微量肉湯稀釋法藥敏檢測法

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2、ycin95%乙醇或冰乙酸肉湯培養(yǎng)基頭孢唑啉cefazolin磷酸緩沖液PH6.0, 0.1mol/L磷酸緩沖液PH6.0, 0.1mol/L.啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊

3、啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊微量肉湯稀釋法藥敏檢測啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊微量肉湯稀

4、釋法藥敏檢測以下實驗方法主要適用于需氧菌及部分兼性厭氧菌（以大腸桿菌為例），微需養(yǎng)菌和厭氧菌的培養(yǎng)條件亟待摸索。本實驗方法，雖然操作較為繁瑣，但是能夠確切的得到細菌臨床分離株對某種抗菌藥物的MIC值，以此作為臨床用藥指導的部分依據(jù)。菌懸液的制備： 菌液培養(yǎng)：取待測菌保存液10µL加入1mLMH肉湯（可根據(jù)實際需要做調(diào)整），置37溫箱過夜靜止培養(yǎng)12小時左右； OD600值測定：利用紫外分光光度儀測定OD值，MH肉湯調(diào)整菌液濃度使其OD600值落在0.08-0.1之間，此時菌液濃度約108cfu/mL（大約需將培養(yǎng)菌液稀釋7-10倍左右）； 上樣菌液稀釋：將待測菌液在步驟所得稀釋倍數(shù)的

5、基礎上再稀釋1000倍，此時菌液濃度約105cfu/mL（即7000-10,000倍），此時的菌液即為上樣菌懸液； 注意：測定OD值所需菌液應在超凈臺中無菌取樣，剩余菌液還需實驗。抗菌藥物的制備：抗生素母液配制：參照NCCLS標準上抗菌藥物相應的R（抗藥）值制備待測抗菌藥物（母液濃度要遠遠大于R值，至少160倍），分裝于無菌小管置-20備用（附件一.常用抗生素溶液的配制）。注意：無菌操作，抗菌藥物的稀釋液均需滅菌，溶解后還應過濾（濾膜孔徑為0.22µm）藥敏試驗的操作： 將待測抗菌藥物進行10倍稀釋； 無菌96孔板第1-11列加入滅菌MH肉湯100µL（一藥一板）； 無菌9

6、6孔板第1列加入10倍稀釋的藥液100µL，逐次倍比稀釋至第11列（每孔液體終體積是100µL）； 無菌96孔板的每一孔加入待測菌液100µL，每孔液體終體積是200µL（由于整板都是一種藥物，所以96孔板的每一行可進行一種細菌的藥敏試驗，為了保證實驗的可靠性，每株菌進行一次重復，即一株菌做兩行，一塊板可做四株細菌的藥敏試驗）； 無菌96孔板的第12列上4孔加入200µL/孔滅菌MH肉湯作為陰性對照，第12列下4孔加入200µL/孔菌液（四株菌的菌液）作為陽性對照； 藥物和菌液上樣完畢后，蓋好板蓋，置37溫箱培養(yǎng)18-22小時觀察結果

7、（結果的判讀請參照附件二. 2009年NCCLS抗菌藥物敏感性試驗解釋標準）。 注意：無菌操作。96點陣法藥敏檢測（大通量的藥物敏感性檢測實驗）以下實驗方法主要適用于需氧菌及部分兼性厭氧菌（以大腸桿菌為例），微需養(yǎng)菌和厭氧菌的培養(yǎng)條件亟待摸索。該方法能夠快速得到某種抗菌藥物對細菌臨床分離株的作用，抗藥還是敏感，以此作為臨床用藥指導的部分依據(jù)。菌懸液的制備： 菌液培養(yǎng)：無菌96孔板培養(yǎng)96株待測菌株（每一孔對應一株菌），每孔含有滅菌MH肉湯200µL，待測菌株保存液5µL，置37溫箱過夜靜止培養(yǎng)12小時左右； 上樣菌液稀釋：將過夜培養(yǎng)所得菌液稀釋1000倍（使用無菌96孔板分

8、三次進行稀釋，每次稀釋10倍，最后一次稀釋所得菌液即為上樣菌懸液）；抗菌藥物的制備：抗生素母液配制：參照NCCLS標準上抗菌藥物相應的R（抗藥）值制備待測抗菌藥物（母液濃度要遠遠大于R值，至少100倍），分裝于無菌小管置-20備用（附件一.常用抗生素溶液的配制）。藥敏試驗的操作： 用本實驗室新定制的細菌培養(yǎng)瓶配制MH固體培養(yǎng)基，定量35mL，滅菌； 待MH固體培養(yǎng)基滅菌完畢，溫度降至45左右時，加入一定量的抗菌藥物，使其終濃度為R值（R值的確定請參照附件二. 2009年NCCLS抗菌藥物敏感性試驗解釋標準），混勻，倒入96點陣藥敏檢測板底座內(nèi)，用預先滅好菌的96孔板蓋進行加蓋； 用滅好菌的96

9、點陣藥敏檢測板的錐體蓋對應蘸取96孔板內(nèi)已稀釋好的上樣菌懸液，輕輕蓋在96點陣藥敏檢測板底座的藥物培養(yǎng)基對應位置上； 置37溫箱培養(yǎng)18-22小時觀察結果。如果錐體接觸的培養(yǎng)基位置長菌，說明該菌對板內(nèi)藥物抗藥；如果不長菌，說明該菌對板內(nèi)藥物敏感。注意：在傾倒培養(yǎng)基時，務必確保三個無菌，96點陣藥敏檢測板的底座、錐體蓋及96孔板蓋無菌。此外，操作時，請勿將手隨便在培養(yǎng)基表面晃動，及時蓋蓋；往培養(yǎng)基中加抗生素時，一定控制好培養(yǎng)基的溫度，溫度過高，藥物會失效；溫度過低，培養(yǎng)基會凝固，藥物混合不均勻。紙片擴散法藥敏檢測以下實驗方法主要適用于需氧菌及部分兼性厭氧菌（以大腸桿菌為例），微需養(yǎng)菌和厭氧菌的培

10、養(yǎng)條件亟待摸索。該方法能夠快速、準確地得到某種抗菌藥物對細菌臨床分離株的作用，抗藥還是敏感，以此作為臨床用藥指導的部分依據(jù)。菌懸液的制備： 菌液培養(yǎng)：取待測菌保存液10µL加入1mLMH肉湯（根據(jù)實際需要可做調(diào)整），置37溫箱過夜靜止培養(yǎng)12小時左右； 用無菌生理鹽水，對照0.5麥氏比濁管矯正菌液濃度；抗菌藥物紙片和培養(yǎng)基的制備： 抗菌藥物紙片可以從試劑公司直接購買，杭州天和等多家試劑公司均售（國產(chǎn)和進口）； 將滅菌MH固體培養(yǎng)基倒入無菌平板中，9cm平板中培養(yǎng)基高度約4cm；藥敏試驗的操作： 用無菌棉拭子蘸取菌液，在管內(nèi)壁將多余菌液旋轉擠去后，在培養(yǎng)基表面均勻涂抹3次，每次60&#

11、176;，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周； 平板置室溫下干燥3-5分鐘，用無菌鑷子將藥物紙片小心緊貼于培養(yǎng)基表面，各紙片中心相距>24mm，紙片距平板內(nèi)緣>15mm，紙片貼上后不可再移動； 置37溫箱培養(yǎng)16-18小時觀察結果（結果的判讀請參照附件二. 2009年NCCLS抗菌藥物敏感性試驗解釋標準）。注意：在涂抹菌懸液時，保證培養(yǎng)基表面干燥無水；在貼藥敏紙片時，一定要穩(wěn)、準，不能在培養(yǎng)基表面來回移動，水平放置，輕輕按壓即可；藥敏制片相聚不能太近，否則會影響結果的判讀。牛津杯法藥敏檢測牛津杯是藥學和理學實驗室中常用的基礎實驗器材，用牛津杯法做抑菌試驗要注意以下幾點事項：首先要把平板倒好，一

12、定要平，才能保證杯內(nèi)抑菌物質(zhì)均勻地向四周擴散；不要封口，常用的生物法測定抗生素采用杯碟法，“杯”是放被測抗生素的不銹鋼小管，小管內(nèi)徑6nm，高10nm的圓筒形管子，管子重量盡可能相等，碟是攤布培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)皿。藥敏試驗操作方法（一）： 將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基加熱至完全融化，倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，每碟15mL（下層），待其凝固； 將融化的培養(yǎng)及冷卻到50左右混入試驗菌，將混有菌的培養(yǎng)基5mL加到已經(jīng)凝固的培 養(yǎng)基上待其凝固（上層）。 在培養(yǎng)基表面垂直放上小杯，杯中加入待檢樣品，加滿后在37培養(yǎng)16-18小時。培養(yǎng)中，一方面試驗菌開始生長，另一方面抗生素成球面擴散，離杯越近，抗生素濃度越大，離杯越遠抗生素

13、濃度越小。隨著抗生素濃度減小，有一條是最低抑菌濃度帶，在帶范圍內(nèi)，細菌不能生長，而呈透明的圓圈，這就叫“抑菌圈”，抗生素濃度越高，抑菌圈越大。藥敏試驗方法（二）： 在“超凈臺”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細菌于少量生理鹽水，對照0.5麥氏比濁管矯正菌液濃度制成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密； 以無菌操作將滅菌

14、的不銹鋼小管（內(nèi)徑6nm、外徑8nm、高10 nm 的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養(yǎng)基上，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙，并在小管處標記各種藥物名稱。每個平板可放4-6支小管。待放好后，分別向各小管中滴加一定數(shù)量的待測抗菌藥物藥液，勿使其外溢。置37培養(yǎng)8-18小時，觀察結果。 將平皿培養(yǎng)基置于37溫箱中培養(yǎng)24小時后，觀察效果。聯(lián)合法藥敏檢測體外聯(lián)合藥敏試驗的目的在于：擴大抗菌譜，治療混合感染；預防或推遲細菌抗藥性的發(fā)生；聯(lián)合用藥還可以計量以避免達到毒性劑量；對某些抗藥細菌引起的嚴重感染，聯(lián)合用藥比單一用藥時效果更好?？咕幬锫?lián)合應用可出現(xiàn)以下4種結果：無關作用

15、，兩種藥物聯(lián)合作用的活性等于其單獨活性；拮抗作用，兩種藥物聯(lián)合作用顯著低于單獨抗菌活性；相加作用，兩種藥物聯(lián)合作用的活性等于兩種單獨抗菌活性之和；協(xié)同作用，兩種藥物聯(lián)合作用顯著大于其單獨作用的總和。藥敏試驗方法：棋盤稀釋法是目前臨床試驗時常用的定量方法，利用肉湯稀釋法原理，首先分別測定擬聯(lián)合的抗菌藥物對待測菌的MIC。根據(jù)所得MIC，確定藥物稀釋度（一般為6-8個稀釋度），藥物最高濃度為其MIC的2倍（即2MIC），依次對比稀釋。兩種藥物的稀釋分別在方陣的橫列和縱裂，這樣在每管（孔）中可得到不同濃度組合的兩種藥物混合液。接種菌量為5×105CUF/ml，37孵育18-24小時后觀察結

16、果。計算部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）指數(shù)。計算公式及判定標準： 注意：混合藥液的稀釋是很麻煩的一項操作，一定要細心！混合藥液的稀釋，可沿對角線依次倍比稀釋！附件一.抗菌藥物貯備液制備用溶劑和稀釋劑抗菌劑溶劑稀釋劑阿米卡星Amikacin水阿莫西林Amoxicillin磷酸緩沖液pH6.0, 0.1mol/L磷酸緩沖液pH6.0, 0.1mol/L氨芐西林Ampicillin磷酸緩沖液pH8.0, 0.1mol/L磷酸緩沖液pH6.0, 0.1mol/L安普霉素Apramycin95%乙醇水阿奇霉素Azithromycin95

17、%乙醇或冰乙酸肉湯培養(yǎng)基頭孢唑啉cefazolin磷酸緩沖液PH6.0, 0.1mol/L磷酸緩沖液PH6.0, 0.1mol/L頭孢噻呋Ceftiofur水或肉湯水或肉湯頭孢噻吩Cephalothin磷酸緩沖液pH 6.0, 0.1mol/L水頭孢氨芐cephalexin磷酸緩沖液PH6.0, 0.1mol/L水氯霉素Chloramphenicol95%乙醇水環(huán)丙沙星Ciprofloxacin水克拉維酸Clavulanic acid磷酸緩沖液pH 6.0, 0.1mol/L磷酸緩沖液pH 6.0, 0.1mol/L克林霉素Clindamycin水硫酸黏菌素Colistina水水達氟沙星dan

18、ofloxacin1/2體積水，逐滴加入1mol/L NaoH 至溶解水二氟沙星difloxacin1/2體積水，逐滴加入1mol/L NaoH 至溶解水強力霉素doxycycline水恩諾沙星enrofloxacin1/2體積水，逐滴加入1mol/L NaoH 至溶解水紅霉素erythromycin95%乙醇或冰乙酸水氟苯尼考florfenicol95%乙醇水氟甲喹flumequine1/2體積水，逐滴加入1mol/L NaoH 至溶解水慶大霉素Gentamicin水卡那霉素Kanamycin水左氧氟沙星levofloxacin1/2體積水，逐滴加入0.1mol/L NaoH 至溶解水麻保沙

19、星marbofloxacin1/2體積水，逐滴加入1mol/L NaoH 至溶解水甲氧西林methicillin水萘啶酸Nalidixic acld1/2體積水，逐滴加入1mol/L NaoH 至溶解呋喃妥因nitrolurantoinc磷酸緩沖液pH8.0, 0.1mol/L磷酸緩沖液pH8.0, 0.1mol/L諾氟沙星Norfloxacln1/2體積水，逐滴加入0.1mol/L NaoH 至溶解水新生霉素novobiocin水氧氟沙星ofloxacin1/2體積水，逐滴加入0.1mol/L NaoH 至溶解水苯唑西林oxacillin水土霉素oxytetracycline100% 甲醇水

20、青霉素penicillin水吡利霉素pirlmycin水多粘霉素B Polymywin B水水利福平Rifampin甲醇 最大濃度640µg/mL水(攪拌)大觀霉素Spectinomycin水鏈霉素Streptomycin水磺胺Sulfonamides1/2 體積熱水, 以最小量的2.5mol/L NaOH溶解水四環(huán)素Tetracycline水替米考星Tilmicosin95%乙醇水甲氧芐啶Trimethoprim0.05mol/L乳酸或鹽酸, 加入量為終濃度水（可能需要加熱）萬古霉素Vancomycin水注意：藥物不全，可以逐步補充！磷酸鹽緩沖液的配制母液：A：0.2 mol/L

21、Na2HPO4溶液 B：0.2 mol/L NaH2PO4 溶液Na2HPO4·2H2O分子量 = 358.22，0.2 mol/L溶液為71.64克/升。NaH2PO4·2H2O分子量 = 156.03，0.2 mol/L溶液為31.21克/升.0.1mol 磷酸緩沖液的配法：取A液x ml ,加 B 液 y ml, 稀釋至200 mlPH 6.0 x=12.3ml y=87.7ml PH 8.0 x=94.7ml y=5.3ml專心-專注-專業(yè)啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊