免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上免疫實(shí)驗(yàn)抗血清制備及抗體效價(jià)檢測(cè)摘要：用具有抗原性的物質(zhì)牛血清白蛋白（BSA)注入到健康動(dòng)物例如鼠、兔的機(jī)體后，將引起免疫應(yīng)答，并會(huì)形成漿細(xì)胞，分泌抗體?？贵w主要存在于血清中，經(jīng)多次免疫，使血清中的抗體量達(dá)到要求濃度，然后采集動(dòng)物血液，再?gòu)难褐蟹蛛x析出血清，從而獲得抗血清。抗血清，是指含有免疫蛋白的血清?？贵w效價(jià)指抗體的物理狀態(tài)及其在體內(nèi)滯留時(shí)間，以其與抗原反應(yīng)的多少來(lái)表示其免疫效果。此次實(shí)驗(yàn)主要是進(jìn)行小鼠的牛血清白蛋白（BSA)抗血清的制備過(guò)程，并通過(guò)酶免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對(duì)其進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)。關(guān)鍵字：牛血清白蛋白（BSA) 抗血清 抗體效價(jià) 免疫實(shí)驗(yàn)過(guò)程：

2、本次實(shí)驗(yàn)一共分為三個(gè)分實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)一：免疫實(shí)驗(yàn)二：抽血、放血，分離抗血清 實(shí)驗(yàn)三：ELISA測(cè)定抗體效價(jià)實(shí)驗(yàn)一：免疫一、抗血清制備的原理用具有抗原性的物質(zhì)注入到健康動(dòng)物的機(jī)體后，將引起免疫應(yīng)答，并會(huì)形成漿細(xì)胞，分泌抗體?？贵w主要存在于血清中，經(jīng)多次免疫，使血清中的抗體量達(dá)到要求濃度，然后采集動(dòng)物血液，再?gòu)难褐蟹蛛x析出血清，從而獲得抗血清。二、目的制備高效價(jià)的抗血清三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑實(shí)驗(yàn)儀器：1mL 注射器，酒精棉球，剪刀材料：家兔，小鼠試劑：35苦味酸溶液或8090苦味酸，牛血清白蛋白（BSA)三、方法和步驟1、動(dòng)物編號(hào)左前腿上部為1，左腰部為2，左后腿為3，頭部為4，背部為5，尾基部為

3、6，右側(cè)從前至后依次為7、8、9。紅色表示十位數(shù),用黃色表示個(gè)位數(shù)。免疫前用金屬編號(hào)牌固定兔耳，或用染料涂沫在動(dòng)物的背部，作出明確的標(biāo)記。2、動(dòng)物抓取及注射按如下圖所示抓取目標(biāo)動(dòng)物 家兔為300600 g/次（400），每次不超過(guò)2mL；小鼠為10100 g /次（10-20，2040 g / ml），每次不超過(guò)0.5mL。小鼠腹腔注射以左手抓住動(dòng)物，使腹部向上，右手將注射針頭于左（或右）下腹部刺入皮下，使針頭向前推 0.51.0cm，再以45度角穿過(guò)腹肌，固定針頭，緩緩注入藥液，為避免傷及內(nèi)臟，可使動(dòng)物處于頭低位，使內(nèi)臟移向上腹。兔子可以分別嘗試皮下（腳掌）、皮內(nèi)、耳靜脈、肌肉注射

4、實(shí)驗(yàn)二：抽血、放血，分離抗血清一、采血小鼠采血（一）、尾部采血：需血量少時(shí)可用此方法。將小鼠放在在有開孔的離心管內(nèi)，顯露尾部，將尾端剪去約 5mm，從尾根部向尾端部按摩，血即從斷端流出。（二）、小鼠睚眥采血：將毛細(xì)管折斷，使其斷口鋒利。采血時(shí)，左手拇指和食指抓住鼠兩耳之間的皮膚使鼠固定，并用中指配合，輕輕壓迫頸部?jī)蓚?cè)，阻礙靜脈回流，使眼球充分外突，提示眼眶后靜脈叢充血。用毛細(xì)管的斷口，右手拇指、食指和中指握住毛細(xì)管，將其尖端插入內(nèi)眼角與眼球之間，輕輕向眼底方向刺入約 23mm，手指旋轉(zhuǎn)捻動(dòng)毛細(xì)管以刺破靜脈叢，鼠血順毛細(xì)管流入 1.5mL 無(wú)菌離心管中，收集鼠血。采血結(jié)束后，拔出取血管，放松左手

5、，出血即停止。用本法短期內(nèi)可重復(fù)采血。小鼠一次可采血 0.20.3 ml，大鼠一次可采 0.50.1ml。家兔的采血（一）、耳靜脈抽血：將家兔置于兔固定箱內(nèi)，對(duì)家兔進(jìn)行耳靜脈抽血，此法用于小量抽血，驗(yàn)血測(cè)抗體效價(jià)，以便決定加強(qiáng)免疫或放血，與耳靜脈注射方式相反。 （二）、心臟抽血：家兔固定（仰臥）-準(zhǔn)確找到心臟部位-剪毛（心臟部位）-消毒-進(jìn)針（50ml注射器接帶硅膠管的12號(hào)針頭）抽血，抽至50ml，從硅膠管接頭處取下注射器，拔針頭，將血液注入100ml無(wú)菌空三角瓶，再重復(fù)上述操作繼續(xù)抽血，直至抽完。（三）、頸動(dòng)脈放血：家兔固定（仰臥，身體及頭部固定）-剪毛（頸部）-找頸動(dòng)脈管（消毒-剖開頸部

6、；開皮、膜、肌肉，找到氣管兩邊的頸動(dòng)脈管（桃紅色，有脈動(dòng)）-小心分開動(dòng)脈上的肌肉、神經(jīng)（2條，白色）等-開口（見圖）-放血，接入100ml無(wú)菌空三角瓶。注意：看到氣管，停用所有銳器，可用止血鉗、鈍玻棒。注意不要剪破毛細(xì)動(dòng)脈管！二、抗血清的分離，保存1、斜置裝血液的三角瓶0.5-1h；2、用無(wú)菌玻棒剝落、松動(dòng)瓶壁上的血塊（利于血清析出）；3、原樣包扎好，做好記號(hào)，放進(jìn)冰箱（4）過(guò)夜；4、次日：估計(jì)分離的血清量并觀察描述血清顏色；去血塊，離心取上清（3000rpm,20min），加疊氮鈉（終濃度為0.1%），混勻，分裝小管，作好標(biāo)記，-20或-80保存待測(cè)。實(shí)驗(yàn)三：酶免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）測(cè)

7、定抗體效價(jià)一、ELISA原理酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay， 簡(jiǎn)稱ELISA)是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)。ELISA過(guò)程包括抗原(抗體)包被在固相載體上，加待測(cè)抗體(抗原), 再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體(抗原)，生成抗原(抗體)-待測(cè)抗體(抗原)-酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體(抗原)的量。二、實(shí)驗(yàn)儀器、材料、試劑儀器：酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀、保鮮膜、排槍材料：牛血清白蛋白（BSA) 抗原，10 g/ml溶液，包被液配制鼠抗BSA 待測(cè)抗體樣品，用PBST從1：1000開始倍比

8、稀釋，連續(xù)稀釋8個(gè)稀釋度HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG 二抗（按說(shuō)明書稀釋使用，用PBST稀釋。）試劑：包被緩沖液：0.05 M pH 9.6碳酸鹽緩沖液（Na2CO3 1.59克，NaHCO3 2.93克，加水900ml，調(diào)pH，再定容至1L）0.01M PBS溶液（NaCl 8.5 g, Na2HPO4.12H2O 2.85g或Na2HPO4.2H2O 1.13g，KCl 0.2g， KH2PO4 0.27g，蒸餾水定容至1000ml，pH7.4）PBST洗滌液：含0.05 % Tween 20的0.01 M 的PBS（ pH 7.4 ）底物溶液：（ 3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺）2M H2SO

9、4 （市售濃硫酸為18.4 M，根據(jù)要配制的2M硫酸體積，吸管吸好相應(yīng)體積濃硫酸沿著器壁緩慢加到水中）三、實(shí)驗(yàn)方法和步驟1.加抗原：取酶標(biāo)板，加入100l/孔的抗原溶液（用包被緩沖液稀釋，用排槍加）2.包被抗原：保鮮膜包好， 37 1h或4 過(guò)夜（抗原分子通過(guò)疏水作用力結(jié)合到96微孔板上）3.封閉：甩干后以PBST（200l/孔）洗滌3次，3min/次，每孔加入100 l 5%（W/V)脫脂奶粉溶液（用PBS溶液配制）。保鮮膜包好， 37， 2h后（封閉的目的：降低背景干擾，避免假陽(yáng)性），取出包被、封閉好抗原的酶標(biāo)板,甩干孔內(nèi)液體。以PBST（200l/孔）洗滌3次，3min/次4.加待測(cè)血清

10、：標(biāo)記各孔，加入相應(yīng)稀釋度的抗體100l/孔（用PBST稀釋，按示意圖用單槍加）。37，保鮮膜包好，60min后甩干孔內(nèi)液體5.加二抗：以PBST（200l/孔）洗滌4次，3min/次。各孔加入酶標(biāo)二抗100l/孔，37，保鮮膜包好，45min后，甩干孔內(nèi)液體6.顯色：以PBST（200l/孔）洗滌4次，3min/次。加入TMB底物溶液50L/孔，避光顯色10min(抽屜中），然后每孔加入50 l 的2M 硫酸終止反應(yīng)7.結(jié)果分析在酶標(biāo)儀上，于450nm處測(cè)各孔OD值。陰性無(wú)色，OD小于0.1；陽(yáng)性黃色，3個(gè)重復(fù)的平均值大于0.2，且為陰性對(duì)照OD值的2.0倍。打開“酶免大師”，登錄密碼“12

11、34”，設(shè)置參數(shù)，選“終點(diǎn)法檢測(cè)”，建微板，點(diǎn)擊“read”，等待讀取各孔OD值，導(dǎo)出。經(jīng)免疫小鼠123456未免疫家兔789101112A0.2080.1880.1930.040.0470.047B0.1480.1410.1440.0480.0440.044C0.10.0910.0920.0390.0390.039D0.0720.0560.0630.040.0450.039E0.0640.0570.0540.0430.0380.045F0.057O.O540.0520.0430.0410.038G0.0490.0510.0490.0440.0450.035H0.0530.0480.0400.0430.040.04結(jié)論：由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫效果不好等原因，所得OD值太小，小鼠免疫還可以，初步判斷抗原效價(jià)為一價(jià)。未免疫家兔的血清測(cè)定的OD值很小，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)材料沒有很大的污染。穿插實(shí)驗(yàn);玻片法血型鑒定實(shí)驗(yàn)材料：1、Ag：受檢血樣（紅細(xì)胞懸液）2、Ab：標(biāo)準(zhǔn)抗A血清、標(biāo)準(zhǔn)抗B血清（單克隆抗體，不同于標(biāo)準(zhǔn)A型血清、B型血清）。實(shí)驗(yàn)方法和步驟：1、受檢