植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)課件

1、植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)第三章第三章 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅滅菌方法、無(wú)菌操作技術(shù)菌方法、無(wú)菌操作技術(shù)內(nèi)容：內(nèi)容：滅菌滅菌無(wú)菌操作無(wú)菌操作愈傷組織的分化與再分化、脫分化愈傷組織的分化與再分化、脫分化形態(tài)發(fā)生形態(tài)發(fā)生植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)教學(xué)目的要求1掌握外植體的選擇條件與消毒方法；掌握外植體的選擇條件與消毒方法；2掌握外植體接種操作步驟及培養(yǎng)的環(huán)境掌握外植體接種操作步驟及培養(yǎng)的環(huán)境 條件；條件；3了解愈傷組織形成的條件及愈傷組織形了解愈傷組織形成的條件及愈傷組織形成過程、形態(tài)發(fā)生的調(diào)控方法，掌握愈傷組成過程、形態(tài)發(fā)生的調(diào)控方法

2、，掌握愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式和植物組織培養(yǎng)中愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式和植物組織培養(yǎng)中愈傷組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)技術(shù)?？椗囵B(yǎng)的基礎(chǔ)技術(shù)。4一般掌握離體葉片和離體根培養(yǎng)基本過一般掌握離體葉片和離體根培養(yǎng)基本過程（選修）；掌握離體莖培養(yǎng)的種類和操作程（選修）；掌握離體莖培養(yǎng)的種類和操作步驟；步驟；植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)本節(jié)教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：重點(diǎn)：重點(diǎn)：無(wú)菌操作技術(shù)；組培苗的培養(yǎng)難點(diǎn)：難點(diǎn)：無(wú)菌操作技術(shù)植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 外植體的選擇和消毒外植體的選擇和消毒一、外植體的選擇一、外植體的選擇 選取性狀優(yōu)良的種質(zhì)或特殊的基因型 1.選擇健壯的植株

3、選擇健壯的植株 ： 健壯、無(wú)病蟲健壯、無(wú)病蟲 、發(fā)育正常、發(fā)育正常 代謝旺盛，再生能力強(qiáng)，培養(yǎng)后比較容易成功 2.選擇最適的時(shí)期選擇最適的時(shí)期 ：旺盛生長(zhǎng)期旺盛生長(zhǎng)期 注意植物的生長(zhǎng)季節(jié)和生長(zhǎng)發(fā)育階段：莖尖、花蕾、嫩葉 生長(zhǎng)時(shí)間較長(zhǎng)的塊莖、鱗莖、球莖等，往往由于攜菌量較多，不易消毒而難以培養(yǎng)成功。 3.選取適宜的大小選取適宜的大小 ：一般一般0.5-1cm; 脫毒脫毒0.2-0.3mm 材料太大易污染，也不需要；材料太小，易受 傷害脅迫、多形成愈傷組織， 甚至難于成活 植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)外植體（葉）的各個(gè)部分其芽、苗再生能力也很不相同外植體（葉）的各個(gè)部分其芽、

4、苗再生能力也很不相同 膠皮楓香樹（Liquidamnbar styraciflua “Variegata”）葉片外植體的供體及葉的部位對(duì)其不定芽形成的影響外植體部位每個(gè)外植體形成不定芽分生組織的數(shù)目由培養(yǎng)基上增殖苗中的葉片由溫室生長(zhǎng)2年的完整植株上的葉片葉 柄葉 片總 數(shù)6.78.014.76.750.357.0外植體培養(yǎng)于WPM附加0.1mg/L NAA和2.5mg/L BA的培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)用外植體數(shù)為70植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)二、滅菌與消毒二、滅菌與消毒（一）有菌和無(wú)菌的范疇（一）有菌和無(wú)菌的范疇有菌的范疇是：有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，凡是暴露在空氣

5、中的物體，它的表面都是有菌的。它的表面都是有菌的。無(wú)菌的范疇：無(wú)菌的范疇： 經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過后的物體，經(jīng)其經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理的或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體。他物理的或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體。植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)菌類：菌類： 細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。茵的特點(diǎn)茵的特點(diǎn)： 極小極小，肉眼看不見；，肉眼看不見； 無(wú)處不有，無(wú)處不有，適應(yīng)能力強(qiáng)；適應(yīng)能力強(qiáng)； 繁殖力極強(qiáng)繁殖力極強(qiáng)，條件適宜時(shí)便可大量滋生。，條件適宜時(shí)便可大量滋生。消毒：消毒： 指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之

6、不指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用的過程。再發(fā)生危害作用的過程。植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)（二）常用的滅菌與消毒方法（二）常用的滅菌與消毒方法滅菌方法滅菌方法： 物理方法：物理方法：如干熱如干熱(烘燒和灼燒烘燒和灼燒)、濕熱、濕熱(常常壓或高壓蒸煮壓或高壓蒸煮)、射線處理、射線處理(紫外線、超聲波、紫外線、超聲波、微波微波)、過濾、清洗和大量無(wú)菌水沖洗等滅、過濾、清洗和大量無(wú)菌水沖洗等滅菌措施；菌措施； 化學(xué)方法：化學(xué)方法：使用升汞、甲醛、過氧化氫、使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來(lái)蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、高錳酸鉀、來(lái)蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗

7、菌素、酒精化學(xué)藥品處理，以達(dá)滅菌效抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理，以達(dá)滅菌效果。果。植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)1. .濕熱滅菌（培養(yǎng)基）濕熱滅菌（培養(yǎng)基）高壓滅菌的原理：高壓滅菌的原理：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在也隨之增加。在o1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121。在。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。孢。常用方法：常用方法：關(guān)閉放氣閥，

8、通電后，待壓力上升到關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到O05MPa時(shí)，關(guān)電源，打開放氣閥，放出空氣，待壓力時(shí)，關(guān)電源，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升達(dá)到升達(dá)到01MPa開始計(jì)時(shí)，壓力開始計(jì)時(shí)，壓力01-015MPa，20min。注意：注意：1、培養(yǎng)基在制備后的、培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。內(nèi)完成滅菌工序。 2、完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸、完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸 氣，滅菌才能徹底氣，滅菌才能徹底。植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)2.灼燒滅菌（用于無(wú)菌操

9、作的器械灼燒滅菌（用于無(wú)菌操作的器械 ）鑷子、剪子、解剖刀等：鑷子、剪子、解剖刀等：浸入浸入95%的酒精中的酒精中酒精燈火焰上灼燒滅菌酒精燈火焰上灼燒滅菌冷卻后，立即使用。冷卻后，立即使用。植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)3.干熱滅菌（干熱滅菌（玻璃器皿及耐熱用具）玻璃器皿及耐熱用具）利用烘箱加熱到利用烘箱加熱到160-180C的溫度（的溫度（持續(xù) 90min）來(lái)殺死微生物。來(lái)殺死微生物。注意：注意：1、干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并干燥，工具等要妥為干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時(shí)重新污染。包扎可用耐高溫的包扎，以免滅菌后取用時(shí)重新污染。包扎可

10、用耐高溫的塑料。塑料。2、滅菌時(shí)應(yīng)漸進(jìn)升溫，達(dá)到預(yù)定溫度后記錄時(shí)間。、滅菌時(shí)應(yīng)漸進(jìn)升溫，達(dá)到預(yù)定溫度后記錄時(shí)間。3、烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過多，以免妨礙熱對(duì)、烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過多，以免妨礙熱對(duì)流和穿透；流和穿透；4、到指定時(shí)間斷電后，待充分冷涼，才能打開烘箱，、到指定時(shí)間斷電后，待充分冷涼，才能打開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。以免因驟冷而使器皿破裂。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：干熱滅菌能源消耗太大，浪費(fèi)時(shí)間。干熱滅菌能源消耗太大，浪費(fèi)時(shí)間。 植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)4.過濾滅菌（不耐熱的物質(zhì)過濾滅菌（不耐熱的物質(zhì) ）對(duì)象：對(duì)象：不耐熱又不能用高壓滅菌處理的不耐熱又不能

11、用高壓滅菌處理的制劑。如：一些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、制劑。如：一些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素等玉米素、脫落酸和某些維生素等。濾膜網(wǎng)孔直徑：濾膜網(wǎng)孔直徑：0.45m以下，當(dāng)溶液通過濾膜后，細(xì)菌的細(xì)胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻。植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)5. .紫外線和熏蒸滅菌（空間）紫外線和熏蒸滅菌（空間）(1)紫外線滅菌紫外線滅菌 紫外線的波長(zhǎng)為紫外線的波長(zhǎng)為200300nm，其中以，其中以260nm的殺菌的殺菌能力最強(qiáng)，要求距照射物以不超過能力最強(qiáng)，要求距照射物以不超過1.2m為宜。為宜。(2)熏蒸滅菌熏蒸滅菌 使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴(kuò)散

12、到空氣中，以殺死空氣使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴(kuò)散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。方法簡(jiǎn)便，空間關(guān)閉緊密即可。和物體表面的微生物。方法簡(jiǎn)便，空間關(guān)閉緊密即可。 常用熏蒸劑：常用熏蒸劑：高錳酸鉀、甲醛高錳酸鉀、甲醛。 常用方法：常用方法：房間關(guān)閉緊密，按房間關(guān)閉緊密，按58mlm3用量，將用量，將甲醛置于廣口容器中，加甲醛置于廣口容器中，加5g/m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時(shí)，房間可預(yù)先噴濕以加強(qiáng)效果。時(shí)，房間可預(yù)先噴濕以加強(qiáng)效果。植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)6.噴霧滅菌（物體表面）噴霧滅菌（物體表面）70%75%的酒精的酒精l%-2%的來(lái)蘇兒溶液的

13、來(lái)蘇兒溶液 涂擦、噴霧涂擦、噴霧0.25%1%的新潔爾滅的新潔爾滅（桌面、墻面、雙手、植物材料表面等）（桌面、墻面、雙手、植物材料表面等）植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)7.植物材料表面用消毒劑滅菌植物材料表面用消毒劑滅菌 第一步：第一步： 1、將采來(lái)的植物材料除去不用的部分，仔細(xì)、將采來(lái)的植物材料除去不用的部分，仔細(xì)洗干凈。洗干凈。 2、切割成適當(dāng)大?。礈缇萜髂芊湃藶?、切割成適當(dāng)大?。礈缇萜髂芊湃藶橐耍?。宜）。 3、置自來(lái)水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時(shí)、置自來(lái)水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時(shí)（可加入（可加入 洗衣粉）。洗衣粉）。植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)

14、菌操作技術(shù)第二步：第二步：是對(duì)材料的表面浸潤(rùn)滅菌。是對(duì)材料的表面浸潤(rùn)滅菌。 1.準(zhǔn)備工作：準(zhǔn)備工作：準(zhǔn)備好消毒的燒杯、玻璃棒、準(zhǔn)備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%75%酒精、酒精、消毒液、無(wú)菌水、手表等。消毒液、無(wú)菌水、手表等。 2.酒精浸潤(rùn)消毒：酒精浸潤(rùn)消毒：用用70%酒精浸酒精浸1030s。70%酒精穿透力強(qiáng)，也酒精穿透力強(qiáng)，也很易殺傷植物細(xì)胞，所以浸潤(rùn)時(shí)間不能過長(zhǎng)。很易殺傷植物細(xì)胞，所以浸潤(rùn)時(shí)間不能過長(zhǎng)。植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)3. 化學(xué)滅菌劑處理化學(xué)滅菌劑處理消毒劑消毒原理：消毒劑消毒原理： 利用氯氣、重金屬、原子態(tài)氧來(lái)殺菌。利用氯氣、重金屬、原子態(tài)氧來(lái)殺菌。滅菌

15、劑滅菌劑使用濃度使用濃度(%)持續(xù)時(shí)間持續(xù)時(shí)間（min）去除的難去除的難易易效果效果次氯酸次氯酸鈣鈣910530易易很好很好次氯酸次氯酸鈉鈉2530易易很好很好氯化汞氯化汞0.1158較難較難最好最好抗菌素抗菌素450mg/L3060中中較好較好常用滅菌劑使用濃度及效果比較表常用滅菌劑使用濃度及效果比較表植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)第三步第三步.無(wú)菌水涮洗無(wú)菌水涮洗 是免除消毒劑殺傷植物細(xì)胞的副作用。是免除消毒劑殺傷植物細(xì)胞的副作用。 滅菌后用無(wú)菌水涮洗滅菌后用無(wú)菌水涮洗34次即可；次即可； 升汞殘毒較難去除，所以應(yīng)當(dāng)用無(wú)菌水涮洗升汞殘毒較難去除，所以應(yīng)當(dāng)用無(wú)菌水涮洗61

16、0次。次。植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) 外植體的接種和培養(yǎng)外植體的接種和培養(yǎng) 一、無(wú)菌操作一、無(wú)菌操作： 經(jīng)過必要消毒的經(jīng)過必要消毒的操作者操作者在嚴(yán)格滅菌在嚴(yán)格滅菌的的操作空間操作空間(接種室、超凈臺(tái)等接種室、超凈臺(tái)等)使用消使用消過毒的過毒的器皿器皿所進(jìn)行的操作。所進(jìn)行的操作。植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)（一）無(wú)菌操作步驟（一）無(wú)菌操作步驟（實(shí)驗(yàn)課（實(shí)驗(yàn)課 ）(1)接種室消毒：在接種前用甲醛熏蒸接種室，在接種前接種室消毒：在接種前用甲醛熏蒸接種室，在接種前20min，打開超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外燈打開超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫

17、外燈(2)擺放接種用具：將培養(yǎng)基、接種用具等分別防入小推車或超凈擺放接種用具：將培養(yǎng)基、接種用具等分別防入小推車或超凈工作臺(tái)上工作臺(tái)上(無(wú)菌水無(wú)菌水.鑷子鑷子.解剖刀解剖刀.酒精棉酒精棉.酒精燈酒精燈.培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿.小燒杯等小燒杯等)(3)進(jìn)入接種室：接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，進(jìn)入接種室：接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等；并換穿拖鞋等；(4)手及臺(tái)面消毒：用手及臺(tái)面消毒：用70%酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后按一定順序擦拭工作臺(tái)面；后按一定順序擦拭工作臺(tái)面；(5)培養(yǎng)材料滅菌：將接種材料預(yù)先放入燒杯，置入超凈臺(tái)進(jìn)行表

18、培養(yǎng)材料滅菌：將接種材料預(yù)先放入燒杯，置入超凈臺(tái)進(jìn)行表面消毒。面消毒。(6)接種用具滅菌：先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子接種用具滅菌：先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子浸泡在浸泡在95%酒精并取出從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端酒精并取出從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對(duì)培養(yǎng)皿要過火烤干；處，對(duì)培養(yǎng)皿要過火烤干；(7)接種完畢后要清理干凈工作臺(tái)，可用紫外燈滅菌接種完畢后要清理干凈工作臺(tái)，可用紫外燈滅菌30min。注：接種時(shí)，接種員雙手不能離開工作臺(tái)，不能說話、走動(dòng)和咳注：接種時(shí)，接種員雙手不能離開工作臺(tái)，不能說話、走動(dòng)和咳嗽等；若連續(xù)接種，每嗽等；若連續(xù)接種，每5天要大

19、強(qiáng)度滅菌一次。天要大強(qiáng)度滅菌一次。植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)（二）接種技術(shù)（二）接種技術(shù) （實(shí)驗(yàn)課） 1. 消毒：消毒： 將初步洗滌及切割的材料放人燒杯，帶入超凈臺(tái)上，用消毒劑滅菌，再將初步洗滌及切割的材料放人燒杯，帶入超凈臺(tái)上，用消毒劑滅菌，再用無(wú)菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的用無(wú)菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的4層紗布上或?yàn)V紙上。層紗布上或?yàn)V紙上。 2. 取材：取材： 材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那胁牧衔珊螅皇帜描囎?，一手拿剪子或解剖刀，?duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈?。如葉片切成割。如葉片切成0.5cm見方的小塊；莖切

20、成含有一個(gè)節(jié)的小段。在接種過程見方的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。 3. 接種：接種： 用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。接種后，用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。接種后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘，蓋上瓶蓋。將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘，蓋上瓶蓋。 具體操作過程是：先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管囗靠近具體操作過程是：先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管囗靠近酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動(dòng)，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。然后用酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動(dòng)，

21、使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基。若是葉片直接鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上，以放附在培養(yǎng)基上，以放13塊為宜。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放塊為宜。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放(尖端向上尖端向上)外，其他尚無(wú)統(tǒng)一要求。外，其他尚無(wú)統(tǒng)一要求。 4. 標(biāo)記：標(biāo)記： 注明接種日期、培養(yǎng)基編號(hào)等。注明接種日期、培養(yǎng)基編號(hào)等。植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) 外植體的接種和培養(yǎng)外植體的接種和培養(yǎng)二、培養(yǎng)：二、培養(yǎng)： 指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室(適宜光照、

22、溫適宜光照、溫度條件度條件)里，使之生長(zhǎng)，分裂和分化形成愈傷里，使之生長(zhǎng)，分裂和分化形成愈傷組織或再生植株的過程。組織或再生植株的過程。 植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)1 1培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法(1)固體培養(yǎng)法固體培養(yǎng)法 用瓊脂固化培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)植物材料的方法。用瓊脂固化培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)植物材料的方法。 優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，操作易行。優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，操作易行。 缺點(diǎn)：養(yǎng)分分布不均，生長(zhǎng)速度不均衡，并常有褐化中缺點(diǎn)：養(yǎng)分分布不均，生長(zhǎng)速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。毒現(xiàn)象發(fā)生。(2)液體培養(yǎng)法液體培養(yǎng)法 用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的

23、方法。 優(yōu)點(diǎn)：能均衡提供養(yǎng)分。優(yōu)點(diǎn)：能均衡提供養(yǎng)分。 缺點(diǎn)：透氣性較差。缺點(diǎn)：透氣性較差。 通常需要通過攪動(dòng)或振動(dòng)培養(yǎng)液的方法以確保氧通常需要通過攪動(dòng)或振動(dòng)培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給；速度：一般為氣的供給；速度：一般為50-100rmin。 濾紙橋方法濾紙橋方法植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)2 2培養(yǎng)步驟培養(yǎng)步驟(1)初代培養(yǎng)初代培養(yǎng) 即接種某種外植體后，最初的即接種某種外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。幾代培養(yǎng)。 目目 的：的：獲得無(wú)菌材料和無(wú)性繁殖系。獲得無(wú)菌材料和無(wú)性繁殖系。 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基，即培常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細(xì)胞分裂素和少

24、量的養(yǎng)基中含有較多的細(xì)胞分裂素和少量的生長(zhǎng)素生長(zhǎng)素。 植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)2 2培養(yǎng)步驟培養(yǎng)步驟 (2)繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)（擴(kuò)繁培養(yǎng)）是繼初（擴(kuò)繁培養(yǎng)）是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁培養(yǎng)過程。代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁培養(yǎng)過程。 目的：目的：繁殖出相當(dāng)數(shù)量的無(wú)根苗，最后繁殖出相當(dāng)數(shù)量的無(wú)根苗，最后能達(dá)到邊繁殖邊生根的目的。能達(dá)到邊繁殖邊生根的目的。 擴(kuò)繁的擴(kuò)繁的方法方法：切割莖段、分離芽叢、切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等。分離胚狀體、分離原球莖等。植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù) 2 2培養(yǎng)步驟培養(yǎng)步驟（3）生根培養(yǎng)）生根培養(yǎng)生根培

25、養(yǎng)目的：生根培養(yǎng)目的： 使生出的不定根濃密而粗壯。生根培養(yǎng)基：生根培養(yǎng)基： 可采用12或者1/4MS培養(yǎng)基，降低全部去掉細(xì)胞分裂素，并加入適量的生長(zhǎng)素(NAA、IBA等)。植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)3 3、培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)的、培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)的問題及解決方法問題及解決方法（第四章（第四章 植物組織培養(yǎng)中常見問題及解決辦法）植物組織培養(yǎng)中常見問題及解決辦法）A.培養(yǎng)外植體的污染培養(yǎng)外植體的污染B.初代培養(yǎng)外植體的褐變初代培養(yǎng)外植體的褐變C.繼代培養(yǎng)時(shí)材料的玻璃化初代繼代培養(yǎng)時(shí)材料的玻璃化初代植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅

26、菌方法無(wú)菌操作技術(shù)4.植物組織培養(yǎng)的環(huán)境條件 在植物組織培養(yǎng)中溫度、光照、濕度在植物組織培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、pH值、值、滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都會(huì)影響組滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都會(huì)影響組織培養(yǎng)育苗的生長(zhǎng)和發(fā)育?？椗囵B(yǎng)育苗的生長(zhǎng)和發(fā)育。 植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)溫度溫度(temperature) 一般采用一般采用25 2。低于低于15時(shí)培養(yǎng)，植物組織會(huì)表現(xiàn)生長(zhǎng)停止，高時(shí)培養(yǎng)，植物組織會(huì)表現(xiàn)生長(zhǎng)停止，高于于35時(shí)對(duì)植物生長(zhǎng)不利。時(shí)對(duì)植物生長(zhǎng)不利。不同植物培養(yǎng)的適溫不同。百合的最適溫度是不同植物培養(yǎng)的適溫不同。百合

27、的最適溫度是20、月季足月季足25-27、番茄是、番茄是28。溫度不僅影響植物組織培養(yǎng)育苗的生長(zhǎng)速度，也影溫度不僅影響植物組織培養(yǎng)育苗的生長(zhǎng)速度，也影響其分化增殖以及器官建成等發(fā)育進(jìn)程。如煙草芽響其分化增殖以及器官建成等發(fā)育進(jìn)程。如煙草芽的形成以的形成以28為最好，在為最好，在12以下，以下，33以上形成以上形成率皆最低。率皆最低。植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)光照(light)主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光照時(shí)間方面 1光照強(qiáng)度光照強(qiáng)度(light intensity)光照強(qiáng)度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的光照強(qiáng)度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，從

28、目前的研究情況看，光照強(qiáng)度對(duì)外植體及細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。研究情況看，光照強(qiáng)度對(duì)外植體及細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。一般來(lái)說，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長(zhǎng)的粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼一般來(lái)說，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長(zhǎng)的粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長(zhǎng)。苗容易徒長(zhǎng)。2光質(zhì)光質(zhì)(light wave)光質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯光質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，的影響。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，8周后，分化出愈傷組織。周后，分化出愈傷組織。但在藍(lán)光下培養(yǎng)，幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種但在藍(lán)光下培養(yǎng)，幾周后才出現(xiàn)愈

29、傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15d后，在藍(lán)光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長(zhǎng)旺盛，而白后，在藍(lán)光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長(zhǎng)旺盛，而白光下幼苗纖細(xì)。光下幼苗纖細(xì)。3光周期光周期(light period)最常用的周期是最常用的周期是16h光照光照/8h的黑暗。研究表明，一些植物的愈傷的黑暗。研究表明，一些植物的愈傷組織在暗下比在光下更好。如紅花、烏飯樹的愈傷組織。組織在暗下比在光下更好。如紅花、烏飯樹的愈傷組織。 植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)濕度 (humidity)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的相對(duì)濕度：實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的相對(duì)濕度： 一般要求一般要求70%80%的相對(duì)濕度，常用加的相對(duì)濕度，

30、常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來(lái)調(diào)節(jié)濕度。濕器或經(jīng)常灑水的方法來(lái)調(diào)節(jié)濕度。 濕度過低會(huì)使培養(yǎng)基喪失大量水分，導(dǎo)致培養(yǎng)基各種成濕度過低會(huì)使培養(yǎng)基喪失大量水分，導(dǎo)致培養(yǎng)基各種成分濃度的改變和滲透壓的升高，進(jìn)而影響組織培養(yǎng)的正常進(jìn)分濃度的改變和滲透壓的升高，進(jìn)而影響組織培養(yǎng)的正常進(jìn)行。濕度過高時(shí)，易引起棉塞長(zhǎng)霉，造成污染。行。濕度過高時(shí)，易引起棉塞長(zhǎng)霉，造成污染。培養(yǎng)容器內(nèi)的相對(duì)濕度：培養(yǎng)容器內(nèi)的相對(duì)濕度：100%相對(duì)濕度相對(duì)濕度植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無(wú)菌操作技術(shù)滲透壓(penetrating pressure)12個(gè)大氣壓對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用個(gè)大氣壓對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。培養(yǎng)基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物，因此，培養(yǎng)基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物，因此，影響到滲透壓的