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文檔簡(jiǎn)介
1、溫州市中醫(yī)院檢驗(yàn)科 SOP 免疫檢驗(yàn)分冊(cè)HPV基因分型測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作規(guī)程文件號(hào):免疫-第4版 共6頁(yè) 規(guī)程編寫(xiě)者:葉瑾 生效日期:2008年08月11日起批準(zhǔn)日期:2008年08月06日文件正本保存于:主任辦公室 保管人:奚經(jīng)巧文件副本保存于:免疫室 保管人:葉瑾 檢驗(yàn)科主任: (簽名) 項(xiàng)目主管: (簽名) 文件執(zhí)行者簽名:我已閱讀該文件,并將按文件要求執(zhí)行1 檢驗(yàn)申請(qǐng)1.1具有資格的臨床醫(yī)生根據(jù)需要在His醫(yī)生工作站提交電子檢驗(yàn)申請(qǐng)單1.2組合項(xiàng)目申請(qǐng):HPV基因分型檢測(cè)。1.3項(xiàng)目所在菜單:His醫(yī)生工作站上的“婦科檢驗(yàn)”。2 標(biāo)本采集和處理2.1 病人的準(zhǔn)備2.1.1 月經(jīng)正常婦
2、女,在月經(jīng)來(lái)潮后1018天為最佳檢查時(shí)間; 2.1.2 檢查前48小時(shí)內(nèi)不要作陰道沖洗,不要用避孕藥膏等陰道內(nèi)用藥物; 2.1.3 檢查前48小時(shí)最好不要行性生活; 2.1.4 檢查前不進(jìn)行醋酸或碘液涂抹; 2.2 標(biāo)本采集2.2.1 按醫(yī)生指示,仰臥于檢查床上;2.2.2由醫(yī)生以窺陰器或陰道張開(kāi)器暴露宮頸。 然后使用專用的HPV采樣刷置于宮頸口采集標(biāo)本;(最好在取樣前先用棉簽擦去宮頸分泌物)2.2.3將專用宮頸刷置于宮頸口,輕輕搓動(dòng)宮頸刷使其順時(shí)針旋轉(zhuǎn)5圈; 2.2.4慢慢取出宮頸刷,將其放入標(biāo)有病人編號(hào)的取樣管中,取樣管內(nèi)已加有專用細(xì)胞保存液,折斷其刷頭入管中,擰緊瓶蓋。 2.2.5 標(biāo)本
3、采集后,在電腦終端檢驗(yàn)標(biāo)本采集確認(rèn),電腦自動(dòng)產(chǎn)生標(biāo)本采集時(shí)間。2.2.6 標(biāo)本采集及確認(rèn)后,臨床標(biāo)本要及時(shí)運(yùn)送至檢驗(yàn)科。檢驗(yàn)科接收人員Lis接收電腦終端刷取標(biāo)本條形碼接收標(biāo)本,并記錄狀態(tài)。對(duì)不合格標(biāo)本應(yīng)予拒收。2.2.7 下列標(biāo)本為不合格標(biāo)本:1) 標(biāo)本無(wú)標(biāo)識(shí)(條形碼);2) 無(wú)法辨認(rèn)條形碼號(hào);3) 標(biāo)識(shí)涂改;4) 未采用裝有細(xì)胞保存液專用管的;5) 采樣后未及時(shí)送檢并且未能置4冰箱保存的;6) 標(biāo)本采集過(guò)程中混入紅細(xì)胞或分泌物過(guò)多的標(biāo)本;7) 標(biāo)本試管破裂等;2.3 標(biāo)本采集的注意事項(xiàng)2.3.1 避免采集分泌物過(guò)多的標(biāo)本,最好在取樣前先用棉簽擦去宮頸分泌物;2.3.2 盡量避免血性樣本,若患
4、者宮頸口充血出血,應(yīng)建議改日采樣。2.4 標(biāo)本保存2.4.1 接收標(biāo)本后,若不能馬上檢測(cè),于4保存。2.4.2 標(biāo)本有效保存條件及時(shí)間:普通冰箱中(2-8)穩(wěn)定2周。標(biāo)本均密封保存。2.4.3標(biāo)本留存時(shí)間:已完成測(cè)試的標(biāo)本保持完整的識(shí)別號(hào),置48冰箱內(nèi)留存7天,已分離抽提的DNA樣本可于-20保存30天。3 方法原理分離提取宮頸細(xì)胞內(nèi)的HPV-DNA,首先進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后以凱普醫(yī)用核酸分子快速雜交儀為平臺(tái)在已固定好核酸探針的低密度基因芯片膜上進(jìn)行導(dǎo)流雜交,可一次性檢測(cè)21種HPV亞型。4試劑組成:由凱普生物化學(xué)科技公司提供4.1 DNA提取試劑:包括溶液、溶液、溶液,試劑盒在2-8保存。溶
5、液臨用前在45水浴中預(yù)熱,溶液、溶液即開(kāi)即用。4.2 PCR試劑:包括PCR Mix、DNA Taq酶 , 試劑盒在-20保存。試劑在臨用前根據(jù)比例配制。(已配制的PCR試劑不能-20保存,可于2-8保存數(shù)周)4.3 雜交試劑:包括雜交液、封阻液、酶標(biāo)液、溶液A、溶液B、雜交膜、NBT/BCIP,試劑盒在2-8保存。雜交液臨用前在45水浴中預(yù)熱。5適用儀器ABI7000 PCR擴(kuò)增儀、醫(yī)用核酸分子快速雜交儀6操作步驟6.1 DNA提取操作步驟6.1.1 取500ul臨床樣本,14000rpm離心5分鐘,去上清液。6.1.2 加入400ul溶液(事先在45水浴中預(yù)熱),混勻后沸水中煮15分鐘。6
6、.1.3 稍微冷卻后,加入400ul溶液,混勻,室溫下放置2分鐘,14000rpm離心5分鐘,去上清(務(wù)必去干凈,可14000rpm再次離心1-2分鐘后去上清)。6.1.4 室溫放置2分鐘,加入60ul溶液充分混勻溶解,取1ul樣品做PCR檢測(cè)(在做PCR之前,最好將提取的樣品離心數(shù)分鐘)。6.2 PCR操作步驟6.2.1 將已解凍的PCR Premix放在振蕩器上振蕩10 sec,放入離心機(jī)中點(diǎn)動(dòng);同時(shí)從冰箱中取出Taq酶管,不要振蕩,放入離心機(jī)中點(diǎn)動(dòng)。6.2.2 然后將其再放入超凈工作臺(tái)內(nèi),將已融化了的PCR premix管、陰性對(duì)照(蒸餾水)管及Taq酶管插在冰塊上保持其在低溫條件下;6
7、.2.3 按照下表給出的不同反應(yīng)數(shù)所需的PCR個(gè)組份的數(shù)量準(zhǔn)備PCR Mastermix 成 分用 量Premix(l)Taq酶(l)1人份23.250.752人份48.831.583人份73.242.364人份97.653.155人份122.063.946人份146.484.737人份170.895.518人份195.306.30N 人份N1.0523.25N1.050.756.2.4從離心管架拿出與PCR管編號(hào)相同的DNA樣本管,吸取1l加入PCR管中,輕輕吸打幾下, 蓋上PCR管蓋,垂直將槍頭小心打入盛有10%次氯酸鈉的廢液缸中,確保移液槍前臂沒(méi)有碰到廢液缸口;(將DNA樣本管放回放有D
8、NA樣本的離心管架上,但確保擺放位置與還沒(méi)有加樣的DNA樣本管有區(qū)別);依次重復(fù)直到樣本膜板全部加完。6.2.5對(duì)比PCR管的排列及DNA樣本管的排列,確保樣本加樣無(wú)誤。6.2.6將PCR反應(yīng)管放入PCR擴(kuò)增區(qū)中的PCR擴(kuò)增儀中,開(kāi)始PCR反應(yīng),具體程序如下: 95C 9 min95C20 sec55C30 sec40 Cycles72C30 sec72C5 min6.2.7 PCR擴(kuò)增結(jié)束后,將PCR擴(kuò)增管放入4C冰箱保存(短期),如需要長(zhǎng)期保存則放入-20oCC冰箱。6.3雜交操作步驟6.3.1 雜交前準(zhǔn)備6.3.1.1將所有雜交檢測(cè)試劑放置在室溫下,使其溫度平衡到室溫。6.3.1.2將雜
9、交液試劑瓶放入45C水浴鍋中預(yù)熱。6.3.1.3如果使用之前發(fā)現(xiàn)溶液B有沉淀,則可在45水浴條件下溶解,然后將其溫度平衡到室溫條件.6.3.2 HybriMax導(dǎo)流雜交儀準(zhǔn)備6.3.2.1確認(rèn)雜交儀電源已與雜交儀相連接,打開(kāi)HybriMax.雜交儀電源;6.3.2.2在雜交儀后面的廢液出口處安裝好廢液缸;6.3.2.3根據(jù)控制面板指示,選定Manual Mode, 按Enter鍵進(jìn)入溫度設(shè)定界面,輸入溫度為45后,再按Enter鍵確認(rèn)并進(jìn)行升溫;6.3.2.4用60ml左右蒸餾水充滿反應(yīng)室,放置好金屬多孔板并打開(kāi)水泵,排出多孔板上面的水分后關(guān)閉水泵;6.3.2.5將與實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)相對(duì)應(yīng)孔數(shù)的塑料
10、薄膜放置在金屬多孔板上;6.3.2.6用鑷子將雜交膜放置在塑料薄膜對(duì)應(yīng)開(kāi)孔上,如有多余開(kāi)孔則用parafilm封口膜或塑料片覆蓋,這一步要確保雜交膜濕潤(rùn)且沒(méi)有氣泡;雜交膜放置的時(shí)候要注意用來(lái)定位的兩個(gè)加號(hào)向上放置;6.3.2.7在雜交膜上面放置硅膠封圈和15孔分隔室,固定好壓扣蓋(注意:固定時(shí)應(yīng)對(duì)準(zhǔn)反應(yīng)室尾部?jī)蓚€(gè)孔按下往前推到底);6.3.2.8開(kāi)泵將雜交膜上的所有液體全部排除完全,然后才關(guān)泵.6.3.3導(dǎo)流雜交操作6.3.3.1從水浴鍋中取出預(yù)熱到45的雜交液,在有雜交膜的雜交孔內(nèi)加入1ml預(yù)熱至45的雜交液,蓋上蓋板溫育至少2分鐘。將雜交液放回水浴鍋中繼續(xù)水?。?.3.3.2將PCR產(chǎn)物放
11、入PCR儀中進(jìn)行95變性7-8 min;6.3.3.3從冰箱中取出冰塊,放入塑料盒中,加少許自來(lái)水,制成冰水。將PCR管從PCR儀中取出,插入支架上直接放入冰水中,確保PCR管底部完全浸入冰水中,冰水浴2-5 min;6.3.3.4開(kāi)泵,排出步驟7.3.1.1的1ml雜交液,關(guān)泵;6.3.3.5從水浴鍋中取出預(yù)熱到45的雜交液,吸取0.5ml預(yù)熱的雜交液,加到反應(yīng)槽每個(gè)孔中。6.3.3.6按照樣本編號(hào),將冰水浴中的第一個(gè)PCR產(chǎn)物取出,全部吸取加入第一個(gè)反應(yīng)槽孔中,用槍頭輕力混勻(此步驟的移液槍頭均要求每加一個(gè)樣本換一次,并且不要用力吹打,以免移液槍受污染), 依次按照以上步驟,第二個(gè)、第三個(gè)
12、,直到所有實(shí)驗(yàn)樣本均加入到雜交孔中。若設(shè)將陰性對(duì)照,則加入第一個(gè)分隔孔,陽(yáng)性對(duì)照加入最后一個(gè)分隔孔。6.3.3.7蓋上蓋板,45條件下雜交10min。將雜交液重新放入水浴鍋中;6.3.3.8對(duì)照離心管架上的1.5ml離心管樣本編號(hào),確認(rèn)樣本加樣無(wú)誤后,將樣本編號(hào)及加樣位置記錄在記錄本上。如果這些樣本中有陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照樣本,則將陰性對(duì)照加入第一個(gè)分隔孔,陽(yáng)性對(duì)照加入最后一個(gè)分隔孔。6.3.3.9雜交后,開(kāi)泵進(jìn)行導(dǎo)流雜交,將雜交膜上的溶液排凈,關(guān)泵;6.3.3.10從水浴鍋中取出預(yù)熱到45的雜交液,吸取0.8ml沖洗膜,開(kāi)泵將雜交膜上的溶液排凈,關(guān)泵;此步驟重復(fù)三次。6.3.4顯色過(guò)程:6.3
13、.3.1按ESC鍵進(jìn)入溫度修改界面,設(shè)定雜交儀溫度為25后按Enter鍵確認(rèn);6.3.3.2加入0.5ml封阻液封閉膜,開(kāi)泵排凈所有預(yù)封阻的封阻液,關(guān)泵 (此步不必降到25就可進(jìn)行);6.3.3.3再加入0.5ml封阻液封閉膜,蓋上蓋板封閉5 min(此步不必降到25就可進(jìn)行);6.3.3.4開(kāi)泵,將步驟7.4.16的0.5ml封阻液完全排凈,關(guān)泵;6.3.3.5在溫度為25(1)時(shí), 加入0.5ml酶標(biāo)液,蓋上蓋板溫育3.5分鐘;6.3.3.6開(kāi)泵,將步驟7.4.18的0.5ml酶標(biāo)液徹底排凈,關(guān)泵;6.3.3.7吸取0.8ml溶液A沖洗膜,開(kāi)泵將雜交膜上的溶液徹底排凈,關(guān)泵;6.3.3.8
14、按ESC鍵進(jìn)入溫度修改界面,設(shè)定雜交儀溫度為36后按Enter鍵確認(rèn);6.3.3.9吸取0.8ml溶液A沖洗膜,開(kāi)泵將雜交膜上的溶液徹底排凈,關(guān)泵;此步驟一共重復(fù)3次。6.3.3.10當(dāng)溫度達(dá)到 36 ( 1.0),將配好的NBT/BCIP溶液棕色小瓶取出,搖勻,加入0.5ml NBT/BCIP溶液,蓋上蓋板顯色, 6.3.3.11顯色反應(yīng)大概持續(xù)5min,注意顯色不能超過(guò)10min, 2分鐘后打開(kāi)蓋板觀察,如果雜交膜無(wú)顏色反應(yīng)或顏色反應(yīng)較淡則繼續(xù)蓋上蓋板顯色至3.5分鐘再觀察,如果雜交膜顏色反應(yīng)較深,則開(kāi)泵泵出NBT/BCIP溶液,否則多等至5分鐘;6.3.3.12開(kāi)泵,泵出所有NBT/BC
15、IP溶液; 吸取1ml溶液B沖洗膜,開(kāi)泵將雜交膜上的溶液排凈,關(guān)泵;此步驟一共重復(fù)三次; 6.3.3.13吸取1ml蒸餾水沖洗膜,開(kāi)泵將雜交膜上的溶液排凈,關(guān)泵;6.3.3.14打開(kāi)壓扣蓋,拿走分隔室,用鑷子取出雜交膜并放在吸水紙上吸干雜交膜上的水分;根據(jù)記錄本記錄樣本所放順序,將樣本編號(hào)用鉛筆寫(xiě)在雜交膜左下方;6.3.3.15 1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行結(jié)果判讀(具體的結(jié)果判讀見(jiàn)結(jié)果判讀部分)及記錄,同時(shí)將雜交膜放入塑料袋中,室溫黑暗保存;7 注意事項(xiàng)7.1 加入溶液之前, 確保溶液中沒(méi)有沉淀出現(xiàn), 以免影響提取效率。7.2 提取臨床樣本的整個(gè)過(guò)程均應(yīng)該在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行,且將用過(guò)的槍頭打入到裝有10%濃
16、度次氯酸鈉的廢液瓶中, 以免樣品交叉污染,影響后續(xù)的PCR檢測(cè)。7.3 在煮沸樣品時(shí),切記不要讓沸水濺入到樣品管中。7.4 每次去上清時(shí),盡量去干凈,特別是步驟3, 以免影響提取效果???4000rpm再次離心1-2分鐘后動(dòng)作輕柔的去上清。7.5 在做PCR之前,最好將提取的樣品離心幾秒鐘,取樣時(shí)盡量不要將槍尖碰到管底的沉淀物。7.6.雜交操作應(yīng)在專用導(dǎo)流雜交試驗(yàn)區(qū)完成.7.7.請(qǐng)勿徒手觸摸雜交膜.剪切雜交膜時(shí),請(qǐng)沿雜交膜外邊界剪切。對(duì)雜交膜進(jìn)行操作的時(shí)候,請(qǐng)帶手套使用鑷子,操作過(guò)程中請(qǐng)仔細(xì)小心,切忌劃破雜交膜內(nèi)打印的正方形框內(nèi)區(qū)域.7.8.NBT/BCIP 溶液. 應(yīng)避光操作和保存8 結(jié)果判
17、定肉眼觀察判定結(jié)果,結(jié)果陽(yáng)性為清晰可見(jiàn)的藍(lán)紫色圓點(diǎn)。根據(jù)膜條上HPV分布圖判讀陽(yáng)性點(diǎn)為何種HPV病毒類型。9. 結(jié)果常見(jiàn)問(wèn)題分析弱/無(wú)信號(hào)樣品中HPV DNA的含量很低。確保PCR產(chǎn)物完全變性成單鏈,如有必要,在使用前再次變性PCR產(chǎn)物。IC及HPV分型陽(yáng)性點(diǎn)不顯色 (如右圖)可能存在PCR抑制劑,可用1:10或1:40稀釋DNA模板重復(fù)PCR過(guò)程,然后再雜交分析。IC點(diǎn)弱/不顯色,但HPV分型陽(yáng)性點(diǎn)顯色(如右圖)由于IC和HPV DNA之間存在競(jìng)爭(zhēng),高濃度的HPV DNA可能會(huì)對(duì)IC點(diǎn)的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制,此現(xiàn)象出現(xiàn)時(shí)如HPV分型點(diǎn)顯色正常,則認(rèn)為分型結(jié)果正確。4Biotin點(diǎn)不顯色請(qǐng)確
18、認(rèn)所使用試劑是否仍在有效期內(nèi)。確定實(shí)驗(yàn)操作是否嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行、試劑是否按要求保存使用。5陰性對(duì)照顯現(xiàn)HPV分型陽(yáng)性點(diǎn)PCR試劑可能被污染,取5 ml PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。重復(fù)進(jìn)行PCR及雜交試驗(yàn)。6很高的背景可能由于封閉不足,使未結(jié)合的酶標(biāo)殘留在膜上。確保封閉液完全覆蓋整個(gè)雜交膜。也可能因?yàn)闆](méi)有完全將未結(jié)合的試劑清洗干凈,請(qǐng)確保在顯色過(guò)程中雜交膜充分清洗,無(wú)剩余殘留液體。7雜交結(jié)果中IC點(diǎn)不清楚,同時(shí)陽(yáng)性點(diǎn)也不清楚或者比較淡;可能原因: 雜交溫度控制不當(dāng),出現(xiàn)非特異性雜交點(diǎn); 樣本中HPV病毒DNA的濃度本身含量就很少; DNA樣本中有對(duì)PCR反應(yīng)的抑制物質(zhì),影響了PCR
19、擴(kuò)增的效率; 解決方法:將DNA樣本稀釋10倍后,重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增及雜交反應(yīng)。8雜交結(jié)果中IC點(diǎn)沒(méi)有,同時(shí)陽(yáng)性點(diǎn)淡而且不清楚;可能原因: 樣本中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì); 樣本中HPV DNA濃度較低,同樣本中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì); 病人樣本不符合凱普分型試驗(yàn)要求,樣本本身為陰性結(jié)果,但因?yàn)闃颖局杏幸种芇CR反應(yīng)的物質(zhì),同時(shí)操作人員對(duì)雜交溫度又控制不當(dāng),出現(xiàn)非特異性雜交點(diǎn); 解決方法:增加用于擴(kuò)增DNA濃度,重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增及雜交反應(yīng)。9雜交結(jié)果中,在雜交膜上既無(wú)IC點(diǎn),也沒(méi)有HPV分型陽(yáng)性點(diǎn)顯色;可能原因:可能是因?yàn)镈NA模板中存在抑制PCR反應(yīng)的抑制物質(zhì),首先,通過(guò)抽提得到的DNA
20、的純度對(duì)PCR反應(yīng)會(huì)有很大影響,所以必須在做PCR模板的時(shí)候?qū)⑵湎♂審亩档虳NA溶液中抑制劑的濃度,使得PCR反應(yīng)能正常進(jìn)行,在一家新的醫(yī)院開(kāi)始試驗(yàn)的時(shí)候均需要摸索本院樣本自身的特點(diǎn)。或者所取樣本,不符合凱普HPV分型檢測(cè)說(shuō)明書(shū)中對(duì)樣本的要求,樣本之前經(jīng)過(guò)碘染色或者病人使用了陰道沖洗藥物,均會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制。確保PCR產(chǎn)物完全變性成單鏈,如有必要,在使用前再次變性PCR產(chǎn)物。解決方法:如果這些情況的時(shí)候,對(duì)樣本稀釋10倍重新PCR,然后雜交,結(jié)果仍然不成功的情況下,建議按照凱普說(shuō)明書(shū)要求重新取樣檢測(cè)。10.室內(nèi)質(zhì)控Biotin對(duì)照點(diǎn)反映酶與底物反應(yīng),在檢測(cè)中正常應(yīng)為陽(yáng)性反應(yīng)。IC點(diǎn)為內(nèi)
21、對(duì)照點(diǎn),是添加在PCR反應(yīng)體系內(nèi)的質(zhì)控模板DNA探針,若擴(kuò)增反應(yīng)體系存在抑制因素,則IC點(diǎn)不顯色。試劑盒附帶陰性和陽(yáng)性對(duì)照,可指示反應(yīng)是否存在污染及各反應(yīng)步驟是否正常。并不是每次試驗(yàn)都設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照,只有在下列情況下需要做: 當(dāng)新開(kāi)展試驗(yàn)時(shí),或更換試驗(yàn)地點(diǎn)時(shí),需要進(jìn)行陰陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn); 當(dāng)使用的檢測(cè)試劑批次改變的時(shí)候需要做1次陰陽(yáng)性對(duì)照;當(dāng)雜交結(jié)果出現(xiàn)令人疑惑,比如多個(gè)樣本的雜交結(jié)果一樣,或者雜交結(jié)果出現(xiàn)過(guò)多的多重感染,以及雜交試驗(yàn)后出現(xiàn)許多無(wú)IC點(diǎn)及陽(yáng)性雜交點(diǎn)的結(jié)果等情況下,需要使用同批試劑進(jìn)行陰陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)以驗(yàn)證問(wèn)題所在;11 操作性能11.1. 靈敏度:25-65拷貝。11.2. 特異性:96%,不會(huì)發(fā)生交叉雜交反應(yīng)。11.3.檢測(cè)率:可同時(shí)檢測(cè)21種HPV亞型,并能檢測(cè)多重感染。11.4. 分析范圍:陰陽(yáng)性。12.局限性12.1. 1 本試劑僅用于診斷分型以下21HPV亞型:13種高危型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68,5種低危型6、11、42、43、44,及中國(guó)人群常見(jiàn)型53、66、CP8304。12.2.由于個(gè)別病例可能感染量較少(低于檢測(cè)靈敏度),因此陰性結(jié)果并不能完全排除HPV感染的可能性。12.3.由于采樣不規(guī)范可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。12.4.本試劑盒試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)與其它臨床數(shù)據(jù)結(jié)合起來(lái)解釋。13.參考范
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