WB灰度值測定

1、Image J測到了WB條帶灰度值關(guān)于用Image J量化westernblot條帶灰度值，在網(wǎng)上一直盛傳著兩種操作方法，然鵝小伙伴們卻一直不確定到底哪種才是正確的測量灰度方法，甚至將灰度與光密度弄混淆。今天咱們一起就這個機(jī)會學(xué)習(xí)下，請先看看你是用以下那種方法測量灰度值？以下是兩種方法的具體操作。方法一:1、打開Image J軟件左上角fileOpen 選擇自己的條帶圖片(事先把條帶擺正)2、把圖片轉(zhuǎn)化成灰度圖片：Imagetype8-bit3、第一個矩形工具選上所有條帶4、analyzeGelsselect first laneGelsplot lanes（在這第四步也可以分開選取，如：框選

2、第一個條帶analyzeGelsselect firstlane將第一個框拖移到余下條帶Gelsselect nextlane）5、選中直線工具，將開口波峰關(guān)閉6、選中魔棒工具（正數(shù)第七個），點擊波峰，就得出所有area值。方法二1、打開Image J軟件左上角fileOpen 選擇自己的條帶圖片(事先條帶弄正)2、把圖片轉(zhuǎn)化成灰度圖片：Imagetype8-bit3、扣除背景：ProcessSubtract Background50pixels 并勾選Light Background5、設(shè)定參數(shù)：Analyzeset measurement勾選Area、Mean gray value、Min

3、 & max gray value、Integrated density6、Analyzeset scaleunit of length選項里改為pixels，確定6、圖像分割。EditInvert選中橢圓圈（手殘黨首選）/不規(guī)則圓圈（心靈手巧黨義無反顧），手動圈上單個條帶7、AnalyzeMeasurement即得到Intden,重復(fù)6、7步就得到所有Intden值小伙伴們，你們是哪種方法呢？首先先把結(jié)論說出來，其實兩者得出的area和Intden嚴(yán)格來說都不是灰度值，前者是面積而后者是光密度值，但用來量化WB條帶都是OK的。 Image J這個軟件在將western bl

4、ot條帶量化時存在兩種參數(shù)：灰度與光密度（假，暫且這么稱呼，原因下文再說），這兩者在理解使用Image J量化WB條帶十分重要，請務(wù)必仔細(xì)看以下幾個概念。1、灰度(gray)：是指圖像中各種顏色的深淺程度, 它以整數(shù)值表示, 一般的圖像分析軟件將圖像每個像素點的顏色分為 0-255共 256 級，每一像素點對應(yīng)的數(shù)值即灰度，灰度值越小物體顏色越深。有興趣的小伙伴，可以隨意用Image J打開一張圖片，光標(biāo)在圖片上任意移動，得到的value值最小為0（純黑），最大為255（純白）。2、光密度(OD，真)：也就是吸光度（A）, 光線通過溶液或某一物質(zhì)前的入射光強(qiáng)度Io與該光線通過溶液或物質(zhì)后的出射

5、光強(qiáng)度Ib比值的對數(shù)OD=lg（Io/Ib），其實就是大家熟悉的分光光度法的朗伯比爾定律。明確這兩個概念后，我們再來看為什么稱Image J里的光密度是“假”，因為在圖像分析中的光密度（假）是由灰度值再經(jīng)計算得到的, 它是一個相對值, 但其算法與 OD 值的算法類似。只是它的入射光強(qiáng)度由Western blot膠片上最亮區(qū)域的平均灰度值代替, 而出射光強(qiáng)度則由待測目標(biāo)平均灰度值代替。即:圖像分析系統(tǒng)的光密度值=lg(WB膠片上最亮區(qū)域的平均灰度值/ 待測目標(biāo)的平均灰度值)，再簡單點來說，就是光密度（假）和正兒八經(jīng)的灰度值有血緣關(guān)系?？偨Y(jié)起來說灰度與光密度（假）都能用來量化western blo

6、t條帶，兩種量化任君隨意挑?，F(xiàn)在說回兩種操作方法：方法一：是通過每個條帶上眾多像素點對應(yīng)的灰度值勾畫出一條曲線，最后魔棒點出算出的area值其實就是該條帶所對應(yīng)的面積大小。條帶越大，area值越大。方法二：是通過上文說到的光密度（假）計算方法得出來的，最后得出的Intden值是所圈面積下的總光密度值，再除以圈下面積area，得出的是平均光密度值（圖像中陽性區(qū)域每一像素點的 OD 值疊加后除以測量的面積）。條帶（顏色反轉(zhuǎn)后）越白越亮則Intden/area越大。所以嚴(yán)格意義上來說，方法一方法二最后得出的數(shù)據(jù)都不屬于正兒八經(jīng)的灰度值，但又與灰度值有著千絲萬縷的聯(lián)系。如果只是量化WB條帶，兩種方法是

7、都能選用的，記得標(biāo)注你得到的結(jié)果是area還是Intden，但如果你想測出真正的灰度值，那么我們下節(jié)課再來好好談?wù)?，咦？我說話怎么越來越像老師的風(fēng)格呢，哈哈，同學(xué)們，下課.今天主要講述如何用photoshop測量WB灰度值，在講述操作方法之余，小石頭先給大家理一理原理，以便大家更好的理解（文末附操作方法）。照例最先展示下最后的成果圖（其實最后可以用Graphpad做圖，在此不贅述）：好了，開始今天的課程，現(xiàn)在手里有張這樣的WB條帶圖， 如何將各條帶灰度值測量出來？首先我們從基本原理聊起，圖片大小的存儲基本單位是字節(jié)，每個字節(jié)是有8個比特（bit，音譯為比特，也稱為“位”）組成。一般的圖片都是由

8、眾多像素點構(gòu)成的，灰度模式下一個像素一個字節(jié)，也同時就是8bit。在上一堂課中，我們曾用Image J將圖片轉(zhuǎn)化為灰度圖，就是通過imagetype8-bit這一步。如果把黑-灰-白連續(xù)變化的灰度值量化為256個灰度級，灰度值的范圍也就為0-255，表示亮度由深到淺。從上圖我們可以得知純黑為0，純白為255，中間0-255代表各個不同亮度等級。而通常我們所得到的WB圖片是這樣的：前者A是沒有轉(zhuǎn)化為灰度模式的，后者B是灰度模式下的。而在灰度模式下，如果按灰度值描述的話，顯然有明顯條帶的的灰度數(shù)據(jù)基本都與0相近，數(shù)值很小，這樣不利于互相比較。所以通常的做法是進(jìn)行“反相”，也就是將白的地方變?yōu)楹?，?/p>

9、的地方變?yōu)榘?，顏色顛倒。也就是這樣：至此條帶上的灰度值就成了越亮越白則灰度值越大（有沒有小伙伴看過那種原始照片底片，記不記得底片上人物的頭發(fā)都是白的發(fā)亮，這種就是灰度值255哦；還有做電泳凝膠的小伙伴，得到的凝膠圖就不需要反相了，可以直接進(jìn)行灰度值分析哦）。我們目前要想測量條帶的灰度值，就只需把那發(fā)光發(fā)亮的地方圈出來，讀取灰度值就可以了，而這一部分就交給photoshop來計算吧。在這里小石頭想敲敲黑板，提醒大家注意下三點：1、由于Photoshop得出的灰度值是平均灰度值，而在比較WB條帶灰度值時，我們還應(yīng)考慮面積的關(guān)系，以面積與平均灰度相乘得出的總灰度，我們才能更準(zhǔn)確地得出條帶之間的表達(dá)差

10、異。2、條帶上得出的數(shù)據(jù)其實是相對于背景而言的，這個背景雖然反相之后非常黑了，但畢竟不是全黑的，我們還需要扣除背景的灰度值。并且，背景盡量干凈，這就要求我們在做WB時多努力了。3、不同圖片的背景是不一樣的，不同圖片的WB條帶是不能進(jìn)行相互比較的哦。接下來附上Photoshop測量WB條帶的灰度值的操作方法，其中每一步的意義基本已在上文所介紹，對哪一步操作有不明白的小伙伴可以回過頭再看看的。 步驟1：打開軟件Photoshop左上角打開圖片步驟2:將圖片轉(zhuǎn)為灰度模式（如果已經(jīng)為灰度，此步跳過）：圖像模式灰度扔掉步驟3:將條帶擺正（兩種方法）通用步驟：最左側(cè)選取標(biāo)尺工具在條帶上畫一條自認(rèn)本應(yīng)水平的線方法一：直接點擊正上方“拉直圖層”（此操作簡便，但有可能使邊緣條帶挪出界外）方法二：圖像圖像旋轉(zhuǎn)任意角度確定步驟4:得到的灰度圖進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整：圖像調(diào)整色階調(diào)整下圖中三個點，適當(dāng)將自己的WB圖片轉(zhuǎn)成黑白對比稍明顯的樣子，如圖（此步也可通過更改亮度/對比度實現(xiàn):圖像調(diào)整亮度/對比度）步驟5：反相：圖像調(diào)整反相 步驟6：最左側(cè)多邊形套索工具延條帶邊緣圈選圖像分析記錄測量（分析選擇數(shù)據(jù)點可以只顯灰