4模擬外界五項刺激試驗固定試驗:將試驗動物固定在自制的固定板，時間為3min,要求不能損傷小鼠四肢，固定背部;暈車試驗:使用設備為實驗室常規(guī)用搖床,生產廠家為:海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號:TS-2。搖床設置為每分鐘晃動100次，晃動3min；嚴寒試驗：-20°C冰柜內放置3min；酷熱試驗：30T孵育箱放置3min；浸濕試驗:燒杯內盛適屈室溫純化水，浸濕3次。以上試驗每天進行2次,直到刺激試驗結束。1.2.5恢復試驗將試驗組和對照組小鼠,在刺激試驗結束后,進行

12、相同方式（蔗糖水、純化水雙瓶）飼養(yǎng)3d,然后測定體童、蔗糖水偏嗜度、曠場行為數(shù)值。1.2.6統(tǒng)計學處理采用SPSS統(tǒng)計學軟件16.0進行統(tǒng)計分析，全部數(shù)據(jù)以土s表示,組間差異比較采用七檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1BALB/c小鼠試驗前試驗組、對照組平均體重分別為13.62g、13.34g;試驗后試驗組、對照組平均體重分別是19.18g、20.22g；恢復3d平均體重試驗組、對照組分別為23.24g和24.12g（見圖1）。曠場行為計數(shù)如表1所示，試驗前和恢復3d后兩組問數(shù)值無顯著性差異，試驗后兩組間數(shù)值差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；蔗糖偏嗜度結果如表2

13、所示，試驗前和恢復3d后兩組間數(shù)值無顯著性差異，試驗后兩組間差異有統(tǒng)計學意義（PvO.05）o圖1BALB/c、NIH、KM小鼠體重Fig.IThebodyweightofBALB/c,NIHandKMmice2.2NIH小鼠試驗前試驗組、對照組平均體重分別為16.56g、16.58g;試驗后試驗組、對照組平均體重分別是22.13g、23.12g；恢復3d后平均體重試驗組、對照組分別為21.38g和24.74g（見圖1）。曠場行為計數(shù)如表1所示,試驗前、后兩組間數(shù)值無顯著性差異，恢復3d后數(shù)值有顯著性差異（P<0.05），分析NIH小鼠在感受刺激方面有一定延遲性表現(xiàn)，試驗后數(shù)值未出現(xiàn)差異

14、，但精神狀態(tài)表現(xiàn)為膽怯、易驚嚇等;蔗糖水偏嗜度結果如表2所示，試驗前和恢夏3d后兩組間數(shù)值無顯著性差異，試驗后兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。2.3KM小鼠試驗前試驗組、對照組平均體重分別為18.38g、18.18g;試驗后試驗組、對照組平均體重分別是23.82g、26.10g；恢復3d后平均體重試驗組、對照組分別為30.00g和30.08g（見圖1）。曠場行為計數(shù)如表1所示，試驗前兩組數(shù)值無顯著性差異，試驗后和恢復3d后數(shù)值均有顯著性差異（P<0.05）；蔗糖水偏嗜度結果如表2所示，試驗前和恢復3d后兩組間數(shù)值無顯著性差異，試驗后兩組間差異有統(tǒng)計學意義（尹<0.05

15、）。表1曠場試驗結果Tab.1Theresultsofopen-fieldtestBALB/cNIHKMx±s*為P<0.05試驗組對照組試驗組對照組試驗組對照組試驗前41±3621±17106±37134±2072±3284±42試驗后46±4083±22*103±6391±6031±30127±5*恢復后75±4145±2759±41118±32*38±2887±57表2蔗糖水由度試驗結果Tab.

16、2Thedataofsucrosepreference*為P<0.05X±3BALB/cN1HKM試驗組對照組試驗組對照組試驗組對照組試驗前0.51±0.200.61±0.140.63±0.060.60±0.050.70±0.120.65±0.02試驗后0.46±0.120.57±0.07*0.57±0.050.64±0.08,0.68±0.040.75±0.06*恢復后0.54±0.110.63±0.100.64±0.040.6

17、3±0.120.71±0.040.72±0.083討論試驗通過模擬外界不良因素來誘導小鼠焦慮、恐慌、萎靡、膽怯等精神癥狀,測定小鼠從離開動物飼養(yǎng)設施到試驗場所試驗前的刺激強度，探討減輕外界因素刺激小鼠的必要性，并為改善這一過程的刺激強度，提供了一定的參考數(shù)據(jù)。在模擬外界刺激因素的試驗方法時，借鑒了文獻8中的一些想法，并且通過在實驗室模擬一些特殊形式比如短途運輸造成的顛簸、暈車、溫濕度急劇變化、飼喂動物時漏水等因素設計出暈車試驗、嚴寒試驗、酷熱試驗和浸濕試驗，設計時間均為3min,比實際因素時間要短，但通過每天2次試驗來完成對現(xiàn)實中應激因素的模擬，同樣達到了預期目的

18、。根據(jù)表1所示,SPF級別3種小鼠在曠場行為試驗中，數(shù)據(jù)變化復雜，雖然BALB/c和KM小鼠對照組數(shù)據(jù)變化不穩(wěn)定（口J能與試驗的計分方法有關，有必要在今后試驗中繼續(xù)探索改進），但從試驗組小鼠試驗后行為表現(xiàn)為弓背行走,對聲響敏感的恐懼、膽怯癥狀來看，與對照組小鼠曠場內表現(xiàn)出的悠閑、探索行為有明顯外觀差異，數(shù)據(jù)結果差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。經過模擬5項試驗刺激，試驗組體重比對照組體重明顯減輕，且差異性趨勢越來越顯著。而經過3d恢復,差異性趨勢逐步減緩，證明試驗小鼠在一定應激刺激后，如果有良好的飼養(yǎng)管理，在一定的時間內,體重會有程度不同的恢復。經統(tǒng)計學分析，糖水偏嗜度試驗組與對照組數(shù)據(jù)

19、存在顯著性差異（P<0.05）。試驗中試驗組小鼠在模擬外界五種刺激試驗后,對糖水的偏好降低，說明缺乏快樂感受，對飼養(yǎng)過程中蔗糖獎賞的獲取欲望減弱，表現(xiàn)出萎靡，恐慌、膽怯等精神癥狀。在經過3d恢復飼養(yǎng)試驗后，蔗糖水偏嗜度試驗組與對照組有接近的趨勢，恢復飼養(yǎng)對小鼠應激剌激有恢復作用。綜上所述，SPF級BALB/c、NIH、KM小鼠在刺激試驗前后行為學指標發(fā)生相應變化，試驗組小鼠在各種刺激試驗后精神狀態(tài)變差，與對照組有比較明顯的行為差異，而這種差異可能影響試驗小鼠在未來試驗中的實驗結果。SPF級小鼠是生活在SPF飼養(yǎng)設施內的實驗動物，飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定,飼養(yǎng)人員固定，飼養(yǎng)管理有嚴格的國家標準控制，而

20、在離開SPF飼養(yǎng)設施后，外界未知因素增加，這些因素有可能導致小鼠短時間內產生應激反應。為了確保實驗動物在試驗前減少或降低外界因素的影響,應在動物領用、運輸和人員操作推行標準化管理，包括對動物運輸中的運輸工具、包裝盒、墊料、食物、飲水、恒溫、恒濕的綜合性要求。而在恢復試驗中，通過正常的飼養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)3種小鼠在體重、糖水偏嗜度和曠場行為數(shù)據(jù)中都有一定程度的恢復，表明如果在一個相對穩(wěn)定環(huán)境中進行恢復性飼養(yǎng)，可以減輕應激刺激帶來的不良影響。參考文獻1GB14925-2010,實驗動物環(huán)境及設施S.2 MobergCP.MenchJA.動物應激生物學M.北京：中國農業(yè)出版社,2005:28-41.3 Rey

21、esTM,WalkerJRDeCinoC.ela.Categoricallydistincta-cutestressorselicitdissimilartranscriptionalprofilesintheparaventricularnucleusof(hrhypothalamusJ1.Ncurwci.2(X)3,(23):5607-5616.'4SgoifoA,PozzatoC,MeerioP,etal.Inlrnnittentexposuretosocialdefeatandopen-fieldtestinrats:acuteandlong-termeffectsonE(；(

22、；,bodytemperatureandphysicalactivityJ.Stress,2002,5(1):23-35.5,DeCarutR,AsnisGM.Thenon-steroidalanti-inflammatorydrugdiclofenacsodiumattenuatasIFN-alphainducedalterationstomonoamineturnoverinprefrontalcortexandliippocampus(J.BrainResearch,2003,977(1)：70-79.6j施桂蘭，庫寶善，姚海燕.解郁丸對慢性應激大W.HPA軸和免疫系統(tǒng)的影響J.中國中藥雜志,2007.32(15):1553-1554.L7BrenesSaenzJC,VillagniOR,FoniagueraTJ.Factoranalysisofforcedswimmingtest,sucrosepreferencetestandop