細(xì)胞生物學(xué)植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方案

1、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)之植物組織培養(yǎng)參考參考1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1.學(xué)習(xí)和配制植物組織MS固體培養(yǎng)基； 2.學(xué)習(xí)和使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌； 3.了解和掌握無菌操作； 4.將胡蘿卜貯藏組織培養(yǎng)成胡蘿卜幼苗。二、實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞全能性(cell totipotency)：植物體的每一個(gè)細(xì)胞都攜帶有一套完整的基因組，并具有發(fā)育成為完整植株的潛在能力。植物的任何細(xì)胞、組織和器官，在人工預(yù)知的控制條件下，放在含有營養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等組成的培養(yǎng)基中，使其生長(zhǎng)、分化、形成完整植株的過程，稱為植物組織培養(yǎng)。三、實(shí)驗(yàn)器材：1、實(shí)驗(yàn)材料 ：新鮮的質(zhì)量良好胡蘿卜肉質(zhì)根。2、實(shí)驗(yàn)設(shè)備 （1）儀器設(shè)備： 

2、;冰箱、普通天平、分析天平、各種型號(hào)的試劑瓶（棕色和白色）、移液管、量筒、燒杯、容量瓶、搪瓷杯、藥勺、稱量紙、玻棒、標(biāo)簽紙、電磁爐，三角瓶、醫(yī)用口杯、精密pH試紙（pH5.47.0）、藥勺、封口膜、牛皮紙、橡皮筋、棉線、電爐、高壓蒸汽滅菌鍋、酒精棉球、小塊紗布、已滅菌濾紙、槍狀鑷子、手術(shù)剪、解剖刀、已滅菌培養(yǎng)皿、酒精燈、酒精棉球、小塊紗布、滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、搖床（震蕩培養(yǎng)箱）等。   其中主要儀器設(shè)備為滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱等。 （2）藥品  硝酸銨、硝酸鉀、氯化鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、碘化鉀、硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷

3、、乙二胺四乙酸二鈉、硫酸亞鐵、甘氨酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆素、煙酸、肌醇、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA（-萘乙酸）、 6-BA （ 6-芐基腺嘌呤）、 KT、濃鹽酸、氫氧化鈉、濃硫酸、重鉻酸鉀、95%酒精、蒸餾水、MS培養(yǎng)基母液化學(xué)組分、瓊脂、蔗糖、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、蒸餾水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH、胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、無菌水、75酒精、0.1%HgCl2。MS培養(yǎng)基母液、瓊脂、蔗糖、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、蒸餾水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH、愈傷組織繼代培養(yǎng)基、

4、75酒精。四、實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)總體流程：  MS培養(yǎng)基母液的配制與保存胡蘿卜愈傷組織器官分化培養(yǎng)胡蘿卜肉質(zhì)根愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)（接種和初代培養(yǎng)）MS固體培養(yǎng)基配制胡蘿卜愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)取材與消毒培養(yǎng)基與接種用具的滅菌胡蘿卜幼苗培養(yǎng)1.MS培養(yǎng)基母液的配制與保存（1） 母液的配制：母液是欲配制培養(yǎng)基的濃縮液，一般配成比所需濃度高10100倍。 1、MS大量元素母液（10×）稱10升量溶解在1升蒸餾水中。配1升培養(yǎng)基取母液100ml。化學(xué)藥品1升量10升量（10×）50升量（50×）NH4NO31650 mg16.5gKNO319

5、00 mg19.0gCaCl2·2H2O （CaCl2）440 mg （ ）4.4gMgSO4·7H2O（MgSO4）370 mg （ ）3.7gKH2PO4170 mg1.7g 2、MS微量元素母液（100×） 稱10升量溶解在100ml蒸餾水中。配1升培養(yǎng)基取母液10ml?；瘜W(xué)藥品1升量10升量100升量（100×）MnSO4·4H2O（ MnSO4·H2O）22.3mg（21.4 mg）223mg（214 mg）ZnSO4·7H2O8.6 mg86mgH3BO36.2 mg62 mgKI0.83 mg8.3 mgNa2

6、MoO4·2H2O0.25 mg2.5mgCuSO4·5H2O0.025 mg0.25mgCoCl2·6H2O0.025mg0.25mg注意：CoCl2·6H2O和CuSO4·5H2O可按10倍量（0.25 mg×10=2.5 mg）或100倍量（25 mg）稱取后，定容于100ml水中，每次取10ml或1ml，即含0.25 mg的量。 3、MS鐵鹽母液（100×）稱10升量溶解在100ml蒸餾水中。配1升培養(yǎng)基取母液10ml?；瘜W(xué)藥品1升量10升量100升量（100×）Na2·EDTA37.3 mg37

7、3 mgFeSO4·7H2O27.8 mg278 mg注意配制時(shí)，兩種成分分別溶解在少量蒸餾水中，其中EDTA鹽較難完全溶解，可適當(dāng)加熱?；旌蠒r(shí)，先取一種置容量瓶（燒杯）中，然后將另一種成分逐加逐劇烈震蕩，至產(chǎn)生深黃色溶液，最后定容，保存在棕色試劑瓶中。 4、MS有機(jī)物母液（100×）稱10升量溶解在100ml蒸餾水中。配1升培養(yǎng)基取母液10ml。化學(xué)藥品1升量10升量100升量（100×）煙酸0.5 mg5mg鹽酸吡哆素（VB6）0.5 mg5mg鹽酸硫胺素（VB1）0.4 mg4 mg肌醇100 mg1 g甘氨酸2 .0mg20mg 5、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑單獨(dú)配制，濃

8、度為15 mg/ml（書中為0.5 1 mg/ml），本實(shí)驗(yàn)要求配成1 mg/ml 。配制培養(yǎng)基母液時(shí)注意事項(xiàng)：一些離子易發(fā)生沉淀，可先少量水溶解，在按配方順序依次混合；配制母液時(shí)用蒸餾水或重蒸餾水；藥品應(yīng)用化學(xué)純或分析純；溶解生長(zhǎng)素時(shí)，可用少量0.11 N的NaOH 或95%酒精溶解，溶解分裂素類用0.11 N的HCl加熱溶解（如再加蒸餾水，易產(chǎn)生白色沉淀，此時(shí)可加入熱水）。（二）母液的保存1、裝瓶：將配制好的母液分別裝入試劑瓶中，貼好標(biāo)簽，注明各培養(yǎng)基母液的名稱、濃縮倍數(shù)、日期、配制者。（注意將易分解、氧化者，放入棕色瓶中）例如：MS鐵鹽（100×） 2、貯藏：4冰箱。（3） 注

9、意事項(xiàng) 16-BA，NAA用量甚微，取用時(shí)要使用移液管，移液管越小越精確。 2注意配制大量元素母液時(shí)防止鈣鹽與硫酸鹽和磷酸鹽產(chǎn)生沉淀； 3鐵鹽母液用棕色瓶保存。注意pH的調(diào)節(jié)；2.MS固體培養(yǎng)基配制 1 L固體MS培養(yǎng)基配制： （1）用量筒從各種母液中分別取出所需的用量：MS大量元素母液100ml，MS微量元素母液、MS鐵鹽母液和MS有機(jī)物母液各10ml。 （2）用電子天平稱出8 g瓊脂粉和 30 g蔗糖放在燒杯中，加入少量的蒸餾水在微波爐中加熱使之溶解。 （3）再用移液器取適量的6BA和NAA放入組培瓶里。各種類型的培養(yǎng)基： 基本培養(yǎng)基：MS0，即: MS +30 g/L 蔗糖 +8 g/L

10、 瓊脂粉； 誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基有2 種，分別為MS0 +01 mg/L 2，4-D 和 MS0 + 2mg/L 2，4-D +02 mg/L 6-BA（本次實(shí)驗(yàn)采用后者）； （4）最后用蒸餾水定容到1 L；用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/LHCL 溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 pH 值至 5.86.0。 （5）盡快分裝，培養(yǎng)基占容器的1/5-1/4為宜（20-25 mL），盡量避免培養(yǎng)基沾到容器內(nèi)壁或容器口，標(biāo)記日期。 （6）用橡皮圈和牛皮紙封口。3.培養(yǎng)基與接種器材的滅菌1、洗滌：把組織培養(yǎng)基用的培養(yǎng)皿、三角瓶、試管、燒杯等玻璃器皿（根據(jù)實(shí)際需要）進(jìn)行徹底清洗。自然晾干或烘箱干燥。2、包扎

11、：用牛皮紙、報(bào)紙、紗布或錫箔紙把玻璃器皿和金屬器械分別包扎好。 3、無菌水：用洗凈的2個(gè)500mL錐形瓶分別裝取400mL蒸餾水，用牛皮紙封口。4、裝水：在高壓滅菌鍋內(nèi)裝入一定量的水（水要淹沒電熱絲）。（切忌干燒！） 5、裝物品：在滅菌鍋內(nèi)放入含培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶或三角瓶、裝蒸餾水的錐形瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金屬器械等。 6、滅菌：將排氣閥開著，加熱，直至鍋內(nèi)釋放出大量水蒸氣（此時(shí)水蒸氣橫向噴出），再關(guān)閉閥們；或者當(dāng)鍋內(nèi)壓力升至49.0KPa時(shí)，開啟排氣閥，將鍋內(nèi)的冷空氣全部排出。當(dāng)鍋內(nèi)壓力達(dá)到108KPa時(shí)，溫度為121時(shí)，維持15-20分鐘，即可達(dá)到滅菌的目的

12、。（若滅菌時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使培養(yǎng)基中的某些成分變性失效。）切斷電源，讓滅菌鍋?zhàn)匀焕鋮s。7、70%酒精的制備與75%的酒精棉的制作。 注意事項(xiàng)：1. 滅菌時(shí)間和壓力、溫度的控制；2. 先打開放氣閥，等到壓力顯示為0時(shí)，再打開鍋蓋；3. 分裝要干凈，滅菌時(shí)錐形瓶盡可能放正，不要使培養(yǎng)基流出 ；4. 若滅菌時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使培養(yǎng)基中的某些成分變性失效；5.開蓋后應(yīng)盡快轉(zhuǎn)移培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)瓶冷卻、凝固。一般應(yīng)將滅菌后的培養(yǎng)瓶?jī)?chǔ)藏于30以下的室內(nèi)，最好儲(chǔ)藏在4-10的條件下。 4、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng) 接種環(huán)境1、先用75%酒精擦拭超凈臺(tái)的內(nèi)部6個(gè)面。2、將現(xiàn)配的75%的酒精、0.1%的升汞溶液、

13、刀、鑷子、無菌紙、無菌水、小燒杯、培養(yǎng)皿、廢液缸、試管架、打火機(jī)等操作用的工具放置到相應(yīng)位置。3、將酒精燈添加適當(dāng)?shù)木凭ú怀^容積的2/3），并檢查是否可以點(diǎn)燃。4、先開紫外燈40min，后再通風(fēng)20min。5、進(jìn)入操作臺(tái)的物品都要經(jīng)酒精消毒。 接種1、在無菌操作臺(tái)上操作。2、點(diǎn)燃酒精燈，倒平板。 3、消毒外植體：把清洗好的胡蘿卜塊根放入無菌操作臺(tái)，消毒先用70%酒精對(duì)胡蘿卜直根消毒5min，再用0.1%的升汞溶液消毒10min，用無菌水沖洗3次，放入成有無菌水的燒杯中待用。4、拆刀鑷，先放在盛有工業(yè)酒精浸泡的管口瓶中，使用時(shí)在酒精燈的火焰上灼燒滅菌。5、切外植體：用消毒好的小刀沿截面將其橫

14、切成厚度35mm左右的小圓片，然后如圖所示切，將韌皮部和木質(zhì)部切去，留下形成層。6、接種外植體，45個(gè)/培養(yǎng)皿：打開牛皮紙時(shí)三角瓶瓶口應(yīng)該傾斜并靠近酒精燈火焰，接種時(shí)，要求懸空放入，不要接觸三角瓶的內(nèi)壁，胡蘿卜在培養(yǎng)基上要擺放位置。在揭開封口和封口時(shí)，可以將三角瓶口放在火焰上灼燒一下。7、用橡皮圈和牛皮紙封口。8、貼上標(biāo)簽紙。注意事項(xiàng)： 1.在接種過程中，手不能接觸外植體； 2.每次接種前做好接種工具的滅菌工作； 3.可以對(duì)手進(jìn)行多次的消毒處理； 4.實(shí)驗(yàn)廢液不能隨意處置，需要收集后進(jìn)行專門處理。5、胡蘿卜愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)1.胡蘿卜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)基的配制 （1）配方：MS基本培

15、養(yǎng)基+2.0mg/L NAA+0.1mg/L 6BA+200mg/L水解酪蛋白+3% 蔗糖 （2）配制流程：（同胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制）。 2. 準(zhǔn)備工作 接種室的清潔和消毒；超凈工作臺(tái)的開機(jī)和消毒；剪刀、鑷子、已經(jīng)滅菌的培養(yǎng)皿和濾紙、待用培養(yǎng)基等的準(zhǔn)備；材料的準(zhǔn)備（選擇裝有無污染的已經(jīng)分化出愈傷組織的外植體的三角瓶擺放在干凈工作臺(tái)上）3.愈傷組織的繼代培養(yǎng) 將上次接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的無污染的外植體上產(chǎn)生的愈傷組織剝離轉(zhuǎn)移接到愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，放置于25全黑的暗條件下進(jìn)行愈傷組織的增殖培養(yǎng)，搖床

16、上震蕩培養(yǎng)以分離得到單細(xì)胞。已獲得足夠的愈傷組織，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)材料。6、 愈傷組織器官分化培養(yǎng)（1） 準(zhǔn)備工作 接種室的清潔和消毒 ；超凈工作臺(tái)的開機(jī)和消毒； 剪刀、鑷子、已滅菌培養(yǎng)皿和濾紙、待用培養(yǎng)基等的準(zhǔn)備 ；實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備（選擇裝有無污染的已分化出愈傷組織的外植體的三角瓶擺放于凈工作臺(tái)上）； 無菌條件下，用鑷子夾取胡蘿卜肉質(zhì)根愈傷組織，置于一個(gè)皿底鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，用解剖刀挑取愈傷組織上活躍生長(zhǎng)的部分用于接種 。 （2）挑選色澤淡黃、松散、生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基上，于光暗比 14 h 10 h、 25 條

17、件下培養(yǎng)約30 d，誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生。 （3）配方： MS基本培養(yǎng)基0.1mg/L NAA  1mg/L 6-BA  0.7 瓊脂3蔗糖（配制方法同上）。7、胡蘿卜幼苗培養(yǎng) 待生根植株形成一定量的根系并長(zhǎng)至6 7 片葉時(shí)，進(jìn)行煉苗。煉苗約7 d 后開啟瓶蓋，在超凈臺(tái)上將其拔出，用無菌水輕輕沖洗除去根系上的培養(yǎng)基， 再移入裝有土的盆缽中，再進(jìn)行常規(guī)栽培管理。 5、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2015.10.212015.11.23 胡蘿卜植物組織培養(yǎng)之胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)；2015.11.232015.12. 胡蘿卜植物組織培養(yǎng)之胡蘿卜愈傷組織分化培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)圖片： 2015.10.21 2015.11.