Western blot實驗步驟

1、Western blot實驗步驟SDS-PAGE1. 做膠前的準備1)檢查是否有足夠的、干凈的玻璃板、梳子和制膠架。2)檢查是否有新鮮的、足量10%APS，沒有就立刻重配。3)按將要檢測的抗體對應的原始抗原的分子量大小，計算出膠的濃度，并算出分離膠各組分的用量。（一般使用12%和7.5%）4)提前一天配制好轉印緩沖液，4預冷過夜2. 制膠，電泳1）裝置膠架a玻璃板凹面朝里，底部對齊至于架子上。b按正確方向安上楔子，先不壓緊。c將兩側邊扣扣緊。d雙手同時均勻用力，分別將兩側楔子向下壓緊。e檢查是否密封。2)按照下面配方配制分離膠。(單位：ml，總量： 7.5ml)7.51012%15%H2O7.

2、5ml6ml5ml3.5ml1.5MTris-HCL(pH=8.8 )3.75ml3.75ml3.75ml3.75ml10%SDS150l150l150l150l10%APS75l75l75l75lTEMED7.5l7.5l7.5l7.5l30%Acry/bis3.75ml5ml6ml7.5ml分離蛋白大小（kD）36-9420-8012-6010-43在分離膠上緩慢加入一層蒸餾水（約1ml），壓平分離膠，并促進膠更好的凝固。 3)待分離膠凝集后，配制濃縮膠。(單位：ml，總量：5ml)4H2O3.6ml1MTris-HCL(pH=6.8 )600l10%SDS50l10%APS25lTEME

3、D5l30%Acry/bis670l濃縮膠加完后迅速插入預先準備好的梳子，室溫待其凝固。4)制備蛋白樣。5×上樣緩沖液與樣品混合，使上樣緩沖液達到1倍濃度，100金屬浴或隔水煮8-10min，10000r/min離心5min5)待膠凝固好后，放入電泳槽中，加入電泳緩沖液沒過凝膠，6）垂直拔去梳子，上樣，電泳。濃縮膠使用140V電壓，約20-30min樣品電泳至交界面，調電壓至110V，繼續(xù)電泳約1.5h。3、考馬氏亮藍染膠1）鏟下棄去濃縮膠，小心剝下分離膠置于大平皿，倒入考馬氏亮藍染色液（覆蓋膠即可）2）搖床染色50min3）回收考馬氏亮藍染色液，脫色液搖床脫色30min4）棄去脫色

4、液，用新鮮脫色液搖床脫色30min（可根據(jù)情況增加脫色次數(shù)）注意：考染和轉印應為不同的兩塊膠。電轉移（轉?。? 實驗條件的選擇本電泳儀自動默認轉印電流為200mA。按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉移時間，一般轉印時間為100min，具體可以根據(jù)實際適當調整。目的蛋白分子大小(kDa)膠濃度電轉移時間(h)80-1408%25-8010%1.515-4012%0.75<2015%0.52 實驗操作 （1）濾紙和膜的準備 (提前準備)。A. 檢查是否有合適大小的濾紙和膜。B. 將合適的靠膠濾紙、靠膜濾紙、NC膜、海綿分別泡入轉印緩沖液中，4過夜。 （2）轉移A. 在電轉移儀上鋪好下層濾紙。

5、一般用3層。B. 將膠剝出，去掉濃縮膠，小心的移到靠膠濾紙上，注意和濾紙間不要有氣泡。C. 將膜鋪在膠上，注意和膠間不要有氣泡，再倒少許轉印緩沖液到膜上，保持膜的濕潤。剪去膜的左上角，作為標記。D. 將一張靠膜濾紙覆蓋在膠上。 倒上些轉印緩沖液，再鋪3層靠膜濾紙。E. 按照負極-海綿-靠膠濾紙-膠-膜-靠膜濾紙-海綿-正極的順序放入電泳槽。（NC膜濾紙膠）F. 裝好電轉移儀，將電泳槽置于盛滿冰的冰桶中，確保電泳槽全部被冰覆蓋。G. 轉移過程中要隨時觀察電壓的變化，如有異常應及時調整（電壓一般30-40V,功率6-8W）。 （3）麗春紅染膜 A 500l麗春紅+4.5ml蒸餾水配制染色液 B 將

6、膜浸泡其中，作用1-2min可見條帶。 C 用鉛筆標出泳道和maker條帶大小。 D PBS洗去麗春紅染液?？乖贵w反應1、封閉在轉移結束前配好5%的脫脂牛奶(TBST溶解)。轉移結束后將膜放入脫脂奶中封閉(一定要放在干凈的容器里，避免污染而且要足以覆蓋膜)， 4封閉過夜或者室溫封閉2h-4h。3、洗膜 用TBST先快速洗滌，5min×2。2、孵育一抗A. 先將需要檢測的抗體準備好，并決定好它們的稀釋度。配制5%的脫脂奶(TBST溶解)，按要求稀釋好抗體。B. 將稀釋好的抗體和膜一起孵育。 一般采用4過夜或者室溫1-2h，可根據(jù)抗體量和膜上抗原量適當延長或縮短時間。3、洗膜 用 TB

7、ST先快速洗滌，把脫脂奶盡快的洗掉。然后5min×5。洗滌是為了洗去一抗與抗原的非特異性結合，洗滌的效果直接影響結果背景的深淺。4、孵育二抗室溫孵育1h。采用HRP標記的二抗，稀釋比例1:5000-10000二抗的稀釋比例不能太低，否則容易導致非特異性的結合。注意二抗的選擇有多種，要根據(jù)一抗來選擇抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗。5、洗膜用 TBST先快速洗滌，把脫脂奶盡快的洗掉。 然后5min×5。洗滌是為了洗去二抗的非特異性結合，洗滌的效果直接影響結果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。6、顯色（HRP酶）增強化學發(fā)光法(ECL)1）將兩種顯色底物A和B,1：1等體積混合。2）將保鮮膜鋪在實驗桌上，將NC膜平鋪于保鮮膜上，染色液覆蓋在膜表面，作用1-2分鐘。3）用另一張保鮮膜把NC膜包起來，放入暗盒中，用膠帶固定。4）A：在暗室中將X光片折角作為標記，置于膜的上面，蓋好暗盒，進行壓片曝光，曝光時間根據(jù)實際情況而定，一般設定30s，1min，5min，10min等，根據(jù)條帶深淺程度調整曝光時間。B：取四張膠片相疊，同時放入暗盒中，壓片過夜（6h以上）。5）顯影30s-1min，定影30s-1min。（根據(jù)實際情況定時間）6）膠片沖洗干凈后，懸掛晾干后標記。注意：熒光在一段時間后會越來越弱；未干的膠片容易被刮花。DAB顯色1）配制DAB