質(zhì)譜技術(shù)在微生物鑒定和生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

1、質(zhì)譜技術(shù)在微生物鑒定和生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用3062016.03 島津（梅里埃）MALDI TOF產(chǎn)品系列 Linear only MALDI-TOF Linear and reflectron MALDI-TOF PSD capability Linear and reflectron MALDI-TOF/TOF PSD & CID capability Unique instrument MALDI-ion trap-TOF reflectron only MSn capability High resolution and high mass accuracy布魯克 各類現(xiàn)代生物質(zhì)譜：

2、離子阱離子阱MALDI TOF/TOFESI-Q-TOFFTMS質(zhì)譜儀的工作原理質(zhì)譜儀的工作原理 質(zhì)譜儀是利用電磁學(xué)原理，使帶電的樣品離子按質(zhì)荷比進(jìn)行分離的裝置。離子電離后經(jīng)加速進(jìn)入磁場中，其動能與加速電壓及電荷z有關(guān)，即 m/z = 2U/v2 其中z為離子的電荷，U為加速電壓，m為離子的質(zhì)量，v為離子初加速后的運(yùn)動速度。具有速度v的帶電粒子進(jìn)入質(zhì)譜分析器的電磁場中，根據(jù)所選擇的分離方式，最終各種離子按質(zhì)荷比（m/z）的不同實(shí)現(xiàn)分離。電離源質(zhì)譜儀中產(chǎn)生離子的裝置稱為離子源(ion source)。電離源的功能是將進(jìn)樣系統(tǒng)引入的氣態(tài)樣品分子轉(zhuǎn)化成離子。由于離子化所需要的能量隨分子不同差異很大，

3、因此，對于不同的分子應(yīng)選擇不同的離解方法。通常稱能給樣品較大能量的電離方法為硬電離方法，而給樣品較小能量的電離方法為軟電離方法。 質(zhì)譜技術(shù)中的幾種離子源質(zhì)譜技術(shù)中的幾種離子源基質(zhì)輔助激光解吸離子化 (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization，MALDI)2. 電噴霧離子化(Electrospray ionization，ESI)Sample targetIon opticsLinear detectorLaserMALDI-TOF MALDI: 線性工作原理Mix matrix & sample on targetFire laser at

4、 matrix/sampleIonize sample (solid to gas phase)Accelerate / extract ionsSeparate ions in analyzerRecord spectrum at detector Time of flight (TOF) mass analyzer (field free)02040608010010000200003000040000m/z+ve modeM+H+ ions.MALDI基質(zhì)輔助激光解析附原理基質(zhì)輔助激光解析附原理: Streptococcus pneumoniae:m/z% Intensity951768

5、65 L327985 L296638839458725263 L346265 L3065054419 L369071 S1880617703 L3559516750 L2810089 L2710618 S1910403 L7/L129357 L31728611019 S630005000700090001100013000880611451 S105651 L3310783 L23mass signals matching to ribosomal proteins (considering possible methionine cleavage and/or me

6、thylation) are marked in red50% of peaks unambiguously represent ribosomal proteinsprotein masses obtained from the Swiss-Prot/TrEMBL Swiss-Prot/TrEMBL sequence database質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu)質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu)一、真空系統(tǒng)質(zhì)譜儀的離子產(chǎn)生及經(jīng)過系統(tǒng)必須處于高真空狀態(tài)(離子源真空度應(yīng)達(dá)1.310-4 - 310-5 pa，質(zhì)量分析器中應(yīng)達(dá)1.310-6 pa)。若真空度過低，則會造成離子源燈絲損壞、本底增高、副反應(yīng)過多，從而使圖譜復(fù)雜化、

7、干擾離子源的調(diào)節(jié)、加速極放電等問題。一般質(zhì)譜儀都采用機(jī)械泵預(yù)抽真空后，再用高效率擴(kuò)散泵連續(xù)地運(yùn)行以保持真空。圖5.1 質(zhì)譜儀的構(gòu)成.微生物鑒定方法微生物鑒定方法感官感官視覺視覺, 嗅覺嗅覺, 味覺味覺免疫免疫單或多克隆抗體單或多克隆抗體分子分子PCR生化生化代謝能力和耐抗生素代謝能力和耐抗生素耗時(shí)氣質(zhì)法（氣質(zhì)法（GC-MS）脂肪酸，小分子糖脂肪酸，小分子糖MALDI-TOF MSMALDI-TOF MS.3/8/202210微生物鑒定新方法（微生物鑒定新方法（MALDI TOF） 比現(xiàn)有方法鑒定更多生物多樣性的病原體 分析時(shí)間僅1-2 minutes.現(xiàn)代微生物分類學(xué)現(xiàn)代微生物分類學(xué): :蛋白

8、組學(xué)蛋白組學(xué) & & 基因組學(xué)基因組學(xué) ProteinBacterial CellDNAGenomeProteomeDNA Fingerprint30005000700090001100013000Mass (m/z)2117.30102030405060708090100% IntensityVoyager Spec #1=AdvBC(32,0.5,1.0)=NF0.7BP = 4423.9, 21174424.29476.24861.08823.55897.86271.28054.36629.07424.912271.44738.66984.68383.86786.7653

9、3.39075.23132.36137.37209.88903.38610.610110.84765.410975.24026.94535.63311.810493.93491.49611.5MassFingerprintSpeciesDefinition & DeterminationMALDI-TOF MSMALDI-TOF MS1212不同細(xì)菌代表性指紋圖譜不同不同細(xì)菌代表性指紋圖譜不同各菌種代表性峰型分布存在顯著差異，有助于鑒定各個(gè)菌種！各菌種代表性峰型分布存在顯著差異，有助于鑒定各個(gè)菌種！4 0 0 0m /z8 0 0 04000m/z8000Burkholderia ce

10、pacia Raoultella ornithinolytica Staphylococcus aureusPantoea agglomerans Acinetobacter lwoffiEscherichia coli1313腸桿菌腸桿菌 （EnterobacteriaceaeEnterobacteriaceae）MSMS圖譜示圖譜示: :科科, , 屬屬, , 種特異性峰值種特異性峰值部分峰值是多數(shù)菌種共有的部分峰值是多數(shù)菌種共有的（如（如 m/z 4365: m/z 4365:核糖體蛋白核糖體蛋白 L36)L36)峰值有峰值有 科科, , 屬屬, , 種或種或 亞種亞種- -特異性特異性

11、種間特異性代表峰值種間特異性代表峰值用來區(qū)用來區(qū)分不同菌種分不同菌種30005000700090001100013000m/zEscherichia coliHafnia alveiLeclercia adecarboxylataKlebsiella pneumoniaeProteus mirabilis Enterobacter aerogenes.核糖體蛋白不受生長條件影響核糖體蛋白不受生長條件影響Mass spectra of Proteus mirabilis DSM 4479 at different incubation timesNo major qualitative chan

12、ges in peak patterns distinguishing family, genus and speciesDecrease of signal intensity over timePresence and absence of peaksIdentification with 99% confidence.樣品SARAMIS 工作流程工作流程轉(zhuǎn)移細(xì)胞到MALDI 靶板導(dǎo)入數(shù)據(jù)至SARAMIS4000600080001000012000m/z1c.2I4526396387774817699706009754549824086896210165745312528447811422

13、6260LIMS鑒定/ 比較分析基質(zhì).微生物鑒定流程微生物鑒定流程生長在固體培養(yǎng)基上的菌落全細(xì)胞 MALDI-TOF譜圖數(shù)據(jù)庫中參考譜圖輸出可信鑒定結(jié)果找到匹配度最可信的譜圖找到匹配度最可信的譜圖17鑒定結(jié)果界面鑒定結(jié)果界面樣品名稱樣品名稱鑒定結(jié)果鑒定結(jié)果置信度置信度MS 數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)日期日期只需數(shù)秒，全自動添加新采集數(shù)據(jù)至鑒定結(jié)果界面！只需數(shù)秒，全自動添加新采集數(shù)據(jù)至鑒定結(jié)果界面！科科屬屬種種型型數(shù)據(jù)數(shù)量數(shù)據(jù)數(shù)量不同顏色代表不同置信水平不同顏色代表不同置信水平 深綠深綠: 99.9% 淺綠淺綠: 90-99.9% 黃色黃色: 85-90% 白色白色: 70-85%低于低于70%不顯示置信值不顯示

14、置信值紅色紅色: 提醒復(fù)雜的結(jié)果提醒復(fù)雜的結(jié)果匹配匹配2種或以上菌種，置信度種或以上菌種，置信度99% :鑒定混合菌鑒定混合菌.SARAMIS鑒定混合菌種鑒定混合菌種A mass spectrum of a mixed sample containingPseudomonas aeruginosa and Achromobacter xylosoxidansShows peaks specific to both species300040005000600070008000900010000110001200013000Mass/Charge7291.64331.87319.65237.04

15、973.76320.26692.27575.06618.34433.77097.78562.09086.06345.86045.05735.69402.710029.95209.06674.27487.87201.05014.67763.48880.73161.14700.96306.03787.23645.04543.14353.03344.55266.48745.86714.75676.09588.68403.99959.910123.29427.912565.810534.69215.88584.69724.211401.7.l 單核增生性李斯特菌單核增生性李斯特菌Listeria mo

16、nocytogenes (Lm)l 兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌，自然界分布廣泛，是食源性李斯兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌，自然界分布廣泛，是食源性李斯特?。ㄈ诵蠊不疾。┑闹虏≡?，低溫仍具有增殖能力特?。ㄈ诵蠊不疾。┑闹虏≡?，低溫仍具有增殖能力對老年人，嬰兒，孕婦和免疫缺陷者的致死率是對老年人，嬰兒，孕婦和免疫缺陷者的致死率是 20-30%20-30%l該菌經(jīng)常存在于速食食品中該菌經(jīng)常存在于速食食品中 Ex. About 2,500cases/year in USA食品安全食品安全 Tokyo Marine University, Prof Kimura and Dr. TakahashiToky

17、o Marine University, Prof Kimura and Dr. TakahashiEatable without heated and cocked or cocked food, ex., ham, daily product, salad, smoked food etc現(xiàn)有檢測方法需要現(xiàn)有檢測方法需要2 2步驟和選擇培養(yǎng)基，耗時(shí)步驟和選擇培養(yǎng)基，耗時(shí)6 6天天.Yakult (養(yǎng)樂多養(yǎng)樂多)l乳酸菌生產(chǎn)質(zhì)量控制乳酸菌生產(chǎn)質(zhì)量控制l品種改良品種改良lPerformance + SARAMIS.Classified as genus = species = strain“T

18、hickness” of database is important.From 2011 European society of clinical microbiology and infections disease菌種鑒定準(zhǔn)確度菌種鑒定準(zhǔn)確度.3/8/202222SARAMIS：Spectral ARchive And Microbial Identification System 數(shù)據(jù)庫含有超級譜圖（ SuperSpectra ）和參考譜圖（ Reference Spectra ） 使用者可以創(chuàng)建和儲存超級譜圖或參考譜圖 軟件包可實(shí)現(xiàn)譜圖的存儲，分析和比較 使用者可以做聚類分析，創(chuàng)建系統(tǒng)

19、樹圖用于菌株分型.SARAMIS 菌種特異峰型菌種特異峰型 合成譜圖包含所有在個(gè)體譜圖中出現(xiàn)頻率大于閥值的所有峰 (如：在各譜圖中出現(xiàn) 70% 的) 在超級譜圖中，所有峰值根據(jù)他們對所代表的菌種特異性而賦予權(quán)重值 具有科、屬特異性的峰值權(quán)重低，這些峰值不支持菌種鑒定 具有菌種特異性的峰值權(quán)重則會加重.SARAMIS 比較工具比較工具300040005000600070008000900010000110001200013000m/z5263777496388176879299706009481767464086754583398962102194469678837715709788831426

20、260Cluster analysis of selected reference and sample mass spectraComparison to mass spectral patterns of reference spectra in the database.在在SARAMIS數(shù)據(jù)庫中一個(gè)菌種的典型代表包含典型和非典型菌株（基于質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫中一個(gè)菌種的典型代表包含典型和非典型菌株（基于質(zhì)譜圖譜，基因組學(xué)，表型數(shù)據(jù)）譜，基因組學(xué)，表型數(shù)據(jù)）atypical reference isolates are over-represented in SARAMIS phylogenet

21、ic distancephylogenetic distancefrequencyfrequency自然界菌種多樣性自然界菌種多樣性.SARAMISSuperSpectraDatabase020406080100%Int.400060008000100001200014000m/z1713 mVsum= 42832 mV Profiles 1-25 Smooth Av 3043636289724376475393914072716382526494827337820695457291660445673620567612244885310641811813258141081. Unambiguo

22、us identification with 80+ % confidenceLIMS020406080100%Int.400060008000100001200014000m/z1713 mVsum= 42832 mV Profiles 1-25 Smooth Av 304363628972437647539391407271638252649482733782069545729166044567362056761224488531064181181325814108SARAMISReference SpectraDatabase2. Identification 離子傳輸率大大提高，從而提

23、離子傳輸率大大提高，從而提高靈敏度。高靈敏度。增寬傳輸離子質(zhì)量范圍增寬傳輸離子質(zhì)量范圍 離子流方向傳統(tǒng)的錐式離子傳輸傳統(tǒng)的錐式離子傳輸.micrOTOFQ適用范圍：適用范圍：電噴霧四級桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀電噴霧四級桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀 分子式測定和分子結(jié)構(gòu)鑒定：分子式測定和分子結(jié)構(gòu)鑒定：如：如：化學(xué)合成產(chǎn)品，配位化合物，化學(xué)合成產(chǎn)品，配位化合物，天然產(chǎn)物，代謝物，殘留農(nóng)藥等天然產(chǎn)物，代謝物，殘留農(nóng)藥等 大分子研究大分子研究如：蛋白質(zhì)如：蛋白質(zhì)/多肽，多糖，多聚物等多肽，多糖，多聚物等 復(fù)雜混合物分析復(fù)雜混合物分析. 精確質(zhì)量精確質(zhì)量 (3ppm)micrOTOFQ：獨(dú)特的三維信息獨(dú)特的三維信息

24、 MS/MS提供結(jié)構(gòu)信息提供結(jié)構(gòu)信息電噴霧四級桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀電噴霧四級桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀 SigmaFit參數(shù)（參數(shù)（同位素峰形匹配）同位素峰形匹配）. 精確質(zhì)量精確質(zhì)量 (0.437.0425438.0372439.0397440.03690.00.40.81.2437.0427438.0376439.0400440.03590.00.40.81.2437.0396438.0351439.03750.00.40.81.2436.0398Experimental436.0400C12H22NO10S3436.0367C15H18NO10S202460246024643543643743

25、8439440441442m/zsigma = 0.0167sigma = 0.0231Intensity x 104ABC鑒定化合物的有效工具鑒定化合物的有效工具- - SigmaFit兩種可能元素組成的確定兩種可能元素組成的確定.分子量分子量 500500DaDa未知物的元素組成預(yù)測？未知物的元素組成預(yù)測？.人參提取液人參提取液（稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) 1:100; HPLC-microTOF Q）0510152025Time min02464x10Intens.BPC 499.997-1299.991 -All MS1153.598181154.600531155.601441156.5984

26、20.000.250.500.751.001.251.504x10Intens.115411561158 m/z.當(dāng)設(shè)置誤差范圍當(dāng)設(shè)置誤差范圍 5 ppm時(shí)：時(shí)：171個(gè)可能的分子式個(gè)可能的分子式Generate Molecular Formula.16個(gè)個(gè)可能的分子式可能的分子式當(dāng)設(shè)置誤差范圍當(dāng)設(shè)置誤差范圍 3ppm 時(shí)：時(shí)：Generate Molecular Formula.C55H93O25用用SigmaTM參數(shù)比較同位素參數(shù)比較同位素峰形匹配，選擇峰形匹配，選擇Sigma值最值最小的分子式，即該化合物的小的分子式，即該化合物的分子式為：分子式為：Generate Molecular

27、Formula.SigmaTM參數(shù)用于參數(shù)用于比較同位素峰形匹配比較同位素峰形匹配1153.601141154.604561155.607421156.61021C55H93O25 ,1153.601153.595271154.598681155.601701156.60459C62H89O20 ,1153.5905001000150020002500Intens.050010001500200025001153115411551156115711581159m/zC55H93O25C62H89O20SigmaTM = 0.0171 SigmaTM = 0.0540 .未知多肽測序測定未知多肽

28、測序測定 GluFib: MS/MS of m/z = 785.8 (+2)333.1898480.2559684.3445813.3868942.42871056.47041171.49911285.5426N + 0.0006D + 0.0017N - 0.0012E - 0.0007E - 0.0003G - 0.0001F - 0.0012F - 0.0023SA - 0.0007V + 0.0014G - 0.0014+MS, 2.8-3.4min #(85-103)024684x10Intens.200400600800100012001400m/zMass DistanceRMS 誤差誤差: 0.00097 Da. 動態(tài)范圍的實(shí)際意義動態(tài)范圍的實(shí)際意義m/z 855.xxxTIMED D = 150ppm 高質(zhì)量準(zhǔn)確度測定與液質(zhì)聯(lián)用高質(zhì)量準(zhǔn)確度測定與液質(zhì)聯(lián)用常規(guī)高分辨質(zhì)譜儀在液質(zhì)常規(guī)高分辨質(zhì)譜儀在液質(zhì)聯(lián)用時(shí)面臨的挑