生化分析儀的基礎(chǔ)與應(yīng)用全解

1、生化分析儀的基礎(chǔ)與應(yīng)用生化分析離不開生化分析儀。所謂生化分析一般是指以吸光光度分析為基礎(chǔ)的(有的 包含離子選擇電極等測定方法) 、具有樣品取樣及加試劑、混合、保溫反應(yīng)等測定。分析過 程監(jiān)控和數(shù)據(jù)處理及輸出能力的半自動(dòng)或全自動(dòng)儀器。 它們的分析方法都以儀器和試劑為基 礎(chǔ)，以方法學(xué)為指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)來規(guī)范，以試驗(yàn)參數(shù)來聯(lián)系體現(xiàn)。所以，首先必須了解儀器、試劑 和方法學(xué)的原理及特點(diǎn)， 其次是利用方法學(xué)評價(jià)對儀器、 試劑及參數(shù)在實(shí)踐中作評價(jià)， 以保 證分析的精密度和準(zhǔn)確度，提高成本效益。實(shí)驗(yàn)證明， 單色光經(jīng)過有色溶液時(shí)， 透過溶液的光強(qiáng)度不僅與溶液的濃度有關(guān)， 而且還與溶 液的厚度以及溶液本身對光的吸收性能有關(guān)

2、。其規(guī)律可用下式表示為A = KCL式中：A ( E)吸光度(或叫做光密度，也可用 D表示)；K 某溶液的消光(吸收)系數(shù)；C 溶液的濃度；L 光程，即溶液的厚度?？梢姟⑹展庾V法的定量基礎(chǔ)是朗伯比爾( Lambert-Beer )定律：A=lgI o/ I t =-lgT=lg1/T 吸光系數(shù)即當(dāng)一束強(qiáng)度為 L 的平行單色光通過一個(gè)含有濃度為 C 的吸光物質(zhì)、厚度為 L 的 吸收他時(shí)，光的一部分被吸收，光強(qiáng)度從Io減小至It。當(dāng)吸光系數(shù) k 一定時(shí)，透過光與濃度或厚度呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系，但吸光度(absorbanee, A)與濃度或厚度呈簡單的正比關(guān)系。在濃度、厚度、單色光波長、 溶劑及其溫度等相

3、同條件下， 不同吸光物質(zhì)的吸光度不同， 即它們的吸光系數(shù)( absorptivity )不同。是物質(zhì)的特性常數(shù),它只和該物質(zhì)分子在基態(tài)和激 發(fā)態(tài)之間的躍遷幾率有關(guān)。 它的物理意義是吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時(shí)的吸光度,常用的表示方式是摩爾吸光系數(shù) ( molar absorptivity )。摩爾吸光系數(shù)即 1 摩爾濃度的溶液在厚 度為 1em 時(shí)的吸光度。在吸光度與濃度之間的直線關(guān)系中,吸光系數(shù)是斜率,其值愈大, 測定靈敏度愈高。應(yīng)用注意點(diǎn)：1由于物質(zhì)對不同波長的光有不同的吸光系數(shù),Beer 定律成立的重要前提之一是單色光,即只有一種波長的光。但在實(shí)際測定中, 入射光常常并非嚴(yán)格的單色光,

4、常有不同波長 的輻射同時(shí)存在。此種多色輻射是使測定中吸光度的變化偏離Beer 定律(常為負(fù)偏離)的主要光學(xué)影響因素。單色光的純度可用譜帶寬度(ban dwidth)衡量。單色光源是用分光光度計(jì)由單色器或?yàn)V光片從連續(xù)光譜的多色光中選擇的、最大吸收波長入ma在內(nèi)的一小段波長范圍的復(fù)合光。以譜帶寬度較小、吸收峰較寬的入ma作為測定條件。2Beer 定律一般適用于稀溶液的測定有兩層含義：被測物的濃度不宜過大,其吸光度應(yīng)在相對測量誤差較小的區(qū)域；溶液在反應(yīng)中存在化學(xué)平衡，受濃度、pH、溶劑和溫度等因素的影響。3介質(zhì)不均勻引起偏離當(dāng)待測試液是膠體溶液、 乳濁液或懸浮液時(shí), 入射光因一部分散射損失,使透光率

5、減小,實(shí)測吸光度增加。比濁法及免疫濁度反應(yīng)的特點(diǎn)比濁法與可見、 紫外吸收光譜法不同, 它們不是測定澄清溶液而是測定懸浮液或膠體溶 液中物質(zhì)的濃度,分析的光學(xué)基礎(chǔ)是分散顆粒對光的反射、折射、散射和吸收等多種作用。 生化分析儀通過免疫比濁法等技術(shù), 架起臨床生化與現(xiàn)代免疫技術(shù)的橋梁, 免疫化學(xué)法的應(yīng) 用日益廣泛。1比濁法的分類及原理在光源的光路方向上測量透射光(實(shí)際包括透射光和散射光)強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度的比值和被檢溶液中顆粒濃度間的關(guān)系， 稱為透射比濁法 (turbidimetry )。 在光路的一定角度(一般為5° 90°)方向上測量散射光強(qiáng)度和被檢溶液中顆粒濃度間的關(guān)系，稱為

6、散射比濁法( nephelometry)。透射比濁法的計(jì)算公式是：In ( Io/I )=t b令 T =2. 3kcIgl °/ I = kbc即當(dāng)一束強(qiáng)度為Io的平行光通過一個(gè)散射顆粒濃度為c混濁介質(zhì)厚度為b的稀的懸浮液后，人射光被吸收和散射，光強(qiáng)度衰減至I，在濁度系數(shù)為T時(shí)，透過率與顆粒濃度呈線性關(guān)系。散射光強(qiáng)度與懸浮液或膠體溶液中的顆粒質(zhì)點(diǎn)大小、入射光波長大小及二者的比例有 關(guān)。顆粒直徑接近或大于光源波長時(shí)， 常呈透射光和光路上的向前散射光， 其散射光強(qiáng)度與 入射光強(qiáng)度的關(guān)系遵從 Mie 散射理論，光散射隨波長的變化小。顆粒遠(yuǎn)小于光源波長( d 小 于0. 05入)時(shí)常呈偏離

7、光路方向、900對稱分布的散射光，其散射光強(qiáng)度與人射光強(qiáng)度的關(guān)系符合 Rayleigh 散射定律，波長愈短，散射光愈強(qiáng)。一般比濁法的靈敏度不如可見、紫外吸收光譜法，但免疫濁度法的敏感度約為50ng/rnl。聚合劑(如聚乙二醇 6000 10000)可提高免疫復(fù)合物的形成速度。膠乳增強(qiáng)免疫濁度 法(latex en ha need turhidimetric immu noassay)由于采用顆粒較大、折光性強(qiáng)的膠乳，將抗 體經(jīng)吸附或共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)固定于膠乳表面， 增加抗原抗體凝聚體積， 減少透過光， 使靈敏度 提高到近 1ng/ml 水平。散射比濁法的靈敏度比透射比濁法高，但干擾因素較多。比濁法

8、 的精密度相近，變異系數(shù)為1 55。目前，由于技術(shù)發(fā)展，兩種比濁法的靈敏度和特異性已接近， 而全自動(dòng)生化儀的自動(dòng)化程度和精密度要?jiǎng)儆趯Ｓ蒙⑸浔葷醿x，故透射免疫比濁法在臨床上的應(yīng)用日益廣泛。 速率法的靈敏度和特異性都優(yōu)于終點(diǎn)法，但終點(diǎn)法的穩(wěn)定性較好。2免疫濁度反應(yīng)的特點(diǎn) 抗原抗體反應(yīng)與其他化學(xué)反應(yīng)不同，在免疫濁度反應(yīng)中，抗原抗體復(fù)合物的生成量和 生成顆粒的大小， 與反應(yīng)體系中抗原抗體的比例關(guān)系極大抗原相對不足時(shí)，生成的免疫復(fù)合物沉淀量少；抗原抗體比例合適時(shí)，復(fù)合物生成量達(dá)到峰值； 抗原過量時(shí)， 復(fù)合物反而再溶解，沉淀量下降。臨床上免疫比濁法多用抗體測定抗原，保證抗體足量、 防止抗原過量是基本的方

9、法學(xué)條件。要使在臨床常見的高抗原濃度范圍內(nèi)(至少高于正常參考上限 50 )抗體也足以與之反應(yīng)，只有這樣，抗原抗體復(fù)合物的生成量才隨抗原的增 加而遞增，光散射的強(qiáng)度才與抗原量成比例。抗體不足時(shí)，測定結(jié)果往往偏低。3 應(yīng)用注意點(diǎn)(1) 若懸浮顆粒本身具有特征吸收，則吸收作用是主要的，宜選擇最大吸收波長作比濁測定； 若懸浮顆粒本身無特征吸收而介質(zhì)對人射光有吸收， 則測定必須選擇在高透光度的 波長區(qū)。若懸浮顆粒小(粒徑小于35nm),溶液濁度小，透射比大于90%，不宜選用透射比濁法，應(yīng)選擇散射比濁法測定。(2) 透射比濁時(shí)， 35100nm 大小的微粒在波長 290410nrn 下有最大吸收峰，免疫復(fù)

10、合物的大小大致在此范圍。散射比濁時(shí)，較大的散射光角度適用于35100nrn 大小的微粒，較小的散射光角度適用于100 800nrn間的微粒。血漿中的白蛋白、B脂蛋白、免疫球蛋白等微粒直徑多在 50nrn 以下，其散射光是對稱的。 IgM 、乳糜顆粒、免疫反應(yīng)初期產(chǎn)生 的抗原抗體復(fù)合物等顆粒的直徑在 50-400nrn ，都屬顆粒直徑接近或大于光源波長這一類， 其散射光是不對稱的。(3) 非特異性光散射的影響：免疫濁度法常受內(nèi)源性光散射的干擾。血清中的乳糜微粒、 VLDL 、LDL 以及反應(yīng)體系中的顆粒都會(huì)產(chǎn)生雜散光，影響比濁靈敏度。為避免上述影 響，樣品組分的比例，透射比濁法宜在3以下，散射比

11、濁法應(yīng)在 05以下。所用的試劑要澄清，必要時(shí)經(jīng) 0. 22 E濾膜過濾。應(yīng)作試劑空白和樣品空白。(4) 帶現(xiàn)象(zone phenomenon)的影響： 抗原或抗體過剩使免疫復(fù)合物部分或全部解離的現(xiàn)象，稱為帶現(xiàn)象。免疫濁度測定中 常表現(xiàn)為抗原過剩時(shí)免疫復(fù)合物形成的量反而下降，又稱鉤狀效應(yīng)(hook effect )?？朔k法主要是：采用高質(zhì)量試劑，設(shè)置儀器監(jiān)測，減少血清用量。( 5)偽濁度的影響：即不是特異性抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生的免疫復(fù)合物形成的濁度。形 成原因復(fù)雜， 主要是抗血清存在的非特異性交叉反應(yīng)性雜抗體成分， 增濁劑濃度過高和反應(yīng) 時(shí)間掌握不當(dāng)，樣品本身的濁度處理不當(dāng)，試劑污染和變質(zhì)，比色

12、杯不潔，等等。( 6)校準(zhǔn)與計(jì)算：應(yīng)選用適當(dāng)?shù)男?zhǔn)品及濃度作劑量反應(yīng)曲線。曲線往往有截距或呈S形，不成直線。自動(dòng)生化分析儀多推薦 5點(diǎn)或6點(diǎn)定標(biāo)，然后選擇適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)模型作曲線 擬合，如Ingit Log變換或y= d+ ex + bx2 + ax3的3次方程回歸曲線。更換試劑批號 時(shí)也必須重新校準(zhǔn)曲線。(三)均相酶免疫分析 酶聯(lián)免疫分析利用免疫反應(yīng)的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性對抗原或抗體進(jìn)行測定，均相酶免疫分析(homoge neous en zyme immuno assay )是其中的一類。在均相酶免疫分析中，最常用的是酶放大免疫分析( enzyme multiplied immun

13、oassay ， EMIT )。其原理是：當(dāng)酶標(biāo)抗原(半抗原)與相應(yīng)抗體結(jié)合，生成酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物后， 對標(biāo)記酶產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用， 使酶的構(gòu)象改變，酶活性抑制、 恢復(fù)或增強(qiáng)， 酶催化的信號隨之發(fā) 生改變； 酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物與游離酶標(biāo)抗原同處一相， 不需分離步驟就可測定酶活性， 計(jì) 算出被檢抗原(半抗原) 的含量。常采用酶標(biāo)抗原與未知抗原對特異性抗體的競爭反應(yīng)：抗 原與標(biāo)記酶結(jié)合使酶的活性抑制或激活， 再與相應(yīng)抗體結(jié)合后其酶活性被激活或抑制， 未知 抗原和酶標(biāo)抗原與抗體形成競爭體系。均相酶免疫分析目前主要用于檢測小分子半抗原， 如某些激素、 藥物或代謝產(chǎn)物， 也逐 漸用于大分子物質(zhì)，如血清 Ig

14、G測定。測定藥物的靈敏度一般為0. 5 2/ml。方法簡便、快速，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好，但影響酶活性的因素也必然影響酶聯(lián)免疫分析?？寺∶腹w免疫分析( cloned enzy。 donor immunoassay， CEDIA )是有發(fā)展前途的均 相酶免疫技術(shù)， 靈敏度比一般酶免疫法高。 其原理為： 用基因工程技術(shù)制備稱為酶供體 ( ED) 和酶受體(EA)的兩肽段。ED和EA獨(dú)立存在時(shí)無酶活性，但在合適條件下可以自動(dòng)裝配 并聚合成具有酶活性的四聚體。 ED 標(biāo)記申抗原小分子或抗原大分子后，不影響其與 EA 的 裝配， 但當(dāng)相應(yīng)抗體存在時(shí)， 抗原抗體結(jié)合后形成的空間位阻使酶的裝配受阻， 使用競爭結(jié)

15、 合模式即可檢測末知的半抗原或抗原。(四)酶促反應(yīng)的特點(diǎn)：由酶催化的反應(yīng)稱為酶促反應(yīng)。 以酶作為試劑來進(jìn)行分析測定， 或通過酶促反應(yīng)測定待 測酶的活性， 具有高效、 專一、溫和、靈敏的特點(diǎn)， 廣泛用于生化分析。 試劑中的酶活性 (濃 度)在反應(yīng)過程中始終不變。下面僅對酶活性測定知識作介紹。1.酶活性測定生物體內(nèi)含有成千種酶，存在于細(xì)胞中。當(dāng)細(xì)胞通透性增加或細(xì)胞破裂時(shí)，會(huì)使體液中酶濃度增加， 因此測定體液中特別是血液中酶濃度的變化有助于臨床診斷 疾病、判斷預(yù)后和觀察療效。血液中的酶含量甚微，一般每毫升含量在微微克(Pg)到毫微克(n g)水平，因此要直接測定酶含量是非常困難的。雖然近年免疫學(xué)技術(shù)

16、發(fā)展迅速，可 以對某些酶直接進(jìn)行測定，但目前臨床仍以測定酶活性間接推算酶的含量。酶活性的大小， 是在一定條件下通過測定酶促反應(yīng)過程中單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量引起的吸光度變化， 即測定酶促反應(yīng)的速率來獲得的。 一般情況下， 產(chǎn)物和底物的濃度變化是一致的， 但測定產(chǎn)物的生成要比測定底物的減少為好。這是由于反應(yīng)體系中使用的底物往往是過量的， 反應(yīng)時(shí)間通常又很短， 尤其在酶活性很低時(shí)， 底物減少量僅占加 入量的很小比例，因此測定不易精確；反之，產(chǎn)物從無到有，只要測定方法靈敏，準(zhǔn)確度可 以很高。所以，酶活性測定大多數(shù)采用測定產(chǎn)物生成速率的方法。2 酶促反應(yīng)三階段酶促反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)，其反應(yīng)

17、全過程的速率并不都與酶活性成正比。將酶促反應(yīng)過程中測得的產(chǎn)物或底物的變化量對時(shí)間作圖，得到酶促反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線，圖中產(chǎn)物P或底物S的濃度變化曲線的斜率就代表酶反應(yīng)速率。酶促反應(yīng)一般分為三階段。(1) 延滯期(lag phase)：底物與酶混合、反應(yīng)啟動(dòng)后的一段短時(shí)間內(nèi)，產(chǎn)物從零開始逐漸 生成，處于較低水平，反應(yīng)速度較低，未達(dá)到待測酶最大反應(yīng)速度；另外，在酶偶聯(lián)反應(yīng)中，指示酶的反應(yīng)必須有一定量測定酶的產(chǎn)物堆積才能進(jìn)行；這些都使酶反應(yīng)要稍待一定時(shí)期 后，吸光度才有明顯的線性變化，這一時(shí)期稱為延滯期。延滯期的長短不一，當(dāng)反應(yīng)體系中存在抑制劑或有干擾物質(zhì)參與的副反應(yīng)時(shí)，延滯期可延長；當(dāng)樣品酶活性過高或

18、反應(yīng)體系中存在激動(dòng)劑時(shí)，延滯期可縮短。在開始酶反應(yīng)(即待測樣品與基質(zhì)混合)之前，應(yīng)有一個(gè)預(yù)孵育期(pre In cubationperiod),讓所有可能干擾測定的反應(yīng)充分進(jìn)行，避免干擾待測酶活性。內(nèi)源性產(chǎn)物被工具 酶催化消耗，內(nèi)源性底物也通過偶聯(lián)反應(yīng)充分消耗，然后加入底物啟動(dòng)反應(yīng)。(2) 線性期(linear。base):在反間應(yīng)體系中底物大于酶飽和濃度的情況下，產(chǎn)物或 底物的變化量隨反應(yīng)時(shí)間呈線性增減，即反應(yīng)速度(單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物或底物的變化量)恒定不變，這一時(shí)期稱為線性期或恒態(tài)期，亦稱零級反應(yīng)期。在此期，反應(yīng)速度不受底物和產(chǎn)物濃度的影響，只與酶活性濃度呈線性關(guān)系。測定酶活性都在零級反應(yīng)期進(jìn)

19、行。(3) 偏離線性期：隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，反應(yīng)體系中的底物不斷消耗，酶不能被其飽和，以及可逆反應(yīng)、產(chǎn)物抑制、酶變性失活等原因，致酶促反應(yīng)速度下降，產(chǎn)物或底物的變化曲線漸趨平坦，這一時(shí)期稱為偏離線性期，亦稱一級反應(yīng)期。在此期，反應(yīng)速度不僅與酶活性濃度有關(guān)，還受底物濃度影響， 與底物濃度成正比，因此不能準(zhǔn)確反映酶的真正活性，產(chǎn)物濃度與反應(yīng)時(shí)間不呈線性關(guān)系。二、自動(dòng)生化分析儀的基本結(jié)構(gòu)及工作原理(基本結(jié)構(gòu))1 按照反應(yīng)裝置的結(jié)構(gòu)，自動(dòng)生化分析儀主要分為流動(dòng)式 (flow system )、分立式(discrete system、兩大類。(l) 流動(dòng)式：指測定項(xiàng)目相同的各待測樣品與試劑混合后的化學(xué)反

20、應(yīng)在同一管道流動(dòng) 的過程中完成，這是第一代自動(dòng)生化分析儀。（2）分立式：指各待測樣品與試劑混合后的化學(xué)反應(yīng)都是在各自的反應(yīng)杯中完成的， 其中有幾類分支。I ）典型分立式自動(dòng)生化分析儀：此型儀器應(yīng)用最廣。2）離心式自動(dòng)生化分析儀：每個(gè)待測樣品都是在離心力的作用下，在各自的反應(yīng)槽內(nèi)與試劑混合，完成化學(xué)反應(yīng)并測定。由于混合、反應(yīng)和檢測幾乎同時(shí)完成，它的分析效率較高。3）袋式自動(dòng)生化分析儀：是以試劑袋來代替反應(yīng)杯和比色杯，每個(gè)待測樣品在各自的 試劑袋內(nèi)反應(yīng)并測定。4）固相試劑自動(dòng)生化分析儀：亦稱為子化學(xué)式自動(dòng)分析儀，是將試劑固相干膠片或?yàn)V紙片等載體上，每個(gè)待測樣品搞加在相應(yīng)試紙條上進(jìn)行反應(yīng)及測定。操作

21、快捷、便于攜帶是它的優(yōu)點(diǎn)。生化分析儀的正確應(yīng)用只是掌握了測定技術(shù)原理還不夠，還需要對具體儀器的工作流 程及測定計(jì)算方法有足夠了解。1一般工作流程工作流程可以通過儀器的測定周期來考察。重點(diǎn)關(guān)注比色杯空白讀 數(shù)點(diǎn)（Cb）、加樣品點(diǎn)（S）、各試劑加液點(diǎn)（R、R2、）、試劑空白讀數(shù)點(diǎn)（Rb ）、各測定 讀數(shù)點(diǎn)（P）、各點(diǎn)時(shí)間間隔及周期總時(shí)間等。每個(gè)儀器一般都在反應(yīng)轉(zhuǎn)盤的固定位置和反 應(yīng)測定周期的固定時(shí)間設(shè)置樣品、試劑和稀釋的加液位，以及（始點(diǎn)測定吸光度一始點(diǎn)空白吸光度）。如HITACHI7170在P1至P34周期為10分鐘具體工作流程如圖 2-2所示HM 2力 R &A|aor.攪拌攬拌。Sm

22、in10 min 時(shí)間g 清洗，準(zhǔn)備（釣2.5min） 4 10 鐘反應(yīng)周期耳纟勺2分鐘|圖2-22 .數(shù)據(jù)處理計(jì)算方法儀器在各個(gè)吸光度讀數(shù)點(diǎn)讀取的吸光度數(shù)據(jù)，并不一定都納入濃度計(jì)算。儀器往往根 據(jù)儀器定義和操作者設(shè)定的要求，對吸光度原始數(shù)據(jù)作計(jì)算處理，轉(zhuǎn)換成所謂的反應(yīng)數(shù)據(jù)， 再按系數(shù)或公式作濃度計(jì)算。舉例如下：（1）HITACHI 7170的終點(diǎn)法：測定點(diǎn)（Ax）吸光度計(jì)算為（Ax + Ax-i ）/ 2,實(shí)際 吸光度=吸光度數(shù)據(jù)X 10000。（2）OLYMPUS AU600試劑空白數(shù)據(jù)：Po點(diǎn)試劑空白（Rb）= Po點(diǎn)吸光度一比色杯水空白（Wb）;任一測定點(diǎn)試劑空白（Rbx）=該點(diǎn)吸光度

23、一比色杯水空白（Wb）。（3） Monarch 1000兩點(diǎn)終點(diǎn)法的反應(yīng)數(shù)據(jù) =（終點(diǎn)測定吸光度一終點(diǎn)空白吸光度） （始點(diǎn)測定吸光度一始點(diǎn)空白吸光度）（4） AU600終點(diǎn)法（帶試劑空白，END法）的反應(yīng)數(shù)據(jù)=終點(diǎn)吸光度一 Po點(diǎn)吸光度（試劑空白，Rb）。終點(diǎn)法（不帶試劑空白，ENDI法）的反應(yīng)數(shù)據(jù)=終點(diǎn)吸光度一比色杯空 白（ WB）。（5）AU600 兩點(diǎn)法（自身空白） 的反應(yīng)數(shù)據(jù)二 （加第二試劑后測定點(diǎn)讀數(shù) -PO 點(diǎn)讀數(shù)） （加第二試劑前測定點(diǎn)讀數(shù) -Po 點(diǎn)讀數(shù)）。1儀器運(yùn)行前操作程序主要進(jìn)行儀器的基本設(shè)置。（1）試驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置：對試驗(yàn)名稱、編碼、試驗(yàn)組合（ profile ）、試驗(yàn)輪次

24、（ round ）、必 要時(shí)包括試驗(yàn)順序等設(shè)置。（2）各試驗(yàn)的參數(shù)設(shè)置：包括試驗(yàn)間比值、結(jié)果核對等參數(shù)的設(shè)定。（3）試劑設(shè)置：根據(jù)有關(guān)試驗(yàn)參數(shù)設(shè)置各試驗(yàn)的試劑位、試劑瓶規(guī)格，必要時(shí)設(shè)定試 劑批號、失效期等。（4）校準(zhǔn)品設(shè)置：對校準(zhǔn)品的位置、濃度和數(shù)量等進(jìn)行設(shè)置。（5）質(zhì)控設(shè)置：根據(jù)質(zhì)控要求設(shè)置質(zhì)控物個(gè)數(shù)、質(zhì)控規(guī)則、質(zhì)控項(xiàng)目及相應(yīng)質(zhì)控參數(shù) 等。3測定結(jié)果的檢查分析（1）要了解和熟悉儀器的各種警示符號的含義與作用：在正確設(shè)定參數(shù)的前提下利用各 種警示符號能提高我們發(fā)現(xiàn)問題和解決問題的效率。（ 2）要熟悉和靈活運(yùn)用儀器的相關(guān)操作屏 （界面）：如用反應(yīng)過程監(jiān)測觀察反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線；用校準(zhǔn)追蹤（cali

25、bration trace ）回顧分析校準(zhǔn)曲，利用統(tǒng)計(jì)（statistics） 了解不同日 期段病人測定均值及數(shù)據(jù)分布；運(yùn)用分析數(shù)據(jù)編輯察看和校正測定數(shù)據(jù)。（ 3）校準(zhǔn)的檢查： 要充分利用儀器設(shè)置的功能檢測校正曲線圖形、各校準(zhǔn)點(diǎn)吸光度值 （不能忽略試劑空白值及空白速率值）計(jì)算 K 值等的波動(dòng)情況，以及以往的比較。必要時(shí)應(yīng)進(jìn) 一步檢查反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線。必須結(jié)合質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)來把握實(shí)踐條件。（ 4）病人結(jié)果的檢查：除了目測觀察或用血清指數(shù)了解標(biāo)本性狀、注意和了解臨床及診 斷外，學(xué)會(huì)分析反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線及數(shù)據(jù)是重要的基本功。四基本測定方法1終點(diǎn)法（ end point method ）根據(jù)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)反

26、應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜特征及其吸光 度大小，對物質(zhì)進(jìn)行定量分析的方法。對一般化學(xué)反應(yīng)來說，反應(yīng)完全（或正、逆反應(yīng)動(dòng)態(tài) 平衡）、反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定時(shí)為反應(yīng)終點(diǎn)。對抗原一抗體反應(yīng)來說，是抗原和抗體完全反應(yīng)、形 成最大且穩(wěn)定的免疫復(fù)合物時(shí)為終點(diǎn)。在反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線上為與X 軸平行的區(qū)段。在測定計(jì)算方式上，一般分為一點(diǎn)法和兩點(diǎn)法兩種。（1） 一點(diǎn)法（one point）：以試劑和樣品混合之前的空氣空白（ GB）、水空白（WB）或 試劑空白（RB）的吸光度值為測定計(jì)算基點(diǎn)，以反應(yīng)終點(diǎn)的吸光度讀數(shù)減去空白讀數(shù)，得 到反應(yīng)吸光度。 通過與相同條件下校準(zhǔn)液反應(yīng)吸光度的比較， 求得測定結(jié)果。 常與一點(diǎn)校準(zhǔn) 法配合使用，即采

27、用一個(gè)校準(zhǔn)濃度，校準(zhǔn)曲線通過零點(diǎn)且成線性。也應(yīng)用多點(diǎn)校準(zhǔn)。（2）兩點(diǎn)終點(diǎn)法（two point end ）:即終點(diǎn)-始點(diǎn)法。以試劑和樣品混合之后的某一時(shí)間 點(diǎn)作為始點(diǎn)， 以反應(yīng)終點(diǎn)的吸光度讀數(shù)減去始點(diǎn)讀數(shù)。 一定條件下可降低樣品對反應(yīng)或反應(yīng) 本身的非特異性干擾（主要指色度干擾） 。常采用雙試劑，多以加 R2 前某一點(diǎn)作為測定始 點(diǎn)；某些情況下，也可以加 R2 后一點(diǎn)作為測定始點(diǎn)。若使用單試劑，主反應(yīng)啟動(dòng)太快或儀 器起始讀數(shù)點(diǎn)受限時(shí)難以運(yùn)用。固定時(shí)間法（fixed method）與兩點(diǎn)終點(diǎn)法的區(qū)別只是在：測定讀數(shù)的末點(diǎn)不在反應(yīng)平 衡區(qū)段，而是根據(jù)方法學(xué)選擇，如血清肌肝（苦味酸法）測定。（ 3）三

28、點(diǎn)終點(diǎn)法：即雙終點(diǎn)法，在一個(gè)通道內(nèi)一次進(jìn)行兩項(xiàng)反應(yīng)相關(guān)的終點(diǎn)法測定， 比如同測游離脂肪酸和甘油三酯。某些儀器（如 HITACHI 系列）設(shè)置此方法。2連續(xù)監(jiān)測法（continuous monitoting method ）又稱速率法（rae assay）即連續(xù)監(jiān)測反應(yīng) 過程，根據(jù)所測定的產(chǎn)物生成或底物消耗的速度進(jìn)行定量分析的方法。在反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線 上為反應(yīng)呈恒速區(qū)段（斜率保持不變） ，常用于酶活性線性反應(yīng)期測定。（1） 連續(xù)監(jiān)測法：即零級反應(yīng)速率法，亦稱斜率法。在較長的反應(yīng)時(shí)間區(qū)段內(nèi)（至少 90 120 秒），每隔一定時(shí)間（常為 230秒）讀取一次吸光度值，至少讀取4點(diǎn)，得到 3 個(gè)&quo

29、t;A ; 一般將連續(xù)多次讀數(shù)作最小二乘法處理，讀數(shù)間隔時(shí)間太短的作帶速率時(shí)間（TR）多點(diǎn)法處理，均取線性反應(yīng)部分的讀數(shù)，求出單位時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)速率"A/min。此法必須以零級反應(yīng)為測定計(jì)算的基礎(chǔ)，因?yàn)橹挥性诹慵壏磻?yīng)下，單位時(shí)間內(nèi)的吸光度變化反應(yīng)速率"A/ min ）才與酶活力呈正比。此法相對減少了分析誤差，大大提高了分析速度和準(zhǔn)確性。 但是，半自動(dòng)生化分析儀采用單樣品連續(xù)監(jiān)測，相當(dāng)耗時(shí)。應(yīng)用連續(xù)監(jiān)測法，首先應(yīng)準(zhǔn)備線性范圍內(nèi)的高、中、低濃度的樣品，分別作反應(yīng)時(shí)（2）兩點(diǎn)速率法：即所謂的擬一級速率法。在反應(yīng)中選取兩時(shí)間點(diǎn)t1、t2，讀取吸光度Ai、A2,計(jì)算（A1 A2）/（

30、ti t2） = "A/" t。此方法與兩點(diǎn)終點(diǎn)法的區(qū)別主要有兩 點(diǎn)：后一讀數(shù)點(diǎn)反應(yīng)未達(dá)終點(diǎn)， 以速率計(jì)算結(jié)果。 與連續(xù)監(jiān)測法比較， 其缺點(diǎn)在于人為確定 ti、t2，不定因素較多，不能保證反應(yīng)在ti t2期間呈線性，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。應(yīng)在常規(guī)測定前先做預(yù)試驗(yàn)來確定線性時(shí)間段; 若在選擇的時(shí)間段內(nèi)反應(yīng)不成線性 （如零 級反應(yīng)期短，儀器無法設(shè)置或測定） ，則只能改用終點(diǎn)法。 優(yōu)點(diǎn)在于方法簡單，酶活力較低， 測定吸光度值較小時(shí)， 可增加測定時(shí)間段而不受儀器連續(xù)監(jiān)測時(shí)間點(diǎn)的局限， 減小了讀數(shù)誤 差。（3）速率 B 法：在一個(gè)通道內(nèi)一次進(jìn)行兩項(xiàng)反應(yīng)相關(guān)的速率法測定。它既可以是兩 項(xiàng)試

31、驗(yàn)測定， 也可用于干擾或/及樣品空白自動(dòng)補(bǔ)償。 后一用途的原理是： 利用儀器的微機(jī) 自動(dòng)處理，在第一反應(yīng)（干擾反應(yīng)）一直維持線性的前提下，可以從第二反應(yīng)（主反應(yīng)）速 率中扣除第一反應(yīng)速率的延續(xù)影響。 如可用于消除膽紅素轉(zhuǎn)化為膽綠素后吸光度下降、 對肌 酥苦味酸法測定的負(fù)干擾，等等。某些儀器（如 HITACHI 系列）設(shè)置此方法。3,空白（blank）校正在分光光度法中，常利用空白溶液來調(diào)節(jié)儀器的吸光度零點(diǎn)，或 用來抵消某些測定的干擾因素。 在生化分析儀測定中， 除了采用雙或多波長、 兩點(diǎn)法等排除 背景干擾外, 常要運(yùn)用專門空白測定, 以便從樣品測定吸光度中扣除其影響。 正確選擇空白 校正,對提

32、高準(zhǔn)確度起著重要作用。（1）試劑空白：一般在方法類型和校準(zhǔn)模式中，即分為有或無試劑空白兩大類。試劑 空白單獨(dú)測定或與校準(zhǔn)配合測定, 并需預(yù)先裝載去離子水樣品杯或試劑空白架。 校準(zhǔn)或病人 樣品各測定點(diǎn)的吸光度,均要扣除相應(yīng)測定點(diǎn)的試劑空白吸光度或空白速率值。在不少儀器中,試劑空白測定類似校準(zhǔn)測定,并非在病人樣品測定時(shí)實(shí)時(shí)測定。所以, 要注意它的測定頻率,避免因試劑批號或質(zhì)量變化造成試劑空白的改變而引起計(jì)算誤差。（2）樣品空白：主要為了消除樣品本身混濁或色度的干擾。常采用空白通道法,測定 校正結(jié)果 =顯色反應(yīng)通道結(jié)果 -空白通道結(jié)果。 多數(shù)儀器須另外占用測定通道, 分析速度減半, 但去干擾的準(zhǔn)確性

33、應(yīng)高于兩點(diǎn)終點(diǎn)法。三、自動(dòng)生化分析儀的基本參數(shù)及應(yīng)用了解生化分析儀基本參數(shù)的原理, 有利于儀器、 試劑的正確使用, 有助于正確分析和處 理測定數(shù)據(jù)。 但是, 配套系統(tǒng)的原裝分析參數(shù)不宜更改; 采用非儀器配套的試劑及校準(zhǔn)品體 系時(shí), 參數(shù)修改要慎重。 對于不同儀器、 不同類型的反應(yīng)分析程序,所顯示的人機(jī)對話分析 參數(shù)的信息有所不同。（一）反應(yīng)測定時(shí)間多數(shù)全自動(dòng)生化分析儀可以在整個(gè)測定反應(yīng)周期內(nèi)連續(xù)監(jiān)測 （如 HITACHI 7i70 常規(guī)測 定周期10分鐘，監(jiān)測 34點(diǎn)，OLYMPUS AU600固定周期8分15秒，監(jiān)測27點(diǎn)），但反 應(yīng)監(jiān)測時(shí)間是指該時(shí)間內(nèi)的測定讀數(shù)要用于結(jié)果計(jì)算。 它的設(shè)置與

34、加樣點(diǎn)、 加試劑點(diǎn)（包括R1、R2）、監(jiān)測時(shí)間（讀數(shù)點(diǎn)）、讀數(shù)間隔時(shí)間及試劑樣品比例等有關(guān)，要結(jié)合方法學(xué) 兼顧權(quán)衡。1反應(yīng)時(shí)間（ reactfon time ） 指儀器的一個(gè)分析周期中，試劑和樣品混合到最末一點(diǎn)測定讀數(shù)的時(shí)間。它對終點(diǎn)法 尤其重要，是終點(diǎn)法的瓶頸。有的儀器有多個(gè)反應(yīng)時(shí)間可選（如 HITACHI 7170 ），須預(yù)先 選定。多數(shù)儀器為 10 分鐘左右，這對試劑提出了較高要求。不少終點(diǎn)法試劑（尤其手工法 試劑）反應(yīng)時(shí)間常常也在 10 分鐘上下，測定時(shí)間沒有余地，當(dāng)樣品濃度高或試劑質(zhì)量下降 時(shí)，均可致測定結(jié)果偏低。 因此， 終點(diǎn)法不宜采用標(biāo)明反應(yīng)時(shí)間接近和長于儀器最大反應(yīng)時(shí) 間的試劑

35、盒。不得已時(shí)必須用接近測定范圍上限的高濃度質(zhì)控血清監(jiān)測。2監(jiān)測時(shí)間（讀數(shù)點(diǎn)）和讀數(shù)間隔時(shí)間 各類型儀器不盡一致。離心式生化儀讀數(shù)間隔時(shí)間短，監(jiān)測時(shí)間也短。流動(dòng)式生化儀 讀數(shù)間隔時(shí)間一般較長。 分立式生化儀一般監(jiān)測時(shí)間 10 分鐘左右，間隔 1030 秒讀數(shù)一次。 有的儀器在整個(gè)測定反應(yīng)周期全程讀數(shù)，有的只讀取指定時(shí)間（點(diǎn)）的吸光度。3加試劑點(diǎn)采用雙試劑時(shí)，加 R2點(diǎn)決定R1與樣品的反應(yīng)時(shí)間，也決定 R2與R1及樣品的反 應(yīng)時(shí)間。一般儀器各 5分鐘左右。 HITACHI 7170 有四個(gè)加試劑點(diǎn)，若采用雙試劑，各 5 分鐘，則加 R2 設(shè)在第 3 加試劑點(diǎn)。4反應(yīng)監(jiān)測時(shí)間還要考慮延遲時(shí)間的長短、

36、測定物質(zhì)的濃度范圍及相關(guān)臨床價(jià)值。工 作效率等因素。（二）延遲時(shí)間延遲時(shí)間（delay time）是指試劑與樣品混合后到監(jiān)測開始之間的時(shí)間。一般用于兩點(diǎn) 法和速率法， 某些情況下也用于終點(diǎn)法。 終點(diǎn)法應(yīng)選擇反應(yīng)趨于平衡的時(shí)間 （穩(wěn)定期或平衡 期）作測定，測定點(diǎn)前即所謂的孵育期。 速率法的線性反應(yīng)期之前即延遲期。正確選擇延遲 時(shí)間的長短，有利于準(zhǔn)確測定， 減少試驗(yàn)誤差。設(shè)置一般根據(jù)試劑盒的說明書，還應(yīng)考慮本 室的儀器特點(diǎn)和工作程序。1 儀器特點(diǎn) 比如半自動(dòng)生化儀多為流動(dòng)比色池， 要考慮泵速、 進(jìn)樣管長短。反應(yīng)液 粘稠度及混合情況， 以及室溫、 反應(yīng)液溫度同反應(yīng)要求溫度間的溫差， 等等。全自動(dòng)生化

37、儀 的測定讀數(shù)設(shè)置方式不同，直接以“秒”設(shè)置，或以測定點(diǎn)設(shè)置，測定點(diǎn)間隔時(shí)間不一樣， 需要靈活掌握。2試劑及方法學(xué)（I）試劑組成：在酶活性的連續(xù)監(jiān)測法時(shí)，若試劑含工具酶數(shù)量多、偶聯(lián)反應(yīng)多，則 激活反應(yīng)時(shí)間一般較長，延遲時(shí)間也較長，如肌酸激酶（ NAC 法）延遲時(shí)間常設(shè)置 120 180 秒；若試劑中底物經(jīng)待測酶催化，其產(chǎn)物可以直接測定的，則延遲時(shí)間較短， 如y谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）設(shè)定30- 60秒。同一項(xiàng)目同一方法，但試劑配方不同，其反 應(yīng)快慢等特征也可能不同，如白蛋白測定。白蛋白與溴甲酚綠（BCG ）為即時(shí)反應(yīng)，10秒鐘內(nèi)已完成，其后 a B球蛋白等也將與 BCG發(fā)生反應(yīng)，所以孵育時(shí)間不能

38、延長。但在同 一測定時(shí)間， BCG 濃度、緩沖液種類、 pH 和表面活性劑不同的試劑，測定結(jié)果可能差異明 顯。（2）樣品異常成分干擾：有的試驗(yàn)項(xiàng)目需要用工具酶將內(nèi)源性代謝產(chǎn)物耗盡，比如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性測定試劑中須有足量的乳酸脫氫酶（ LDH ）。如果使用單試劑，正常 血清樣品延遲時(shí)間 60 秒即可；但當(dāng)內(nèi)源性酮酸增多（如酮癥酸中毒）時(shí)，試劑內(nèi)LDH 常常不能在 60 秒內(nèi)完全將其清除，剩余酮酸會(huì)進(jìn)入監(jiān)測期干擾測定，使測定結(jié)果偏高，所以 延遲時(shí)間應(yīng)增至 90-120 秒。采用雙試劑，則可在加入 R1 后即進(jìn)入預(yù)孵育期。（3） 方法學(xué)要求：比如肌酐（Jaffe氏法）測定的特異性不強(qiáng)，一般認(rèn)為反

39、應(yīng)前20秒 左右為乙酰乙酸等快反應(yīng)干擾物呈色，后約 80- 100 秒為蛋白質(zhì)等慢反應(yīng)假肌酐呈色， 2060 秒肌酐呈色反應(yīng)占主導(dǎo)地位。采用兩點(diǎn)法或速率法可減少干擾，但具體取多長的延遲 時(shí)間，應(yīng)根據(jù)試劑和儀器讀數(shù)特點(diǎn)來評價(jià)決定。3工作程序要在保證準(zhǔn)確性的前提下，合理設(shè)置參數(shù)，提高工作效率。最突出的例子 是半自動(dòng)生化儀上酶活性連續(xù)監(jiān)測法的延遲時(shí)間設(shè)定。 由于只能單份樣品逐一測定， 若延遲 時(shí)間全部設(shè)置在儀器內(nèi)， 每個(gè)延遲時(shí)間加監(jiān)測時(shí)間至少 1 分鐘以上， 守候時(shí)間較長。 工作量 大時(shí)，可以根據(jù)儀器控溫、加樣及讀數(shù)和試劑特點(diǎn)以及室溫情況，將延 遲時(shí)間挪一部分到機(jī)外，套式操作，但要確保機(jī)內(nèi)延遲時(shí)間未

40、需進(jìn)入線性反應(yīng)期。4要兼顧延遲時(shí)間和監(jiān)測時(shí)間 反應(yīng)時(shí)間是有限制的。在速率法和兩點(diǎn)法中，延長延遲時(shí)間必然縮短線性監(jiān)測期，減 小測定的線性范圍，也易發(fā)生底物耗盡。（三）樣品量、試劑量與稀釋量 有關(guān)參數(shù)包括樣品量、試劑量、稀釋（水）量、最小反應(yīng)體積和最大比色杯容量等。如HITACHI 7170反應(yīng)體積180 380 M，最大體積 570山。 BT224半自動(dòng)生化儀流動(dòng)比色 池容積33/，吸液量200 990 pl，最適體積500 d。1 最小反應(yīng)體積在儀器光度讀數(shù)要用于結(jié)果計(jì)算時(shí)， 反應(yīng)液液面高度不低于光度計(jì)光徑的最小體積。 它 保證儀器的正確讀數(shù)和計(jì)算， 也是儀器測定精度和經(jīng)濟(jì)性的指針之一。 在有

41、的儀器中， 它以 反應(yīng)體積的下限表示， 有的則專門標(biāo)明最小反應(yīng)體積。 在單試劑測定中， 樣品與試劑的總體 積不得少于此參數(shù)。在雙試劑測定中，若 R1 與樣品的反應(yīng)讀數(shù)不納入結(jié)果計(jì)算， R1 的加 液量可不考慮此參數(shù)， 如連續(xù)監(jiān)測法； 否則應(yīng)考慮它對結(jié)果的影響， 如終點(diǎn)法在加 R2 之前 讀數(shù)， 并以此來扣除試劑或樣品空白時(shí)。 在半自動(dòng)生化儀中， 最適吸入量相當(dāng)于最小反應(yīng)體 積。它與進(jìn)液管道長度、 流動(dòng)比色池容積、吸液泵抽吸力大小和液體粘稠度有關(guān)，它要保證光度檢測不受空泡和前后樣品攜帶污染的干擾。 因此， 吸入體積不能任意降低， 必要時(shí)應(yīng)加 大反應(yīng)液量和吸入量。2最大比色杯容量這個(gè)參數(shù)含義明確。

42、在有的儀器中，它以反應(yīng)體積的上限表示，有的則專門標(biāo)明最大 比色杯容量。反應(yīng)液超過此體積，將致液體外溢，儀器測定系統(tǒng)被污損。3樣品試劑比例樣品與試劑的比例（SV: RV）,也可表示為樣品體積分?jǐn)?shù) -樣品體積與反應(yīng)液總體積的 比值（SV / TV ）,是方法學(xué)基本參數(shù)。酶活力測定中，樣品在總體積中的比例應(yīng)在10%以下。一般說來， 待測物質(zhì)在樣品中含量低的、 生理波動(dòng)范圍大的， 樣品用量較大。 如 Trinder 反應(yīng)測定血清葡萄糖、膽固醇等，樣品試劑比例多為 1: 100，測定血尿酸或高密度脂蛋白 膽固醇，常增加為 1: 5 0；ALT 和 AST 的樣品試劑比例多為 1: 10 至 1: 20。方法靈敏、 吸光度高的實(shí)驗(yàn)方法，樣品試劑比例小，如白蛋白BCG 法，樣品試劑比例常為 1: 200。肌酐 Jaffe 氏法監(jiān)測時(shí)