單個(gè)細(xì)胞分離技術(shù)PBMC

1、美麗的海醫(yī)校園美麗的海醫(yī)校園 臨床免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)臨床免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)海南醫(yī)學(xué)院海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六 單個(gè)核細(xì)胞分離及細(xì)胞免疫功能檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞分離及細(xì)胞免疫功能檢測(cè)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.1.熟悉淋巴細(xì)胞分離方法熟悉淋巴細(xì)胞分離方法2.2.了解了解T T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定方法及其臨床意義淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定方法及其臨床意義 T T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答特征：是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答特征：是T T細(xì)胞輔助細(xì)胞（細(xì)胞輔助細(xì)胞（Th1Th1）介導(dǎo)的）介導(dǎo)的 單個(gè)核細(xì)胞（單個(gè)核細(xì)胞（L, ML, M），以浸潤(rùn)為主的炎癥反應(yīng)與細(xì)胞毒性），以浸潤(rùn)為主的炎癥反應(yīng)與細(xì)胞毒性T T細(xì)胞細(xì)胞 （CTLCTL或或TCTC）發(fā)生特

2、異性細(xì)胞毒效應(yīng)）發(fā)生特異性細(xì)胞毒效應(yīng). . 臨床上反復(fù)感染者和腫瘤病人，使人首先想到的是：患者是否有臨床上反復(fù)感染者和腫瘤病人，使人首先想到的是：患者是否有 細(xì)胞免疫缺陷，必須進(jìn)行細(xì)胞免疫缺陷的檢測(cè)，而這種檢查的細(xì)胞免疫缺陷，必須進(jìn)行細(xì)胞免疫缺陷的檢測(cè)，而這種檢查的 第一步就是單個(gè)核細(xì)胞的分離，計(jì)數(shù)。然后進(jìn)行功能檢查。第一步就是單個(gè)核細(xì)胞的分離，計(jì)數(shù)。然后進(jìn)行功能檢查。 一、單個(gè)核細(xì)胞分離法（主要為淋巴細(xì)胞）一、單個(gè)核細(xì)胞分離法（主要為淋巴細(xì)胞）（一）葡聚糖（一）葡聚糖泛影葡胺法分離單個(gè)核細(xì)胞泛影葡胺法分離單個(gè)核細(xì)胞 密度梯度離心法：密度梯度離心法：水平離心機(jī)，逐漸加速，自然停轉(zhuǎn)水平離心機(jī)，逐

3、漸加速，自然停轉(zhuǎn)1.1.分離液：分離液：葡聚糖葡聚糖- -泛影葡胺混合液泛影葡胺混合液（比重（比重1.0751.0751.0921.092之間）之間） 將分離液將分離液，加入抗凝血中離心，離心后，加入抗凝血中離心，離心后不同比重的血細(xì)胞在分不同比重的血細(xì)胞在分離液中呈梯度分布。比密大在底部，小的在上部。離液中呈梯度分布。比密大在底部，小的在上部。紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞比重較大（紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞比重較大（1.0921.092），分布于最底層），分布于最底層，單核細(xì)胞比重較?。▎魏思?xì)胞比重較?。?.0751.0751.0901.090），分布于血漿與分離液的），分布于血漿與分離液的交界處。交界處。界

4、限清楚，層次分明。將該層細(xì)胞吸出，即為單個(gè)核界限清楚，層次分明。將該層細(xì)胞吸出，即為單個(gè)核細(xì)胞（主要為淋巴細(xì)胞）細(xì)胞（主要為淋巴細(xì)胞）血漿和血小板位于最上層。血小板在血漿中下部血漿和血小板位于最上層。血小板在血漿中下部 2. Hanks2. Hanks緩沖液：（緩沖液：（ pH 7.2-7.4,pH 7.2-7.4,無(wú)無(wú)CaCa、MgMg離子）離子） 3. 0.4%3. 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液臺(tái)盼藍(lán)染液梯度離心法分離提取單個(gè)核細(xì)胞稀釋血漿稀釋血漿內(nèi)含血小板內(nèi)含血小板分離液分離液粒細(xì)胞粒細(xì)胞紅細(xì)胞紅細(xì)胞用細(xì)長(zhǎng)吸管慢慢插入白膜層，沿管壁周邊輕輕吸取單核細(xì)胞層于另一試管內(nèi)用細(xì)長(zhǎng)吸管慢慢插入白膜層，沿管壁

5、周邊輕輕吸取單核細(xì)胞層于另一試管內(nèi) 加入加入PBSPBS洗液洗液3-4ml3-4ml，離心洗滌，離心洗滌2 2次，次，1500/r,10min. 1500/r,10min. 棄去上清，留約棄去上清，留約50l.50l.加加含有含有10%10%滅活小牛血清滅活小牛血清-PBS-PBS液液1.0ml1.0ml，混勻充池，鏡下計(jì)數(shù)。，混勻充池，鏡下計(jì)數(shù)。單個(gè)核細(xì)胞單個(gè)核細(xì)胞 2000rpm/ 20-30min 肝素抗凝血肝素抗凝血2ml +Hanks2ml +Hanks液液2ml2ml液稀釋液稀釋沿管壁緩慢加入沿管壁緩慢加入到含有到含有2ml2ml淋巴細(xì)胞分離液的試管中淋巴細(xì)胞分離液的試管中( (不

6、能破壞二者的液面不能破壞二者的液面）, ,2000r/min 2000r/min 離心離心20min20min 吸出淋巴細(xì)胞層加入另一試管中，加吸出淋巴細(xì)胞層加入另一試管中，加3 34ml Hanks4ml Hanks液，混勻離心洗滌，液，混勻離心洗滌， 1500r/min 1500r/min 離心離心10min10min 棄棄去上清，去上清，再再加加3ml Hanks3ml Hanks液，混勻，液，混勻， 1500r/min 1500r/min 10min10min，重復(fù)洗滌，重復(fù)洗滌2 2次次 重復(fù)重復(fù)1 1次次 末次離心后，棄去上清液。加含末次離心后，棄去上清液。加含10%10%滅活小牛

7、血清滅活小牛血清/HanKs/HanKs液液 加至加至1.0ml1.0ml，混勻，灌入血細(xì)胞計(jì)數(shù)池，單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)，混勻，灌入血細(xì)胞計(jì)數(shù)池，單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)， 于低倍鏡下計(jì)數(shù)于低倍鏡下計(jì)數(shù)4 4個(gè)角大格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)。個(gè)角大格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)。 方法方法留取約留取約50l,加緩沖液至加緩沖液至1.0ml，稀釋，稀釋20倍倍計(jì)數(shù)細(xì)胞方法計(jì)數(shù)細(xì)胞方法 加樣：加樣：將淋巴細(xì)胞懸液混勻，吸取將淋巴細(xì)胞懸液混勻，吸取10l10l加入到加入到 40l40l含含10%10%滅活小牛滅活小牛血清的血清的HanksHanks液中，混勻后再吸取液中，混勻后再吸取10l10l充入計(jì)數(shù)板上。充入計(jì)數(shù)板上。細(xì)胞懸液稀釋細(xì)胞懸液稀釋

8、5 5倍。此稀釋也可省略，可根據(jù)細(xì)胞密度而定倍。此稀釋也可省略，可根據(jù)細(xì)胞密度而定靜置片刻，置顯微鏡下計(jì)算淋巴細(xì)胞數(shù)。靜置片刻，置顯微鏡下計(jì)算淋巴細(xì)胞數(shù)。具體計(jì)數(shù)方法如下：具體計(jì)數(shù)方法如下： 血細(xì)胞計(jì)數(shù)池的構(gòu)造血細(xì)胞計(jì)數(shù)池的構(gòu)造1.1.大方格大方格 9 9個(gè)個(gè)2.2.中方格分中方格分2 2種種WBCWBC計(jì)數(shù)區(qū)分計(jì)數(shù)區(qū)分1616個(gè)個(gè)RBCRBC計(jì)數(shù)區(qū)分計(jì)數(shù)區(qū)分2525個(gè)個(gè)3.3.小方格小方格1 1種，種， 是指是指RBCRBC計(jì)數(shù)區(qū)計(jì)數(shù)區(qū)的的1 1個(gè)中方格又分個(gè)中方格又分1616個(gè)小方格，即：個(gè)小方格，即：計(jì)數(shù)池內(nèi)有：計(jì)數(shù)池內(nèi)有：1 1種種大方格；大方格；2 2種中方種中方格；格；1 1種小方

9、格種小方格池深池深 0.1mm0.1mm 血細(xì)胞計(jì)數(shù)池的構(gòu)造參數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)池的構(gòu)造參數(shù) 4種方格的體積（容積）種方格的體積（容積） 計(jì)數(shù)池區(qū)域計(jì)數(shù)池區(qū)域 邊長(zhǎng)（邊長(zhǎng)（mmmm） 面積（面積（mm2mm2） 池深（池深（mmmm） 體積（體積（mm3 ulmm3 ul） 一個(gè)計(jì)數(shù)全池一個(gè)計(jì)數(shù)全池 3 9 0.10 0.903 9 0.10 0.90 大方格大方格 1 1 0.10 0.101 1 0.10 0.10 白細(xì)胞中方格白細(xì)胞中方格 0.25 0.0625 0.10 0.006250.25 0.0625 0.10 0.00625 紅細(xì)胞中方格紅細(xì)胞中方格 0.20 0.0400 0.10

10、 0.004000.20 0.0400 0.10 0.00400 紅細(xì)胞小方格紅細(xì)胞小方格 0.05 0.0025 0.10 0.000250.05 0.0025 0.10 0.00025細(xì)胞計(jì)數(shù)原則細(xì)胞計(jì)數(shù)原則 計(jì)左上，不計(jì)右下計(jì)左上，不計(jì)右下 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板血細(xì)胞計(jì)數(shù)板血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上四個(gè)角的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上四個(gè)角的四個(gè)大方格四個(gè)大方格1 1個(gè)大方格中個(gè)大方格中1616個(gè)中方格個(gè)中方格 計(jì)數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上四個(gè)角的計(jì)數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上四個(gè)角的 四個(gè)大方格內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)。四個(gè)大方格內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)。（只計(jì)算上邊和左邊的壓線細(xì)胞，（只計(jì)算上邊和左邊的壓線細(xì)胞， 右邊和下邊壓線細(xì)胞不計(jì)算）右邊和下邊壓線

11、細(xì)胞不計(jì)算） 單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)計(jì)算：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞總數(shù)計(jì)算： 是指最終制備的每是指最終制備的每mlml細(xì)胞緩沖液內(nèi)的細(xì)胞緩沖液內(nèi)的 單個(gè)核細(xì)胞的密度（數(shù)量）單個(gè)核細(xì)胞的密度（數(shù)量）單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)/ml/ml= = 單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)/ml = X/4/ml = X/41010( (稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)) ) 10103 3=X=X10104 44 4 4個(gè)大方格內(nèi)個(gè)大方格內(nèi) 細(xì)胞總數(shù)細(xì)胞總數(shù) 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) 10104 4關(guān)于稀釋倍數(shù)：這里不是指血液稀釋倍數(shù)。是指最后洗滌關(guān)于稀釋倍數(shù)：這里不是指血液稀釋倍數(shù)。是指最后洗滌離心棄去上清液后的單個(gè)核細(xì)胞沉淀中，加入緩沖液離心棄去上清

12、液后的單個(gè)核細(xì)胞沉淀中，加入緩沖液1.0ml后。后。 此緩沖液中的單個(gè)核細(xì)胞密度。此緩沖液中的單個(gè)核細(xì)胞密度。細(xì)胞存活率檢測(cè)細(xì)胞存活率檢測(cè) 取取10l10l淋巴細(xì)胞懸液加入淋巴細(xì)胞懸液加入0.4%0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液臺(tái)盼藍(lán)染色液10l10l， 混勻。取混勻。取10l10l加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，靜置片刻，加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，靜置片刻， 置顯微鏡高倍鏡下觀察。計(jì)數(shù)置顯微鏡高倍鏡下觀察。計(jì)數(shù)200200個(gè)單個(gè)核細(xì)胞個(gè)單個(gè)核細(xì)胞 分別記錄活細(xì)胞數(shù)，死細(xì)胞數(shù)，帶入計(jì)算公式，分別記錄活細(xì)胞數(shù)，死細(xì)胞數(shù)，帶入計(jì)算公式， 報(bào)告活細(xì)胞存活率。報(bào)告活細(xì)胞存活率?！窘Y(jié)果判定【結(jié)果判定】 活細(xì)胞不著色，折光性強(qiáng)?；罴?xì)胞不著

13、色，折光性強(qiáng)。死細(xì)胞由于染料可滲入死細(xì)胞由于染料可滲入 細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)，故死細(xì)胞被染成藍(lán)色，故死細(xì)胞被染成藍(lán)色，體積較大，無(wú)光澤體積較大，無(wú)光澤 正常情況下，活細(xì)胞存活率應(yīng)在正常情況下，活細(xì)胞存活率應(yīng)在95%95%以上。以上。 表明免疫活性細(xì)胞數(shù)量正常。然后做其他功能檢測(cè)表明免疫活性細(xì)胞數(shù)量正常。然后做其他功能檢測(cè) 在高倍鏡下計(jì)數(shù)在高倍鏡下計(jì)數(shù)200200個(gè)細(xì)胞中的死亡細(xì)胞數(shù)，個(gè)細(xì)胞中的死亡細(xì)胞數(shù)， 計(jì)算其存活率：使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：計(jì)算其存活率：使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器： 細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率 =活細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)(N)(N) 活細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)+ +死細(xì)胞數(shù)死細(xì)胞數(shù) 200200 100% 100% 例

14、如：活細(xì)胞總數(shù)為例如：活細(xì)胞總數(shù)為 120120個(gè)，存活率為：個(gè)，存活率為：60%60%； 若活細(xì)胞計(jì)數(shù)為若活細(xì)胞計(jì)數(shù)為180180個(gè)，存活率：個(gè)，存活率：90%90%【臨床意義臨床意義】 分離單個(gè)淋巴細(xì)胞技術(shù)是進(jìn)行細(xì)胞免疫試驗(yàn)的重要技術(shù)之一，分離單個(gè)淋巴細(xì)胞技術(shù)是進(jìn)行細(xì)胞免疫試驗(yàn)的重要技術(shù)之一，是進(jìn)行流式細(xì)胞分析技術(shù)的重要的前期基本操作；是進(jìn)行流式細(xì)胞分析技術(shù)的重要的前期基本操作； 是進(jìn)行各項(xiàng)免疫細(xì)胞功能檢測(cè)的基礎(chǔ)技術(shù)。是進(jìn)行各項(xiàng)免疫細(xì)胞功能檢測(cè)的基礎(chǔ)技術(shù)。 分離所得的單個(gè)核細(xì)胞可滿足許多實(shí)驗(yàn)需要，分離所得的單個(gè)核細(xì)胞可滿足許多實(shí)驗(yàn)需要， 不僅用于淋巴細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞的存活率測(cè)定，不僅用于淋巴

15、細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞的存活率測(cè)定， 也用于進(jìn)一步純化淋巴細(xì)胞，進(jìn)行淋巴細(xì)胞分類，分群，也用于進(jìn)一步純化淋巴細(xì)胞，進(jìn)行淋巴細(xì)胞分類，分群， 表面抗原，各種標(biāo)志物以及其他淋巴細(xì)胞功能測(cè)定等。表面抗原，各種標(biāo)志物以及其他淋巴細(xì)胞功能測(cè)定等。 實(shí)驗(yàn)報(bào)告：實(shí)驗(yàn)報(bào)告：1.1. 報(bào)告單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)總數(shù)結(jié)果報(bào)告單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)總數(shù)結(jié)果2.2. 報(bào)告單個(gè)核細(xì)胞存活率報(bào)告單個(gè)核細(xì)胞存活率3. 3. 簡(jiǎn)述密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞的原理簡(jiǎn)述密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞的原理4. 4. 分離單個(gè)淋巴細(xì)胞的臨床意義分離單個(gè)淋巴細(xì)胞的臨床意義T T細(xì)胞總數(shù)測(cè)定：細(xì)胞總數(shù)測(cè)定：EtEt花環(huán)實(shí)驗(yàn)。學(xué)生課余自學(xué)內(nèi)容?；ōh(huán)實(shí)驗(yàn)。學(xué)生課余自學(xué)內(nèi)容。E+E+淋巴細(xì)胞百分率測(cè)定：正常人參考值：淋巴細(xì)胞百分率測(cè)定：正常人參考值： 60%-80%60%-80%由于干擾因素較多，主觀因素影響，臨床意義不明顯由于干擾因素較多，主觀因素影響，臨床意義不明顯結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)性不高等原因，很少做。結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)性不高等原因，很少做。T T細(xì)胞總數(shù)測(cè)定細(xì)胞總數(shù)測(cè)定EtEt花環(huán)沉降法花環(huán)沉降法（E+E+淋巴細(xì)胞百分率：淋巴細(xì)胞百分率：60-80%60-80%）人類人類T