細(xì)菌實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)與質(zhì)量控制

1、 第六章 細(xì)菌實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)與質(zhì)量控制一、 教學(xué)大綱要求1、 掌握臨床常見(jiàn)標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)程序和方法2、 掌握細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的形態(tài)學(xué)檢查方法3、 掌握細(xì)菌的別離培養(yǎng)技術(shù)和方法4、 掌握細(xì)菌代謝產(chǎn)物檢測(cè)與鑒定技術(shù)5、 掌握細(xì)菌檢驗(yàn)的質(zhì)量控制6、 了解細(xì)菌感染的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)、細(xì)菌感染免疫學(xué)檢測(cè)、細(xì)菌毒素的檢測(cè)、細(xì)菌自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)。二、 教材內(nèi)容精要一標(biāo)本采集、處理與檢測(cè)標(biāo)本采集的根本原那么：盡早采集、根據(jù)可疑的病原體，選擇不同采集時(shí)機(jī)和標(biāo)本種類、在抗生素應(yīng)用前采集、遵守?zé)o菌操作、正確保存和運(yùn)送。容器應(yīng)密封不易碎，標(biāo)本不得污染容器的口和外壁。1.血液標(biāo)本 正常人的血液是無(wú)菌的。當(dāng)細(xì)菌侵入時(shí)可引起嚴(yán)重

2、的菌血癥或敗血癥。 一般情況下在患者發(fā)熱初期或發(fā)熱頂峰時(shí)采集；持續(xù)性菌血癥可隨時(shí)采集；間歇性菌血癥，應(yīng)預(yù)測(cè)其體溫上升期進(jìn)行采血。一般在使用抗生素前采集23次；多部位采集，如兩側(cè)肘靜脈或動(dòng)、靜脈同時(shí)采??；對(duì)于已使用抗生素而無(wú)法停止的患者，也應(yīng)在下次用藥前采取。在感染局部的附近血管中采血，可提高陽(yáng)性率。采血量成人一般510ml，嬰幼兒12ml。采集的血液標(biāo)本注入培養(yǎng)瓶中先進(jìn)行增菌培養(yǎng)，培養(yǎng)基和血液標(biāo)本量的比例應(yīng)>10：1，將血液中的各類殺抑菌物質(zhì)充分稀釋。需氧菌常用培養(yǎng)基有胰酪蛋白大豆胨肉湯和葡萄糖酚紅肉湯等，常參加對(duì)氨基苯甲酸PABA50g/ml中和磺胺類，青霉素酶2單位/ml破壞青霉素類

3、，硫酸鎂中和鏈霉素、四環(huán)素、土霉素、金霉素、新霉素及多粘菌素等抗生素。參加0.030.05%的聚茴香磺酸鈉sodium polyanethol sulfonate, SPS可抑制血清中的抗菌物質(zhì)，并對(duì)氨基糖苷類和多肽類抗生素有滅活效果。并參加、因子等生長(zhǎng)因子。培養(yǎng)瓶每天觀察一次。如發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)液體渾濁；血球?qū)由厦娉霈F(xiàn)顆粒狀的生長(zhǎng)物，并且有自下而上的溶血；有明顯的凝塊；液體外表有菌膜，培養(yǎng)液清晰或渾濁等，說(shuō)明有細(xì)菌生長(zhǎng)。直接進(jìn)行涂片染色初步報(bào)告。同時(shí)分別接種血平板、巧克力色平板，普通培養(yǎng)和5%CO2 35培養(yǎng)。也可直接進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)。無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)跡象的培養(yǎng)瓶孵育至第7d，接種血平板、巧克力色平板

4、，分別進(jìn)行普通培養(yǎng)和5%CO2環(huán)境35孵育24h。為了提高檢出的速度，在培養(yǎng)的第23d時(shí)應(yīng)移種一次。有厭氧菌感染時(shí)，同時(shí)注入需氧瓶和厭氧瓶，厭氧培養(yǎng)基通常用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、牛心腦浸液肉湯等；培養(yǎng)液中有刃天青，無(wú)氧時(shí)無(wú)色，有氧時(shí)呈紅色。需氧瓶和厭氧瓶同時(shí)渾濁，或需氧瓶無(wú)生長(zhǎng)而厭氧瓶液體渾濁，提示厭氧菌生長(zhǎng)。分別接種血平板和厭氧血平板，置需氧和厭氧環(huán)境中，如果都只生長(zhǎng)1種細(xì)菌，那么為兼性厭氧菌；如果僅在厭氧環(huán)境中生長(zhǎng)，可以直接報(bào)告“有厭氧菌檢出。假設(shè)長(zhǎng)期應(yīng)用抗細(xì)胞壁類抗生素，應(yīng)考慮細(xì)菌L型存在，將血液接種高滲培養(yǎng)基中，分別進(jìn)行需氧、厭氧和5%CO2環(huán)境培養(yǎng)。每周移種23次于高滲固體培養(yǎng)基上，觀察

5、有無(wú)細(xì)菌L型菌落生長(zhǎng)。2.呼吸道標(biāo)本正常上呼吸道有正常菌群。下呼吸道正常情況下無(wú)細(xì)菌或僅有少量細(xì)菌侵入咽拭子直接涂片檢查 疑心白喉的標(biāo)本，應(yīng)立即進(jìn)行涂片革蘭染色和異染顆粒染色。如發(fā)現(xiàn)有呈Y、V、T等排列的棒狀桿菌，有異染顆粒時(shí)可報(bào)告“找到有異染顆粒的革蘭陽(yáng)性桿菌。也可用特異性的熒光染色法檢查A群溶血性鏈球菌和百日咳鮑特菌。培養(yǎng)檢查 接種血平板，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。有無(wú)特別的菌落生長(zhǎng)，如為上呼吸道的正常菌群，比例大致正常，那么報(bào)告“未檢出致病菌；如果某一種菌群明顯占多數(shù)或接近純培養(yǎng)，應(yīng)考慮該菌與疾病有關(guān)，鑒定后報(bào)告。呼吸道標(biāo)本特殊菌的培養(yǎng) 百日咳鮑特菌接種在鮑-金B(yǎng)order-Gengou平板；

6、白喉棒狀桿菌接種呂氏血清斜面或雞蛋培養(yǎng)基，同時(shí)接種亞碲酸鉀血平板；腦膜炎奈瑟菌帶菌者的鼻咽拭子35保溫運(yùn)送，盡快接種在35預(yù)溫的卵黃雙抗平板上，置35%CO2環(huán)境中35孵育24h。流感嗜血桿菌用巧克力平板或選擇性平板?；撔訟群鏈球菌的接種血平板，在接種原始區(qū)貼一張0.04U的桿菌肽紙片作為A群鏈球菌存在的指示。痰液標(biāo)本，采集晨痰為好。觀察標(biāo)本的性狀，選取膿血性的局部，如發(fā)現(xiàn)有顆粒、菌塊及干酪樣物，可能是放線菌或真菌感染。有異常惡臭，與厭氧菌有關(guān)。直接涂片染色檢查發(fā)現(xiàn)，以柱狀上皮細(xì)胞為主，有中性白細(xì)胞及細(xì)菌，那么可根據(jù)形態(tài)和染色性直接報(bào)告，并且作為別離細(xì)菌時(shí)選擇培養(yǎng)基的依據(jù)。如果以鱗狀上皮細(xì)胞

7、為主，很少發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞，那么為不合格標(biāo)本。如有顆粒、菌塊及干酪樣物也應(yīng)進(jìn)行涂片檢查，發(fā)現(xiàn)具有典型的真菌或放線菌樣的菌落特點(diǎn)，可直接報(bào)告“找到真菌放線菌。痰液標(biāo)本在別離接種前一般進(jìn)行前處理，方法有均質(zhì)化和洗凈法。痰液標(biāo)本至少同時(shí)接種血平板、巧克力平板和EMB或Mac Conkey平板。3.尿液標(biāo)本正常人的尿液是無(wú)菌的，女性月經(jīng)期間容易污染，不宜采集。尿液的采集方法有：中段尿采集法、腎盂尿采集法、膀胱穿刺法，膀胱穿刺法一般用于厭氧菌培養(yǎng)的標(biāo)本采集或不能正確留取中段尿而需確定診斷的兒童。尿液標(biāo)本檢驗(yàn) 采用定量培養(yǎng)的方法進(jìn)行尿液菌落計(jì)數(shù)區(qū)別污染和病原菌。一般認(rèn)為尿液中的菌落數(shù)>105/ml為病原菌

8、，<104/ml為污染菌，<105/ml >104/ml為可疑需重新復(fù)查，重新復(fù)查后仍為同樣結(jié)果，那么應(yīng)視為病原菌。會(huì)受到尿量、尿液在膀胱中停留的時(shí)間長(zhǎng)短及使用利尿劑等影響。計(jì)數(shù)的方法有：平板涂布法、傾注培養(yǎng)法和標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)法。一般接種血平板和EMB或Mac Conkey平板，或CLED平板。尿液細(xì)菌L型較為常見(jiàn)，可同時(shí)接種L型平板。尿液標(biāo)本的快速檢驗(yàn) 用于尿液快速細(xì)菌檢驗(yàn)的方法有硝酸鹽復(fù)原法、氯化三苯四氮唑TTC復(fù)原法、尿中抗體包被細(xì)菌法和產(chǎn)色培養(yǎng)基法等。4.腦脊液標(biāo)本正常人的腦脊液是無(wú)菌的。腦脊液標(biāo)本的采集 以無(wú)菌手續(xù)通過(guò)腰椎穿刺采集腦脊液35ml，應(yīng)立即送檢或床邊接種。應(yīng)

9、在35保溫運(yùn)送。直接涂片檢查 由細(xì)菌引起的化膿性腦膜炎一般呈現(xiàn)混濁，在抗生素治療后亦可不混濁。此外結(jié)核性腦膜炎、無(wú)菌性腦膜炎等也不混濁?？芍苯油科锾m染色檢查，不混濁的可3000r/min離心1015min后取沉淀涂片染色檢查。如發(fā)現(xiàn)革蘭陰性、凹面相對(duì)的雙球菌，位于中性白細(xì)胞內(nèi)外，那么可報(bào)告“找到革蘭陰性雙球菌，位于細(xì)胞內(nèi)外，疑似腦膜炎奈瑟菌；有革蘭陽(yáng)性矛頭狀的雙球菌，菌體周圍有明顯的莢膜，可報(bào)告“找到革蘭陽(yáng)性雙球菌，疑似肺炎鏈球菌。用肺炎鏈球菌全價(jià)抗血清進(jìn)行莢膜腫脹試驗(yàn)，陽(yáng)性者可報(bào)告“莢膜腫脹試驗(yàn)檢出肺炎鏈球菌；發(fā)現(xiàn)其他形態(tài)的細(xì)菌，可根據(jù)形態(tài)和染色性進(jìn)行報(bào)告。涂片陽(yáng)性的標(biāo)本最好進(jìn)行標(biāo)本的直接

10、藥敏試驗(yàn)。應(yīng)立即接種在35預(yù)保溫的血平板和巧克力平板上,置510%CO2環(huán)境35培養(yǎng)1824h。腦脊液標(biāo)本一般經(jīng)3d培養(yǎng)仍未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，可報(bào)告“經(jīng)3天培養(yǎng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。腦脊液標(biāo)本特殊病原菌的檢驗(yàn)結(jié)核分枝桿菌 將腦脊液4000r/min離心30min，取沉淀抗酸染色；或?qū)⒛X脊液在室溫下靜置1824h，待形成纖維網(wǎng)后，傾倒在潔凈玻片上抗酸染色。或用金胺“O進(jìn)行熒光染色觀察。取沉淀接種羅-瓊培養(yǎng)基進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)。新型隱球菌 將腦脊液離心沉淀后，進(jìn)行墨汁負(fù)染，可在黑色背景中觀察到折光性很強(qiáng)的菌體和周圍似暈輪樣的透明莢膜，有時(shí)可見(jiàn)到生芽的新型隱球菌。5.糞便標(biāo)本的采集 糞便標(biāo)本于急性腹瀉期及未使用

11、抗生素之前采取自然排出的糞便，挑選粘液、膿血局部，置無(wú)菌容器、保存液或增菌培養(yǎng)基中?？捎酶亻T(mén)拭子。不能立即送檢的標(biāo)本應(yīng)放入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中。1直接涂片檢查 臨床疑心是霍亂弧菌、結(jié)核分枝桿菌感染或菌群失調(diào)需要大致估計(jì)菌群比例、二重感染偽膜性腸炎、真菌性或葡萄球菌性腸炎時(shí)進(jìn)行直接涂片染色檢查。霍亂弧菌的涂片檢查 取“米泔水樣糞便或肛門(mén)拭子涂片2張，枯燥后用乙醇或甲醇固定，分別進(jìn)行革蘭染色和1：10稀釋石炭酸復(fù)紅染色，用油鏡觀察有無(wú)革蘭陰性、魚(yú)群樣排列的弧菌。另外也可進(jìn)行懸滴法動(dòng)力試驗(yàn)和制動(dòng)試驗(yàn)。菌群失調(diào)及菌交替癥 取糞便標(biāo)本直接涂片，進(jìn)行革蘭染色油鏡觀察，根據(jù)菌群的形態(tài)和染色特征可

12、大致描述菌群的情況。疑為偽膜性腸炎的患者標(biāo)本中如發(fā)現(xiàn)大量革蘭陽(yáng)性呈葡萄狀排列的球菌，那么可報(bào)告“找到革蘭陽(yáng)性呈葡萄狀排列的球菌；如發(fā)現(xiàn)革蘭陽(yáng)性粗大桿菌、無(wú)莢膜，通常有位于菌體一端的卵圓形芽胞者，可報(bào)告“找到革蘭陽(yáng)性芽胞桿菌，疑似艱難梭菌。結(jié)核分枝桿菌 取半個(gè)指甲大小糞便塊，與飽和鹽水1015ml攪和，靜置，12h后取最上層液體作涂片，進(jìn)行抗酸染色檢查。2別離培養(yǎng)沙門(mén)菌屬和志賀菌屬 直接接種腸道強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基SS瓊脂、木糖賴氨酸去氧膽酸鈉瓊脂和弱選擇性培養(yǎng)基如Mac Conkey、EMB、中國(guó)藍(lán)瓊脂各1個(gè)；攜帶者的檢查，可將糞便標(biāo)本接種于GN增菌液適用于沙門(mén)菌屬和志賀菌屬和亞硒酸鹽或四硫磺酸鹽增

13、菌液適用于沙門(mén)菌屬增菌后轉(zhuǎn)種于腸道強(qiáng)和弱選擇性培養(yǎng)基上觀察菌落特征?；魜y弧菌 可疑標(biāo)本接種于堿性蛋白胨水中進(jìn)行35增菌，同時(shí)接種含糖雙洗平板、慶大霉素瓊脂平板或TCBS瓊脂平板。增菌培養(yǎng)6h后，取增菌液表層菌膜移種于上述平板中進(jìn)行別離培養(yǎng)，同時(shí)取增菌液作革蘭涂片染色和懸滴法動(dòng)力試驗(yàn)和制動(dòng)試驗(yàn)。副溶血性弧菌 取可疑糞便或可疑食物接種于副溶血性弧菌增菌液中，同時(shí)劃線接種于副溶血性弧菌選擇性平板和SS平板上。腸致病性大腸埃希菌 取可疑糞便標(biāo)本接種在中國(guó)藍(lán)平板或Mac Conkey平板或EMB平板。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 將可疑標(biāo)本接種于新耶爾森菌選擇培養(yǎng)基NYE、Mac Conkey及SS瓊脂平板。帶菌

14、者可將標(biāo)本接種于1/15mol/LpH7.47.8的PBS中，在4進(jìn)行冷增菌。空腸彎曲菌 取可疑糞便或在Cary-Bair運(yùn)送培養(yǎng)基中的糞便標(biāo)本接種于Camp-BAP血瓊脂或Skirrow血瓊脂，或接種于CEM增菌液在微需氧環(huán)境下培養(yǎng)1824小時(shí)后接種上述平板，在微需氧環(huán)境下培養(yǎng)4248h。菌群失調(diào)及菌交替癥 要對(duì)糞便中的所有菌群進(jìn)行觀察，將糞便定量接種在腸道選擇性培養(yǎng)基、需氧和厭氧血平板，甘露醇鹽瓊脂，沙保弱培養(yǎng)基等，觀察各菌群的生長(zhǎng)情況，進(jìn)行鑒定后報(bào)告各菌群比例。疑心艱難梭菌的菌交替癥時(shí)，如為黃色、夾有偽膜的糞便應(yīng)立即接種CCFA平板，進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。如為綠色、海水樣糞便，應(yīng)疑心為金黃色葡萄

15、球菌感染，接種甘露醇鹽瓊脂，有黃色菌落按葡萄球菌鑒定。如為真菌性腹瀉，常發(fā)生在抗生素使用之后，將標(biāo)本接種在沙保弱培養(yǎng)基及血平板上，進(jìn)行鑒定。6.生殖道標(biāo)本男性尿道、生殖器分泌物 用無(wú)菌棉簽將膿液采集在無(wú)菌試管中。由臨床醫(yī)師從肛門(mén)進(jìn)行前列腺按摩，收集前列腺液。女性生殖道標(biāo)本 直視采集陰道后穹隆分泌物。盆腔膿腫的患者應(yīng)消毒陰道后從后穹隆穿刺抽取膿液。子宮分泌物的采集采用雙套管的方式插入子宮腔吸取分泌物。外陰分泌物 對(duì)外陰部位的硬下疳,從其潰瘍底部擠出少許組織液，以潔凈玻片直接沾取，加蓋玻片后送檢。涂片檢查 對(duì)一般細(xì)菌和淋球菌的檢查用革蘭染色；梅毒螺旋體用暗視野顯微鏡或鍍銀染色法檢查；結(jié)核分枝桿菌進(jìn)

16、行抗酸染色。培養(yǎng)檢查 一般細(xì)菌培養(yǎng)用血平板和Mac Conkey平板各一個(gè)；培養(yǎng)淋病奈瑟菌需要巧克力平板或卵黃雙抗平板.7.膿液、胸腹水及分泌物等其它標(biāo)本封閉性膿腫直接穿刺；疑為厭氧菌感染者，應(yīng)立即將注射器內(nèi)的空氣排空，將針頭插入橡皮塞中隔絕空氣；開(kāi)放性膿腫或瘺管從深部采取標(biāo)本。標(biāo)本直接涂片革蘭染色發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可以直接報(bào)告，然后用血平板接種培養(yǎng)。胸、腹水通過(guò)胸腔或腹腔穿刺獲得，注入無(wú)菌試管中送檢。二細(xì)菌形態(tài)檢查顯微鏡是觀察細(xì)菌形態(tài)的必備儀器。分為光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡。光學(xué)顯微鏡有普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡等。1.不染色可以觀察細(xì)菌的動(dòng)力及運(yùn)動(dòng)等活體狀況，由于細(xì)菌的折光性

17、不強(qiáng)，不能清楚的看到細(xì)菌的形態(tài)特征和結(jié)構(gòu)。標(biāo)本的制作懸滴法、壓滴法和毛細(xì)管法，后者主要用于厭氧菌的動(dòng)力觀察。用普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡或位相差顯微鏡觀察。2.染色標(biāo)本的形態(tài)檢查細(xì)菌的染色可能是由于毛細(xì)管現(xiàn)象和染料的滲透作用、染料的溶解和吸收作用使染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，或由于電荷的吸附和結(jié)合使細(xì)菌著色。也可能與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成分有關(guān)。此外細(xì)菌的染色性與細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，以及培養(yǎng)基的種類、菌齡，染色液的離子強(qiáng)度、pH，染色溫度等密切相關(guān)。醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中常用的染料：酸性染料 細(xì)菌一般情況下都帶負(fù)電荷，故酸性染料一般不著色。如剛果紅、伊紅等。堿性染料 細(xì)菌一般情況下都帶負(fù)電荷，因此能與

18、細(xì)菌結(jié)合，細(xì)菌學(xué)檢查中常用此類染料。如美藍(lán)、結(jié)晶紫和堿性復(fù)紅等。復(fù)合染料 如姬姆薩染料，是堿性和酸性染料的復(fù)合物。單純?nèi)玖?如蘇丹類染料，溶于脂肪溶劑中，不溶于水，化學(xué)親和力低。3.染色方法應(yīng)先制作細(xì)菌涂片。方法有單染色法和復(fù)合染色法。1革蘭染色法 染液由革蘭結(jié)晶紫染液、革蘭碘液、95%酒精和稀釋石炭酸復(fù)紅沙黃組成。革蘭陽(yáng)性菌為紫色，革蘭陰性菌呈紅色。影響因素：涂片過(guò)厚將使脫色不完全，酒精脫色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)將導(dǎo)致過(guò)度脫色；染液儲(chǔ)存過(guò)久由于蒸發(fā)而影響濃度，特別是碘液久存或見(jiàn)光而形成碘酸，失去媒染作用；95%酒精如果密封不佳易揮發(fā)，失去脫色作用；細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌形態(tài)最為典型，菌齡過(guò)長(zhǎng)易致

19、陰性。2抗酸染色法 染液由石炭酸復(fù)紅、3%鹽酸酒精和美藍(lán)組成?？顾峋始t色，非抗酸菌和細(xì)胞呈藍(lán)色。本法主要用于結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌的檢查，每張載玻片上只能涂1份標(biāo)本，最好使用新玻片，否那么必須徹底清洗干凈。染色使不得使用染色缸，吸水紙1片1張不得重復(fù)使用。脫色時(shí)間不得過(guò)短。為了防止實(shí)驗(yàn)室感染可將標(biāo)本先進(jìn)行高壓蒸氣滅菌，然后進(jìn)行抗酸染色。三、細(xì)菌的接種與別離培養(yǎng)（一） 培養(yǎng)基培養(yǎng)基是供細(xì)菌生長(zhǎng)用的，由人工方法將多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)根據(jù)各種細(xì)菌的需要而組合成的混合營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基的根本成分有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、凝固物質(zhì)、抑制劑和指示劑。常用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有：蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、各種糖類、血液、無(wú)機(jī)鹽、雞蛋和動(dòng)

20、物血清、生長(zhǎng)因子等。最常用凝固物質(zhì)為瓊脂100ml培養(yǎng)基中參加22.5g瓊脂可制成固體培養(yǎng)基；100ml培養(yǎng)基中參加0.30.5g瓊脂可制成半固體培養(yǎng)基。有時(shí)也使用明膠、卵白蛋白、血清等作為賦形劑。常用的抑制劑有膽鹽、煌綠、玫瑰紅酸、亞硫酸鈉、亞硒酸鈉、一些染料和某些抗生素。培養(yǎng)基中參加的指示劑有酚紅、中性紅、甲基紅、酸性復(fù)紅、溴甲酚紫、溴麝香草酚藍(lán)等酸堿指示劑和美藍(lán)作為氧氣指示劑。根據(jù)其形狀分為固體、液體和半固體培養(yǎng)基；按用途可分為根底培養(yǎng)基、增菌培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基等；按成分可分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。二細(xì)菌的培養(yǎng)方法普通培養(yǎng)法 普通培養(yǎng)法是指需氧菌或兼性厭氧菌等在

21、普通大氣條件下的培養(yǎng)方法，又稱需氧培養(yǎng)法。假設(shè)用明膠培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌，應(yīng)22培養(yǎng)。二氧化碳培養(yǎng)法 某些細(xì)菌，如腦膜炎奈瑟菌、布魯菌等在初別離時(shí)，需在510二氧化碳環(huán)境中才能良好生長(zhǎng)。二氧化碳培養(yǎng)方法有以下幾種：二氧化碳培養(yǎng)箱、燭缸法、化學(xué)法。厭氧培養(yǎng)法 常用方法有厭氧罐法、氣袋法和厭氧手套箱等。大多數(shù)厭氧菌的初代培養(yǎng)生長(zhǎng)較慢，故厭氧培養(yǎng)在37至少應(yīng)培養(yǎng)48h。如疑為放線菌那么應(yīng)延長(zhǎng)7296h。四、細(xì)菌代謝產(chǎn)物檢測(cè)與鑒定一碳水化合物的代謝試驗(yàn)1.糖醇、苷類發(fā)酵試驗(yàn) 兼性厭氧菌和厭氧菌一般能發(fā)酵糖類。各種細(xì)菌含有不同糖醇、苷類的發(fā)酵酶。不同細(xì)菌分解糖類后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物因菌種而異。因此測(cè)定細(xì)菌對(duì)糖類的

22、分解能力和產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可以鑒別細(xì)菌。接種入的細(xì)菌假設(shè)能分解培養(yǎng)基中的糖類產(chǎn)酸時(shí)，那么使指示劑呈酸性反響。假設(shè)產(chǎn)氣可使液體培養(yǎng)基中的倒管Durham管內(nèi)出現(xiàn)氣泡，或使半固體培養(yǎng)基內(nèi)出現(xiàn)氣泡、裂開(kāi)等現(xiàn)象。假設(shè)不分解那么無(wú)變化。不同細(xì)菌可發(fā)酵不同的糖類，如大腸埃希菌可發(fā)酵葡萄糖及乳糖。沙門(mén)菌屬那么只發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵乳糖；大腸埃希菌和志賀菌屬均可發(fā)酵葡萄糖，但前者產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，而后者僅產(chǎn)酸。2.氧化一發(fā)酵試驗(yàn)O-F試驗(yàn)又稱HughLeifsonHL試驗(yàn)。細(xì)菌在分解葡萄糖的過(guò)程中，必須以分子氧作為電子受體的，稱為氧化型。細(xì)菌在分解葡萄糖的過(guò)程中，可以進(jìn)行無(wú)氧降解的，稱為發(fā)酵型，此類細(xì)菌無(wú)論在有氧或無(wú)氧

23、的環(huán)境中都能分解葡萄糖，通常為兼性厭氧菌。不分解葡萄糖的細(xì)菌，稱為產(chǎn)鹼型。挑取少許純種細(xì)菌，同時(shí)穿刺接種兩支HughLeifson培養(yǎng)基，其中1支在接種后，滴加高度不少于1cm的無(wú)菌液體石臘于培養(yǎng)基上進(jìn)行封蓋。于35C培養(yǎng)48h以上，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基變黃表示細(xì)菌分解葡萄糖而產(chǎn)酸，顏色不變?yōu)椴环纸馄咸烟?。假設(shè)兩支培養(yǎng)基均為黃色為發(fā)酵型；均不變?yōu)楫a(chǎn)鹼型或不分解糖型；僅不加液體石臘的培養(yǎng)基管內(nèi)變黃為氧化型。用于細(xì)菌種屬間的鑒別。腸桿菌科細(xì)菌為發(fā)酵型，非發(fā)酵菌通常為氧化型或產(chǎn)鹼型。此外微球菌屬可氧化葡萄糖，而葡萄球菌屬那么能發(fā)酵葡萄糖。3.-半乳糖苷酶試驗(yàn)ONPG試驗(yàn)細(xì)菌分解乳糖必須有半乳糖苷滲透酶g

24、alact osidepermease和-半乳糖苷酶的參加。前者可將乳糖通過(guò)細(xì)胞壁送到細(xì)胞內(nèi)。后者存在于細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)，將進(jìn)入菌細(xì)胞的乳糖分解為葡萄糖和半乳糖。具有上述兩種酶的細(xì)菌可迅速分解乳糖。緩慢分解乳糖的細(xì)菌只有-半乳糖苷酶，缺乏半乳糖苷滲透酶，或是其活性很弱，不能很快將乳糖運(yùn)送到菌細(xì)胞內(nèi)，所以通常需要幾天時(shí)間乳糖才被分解。ONPG與乳糖的分子結(jié)構(gòu)相似，且分子較小，不需半乳糖苷滲透酶的運(yùn)送就可進(jìn)入菌細(xì)胞內(nèi)，由菌細(xì)胞內(nèi)的-半乳糖苷酶將其分解為半乳糖和黃色的鄰位-硝基酚。采用ONPG試驗(yàn)，可將緩慢分解乳糖的細(xì)菌迅速取得陽(yáng)性結(jié)果。無(wú)色的ONPG經(jīng)-半乳糖苷酶水解后生成黃色的鄰位-硝基酚。迅速及緩

25、慢分解乳糖的細(xì)菌如埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬等陽(yáng)性。而不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌如沙門(mén)菌、變形桿菌等均為陰性。4.七葉苷水解試驗(yàn) 某些細(xì)菌能水解七葉苷生成七葉素與培養(yǎng)基中枸櫞酸鐵的亞鐵離子起反響，生成黑色的化合物。將被檢菌接于七葉苷培養(yǎng)基上35孵育1824h。使培養(yǎng)基變黑為陽(yáng)性?？死撞鷮?、腸桿菌屬和沙雷菌屬能水解七葉苷，腸球菌屬和D群鏈球菌也能水解七葉苷，并耐受膽汁。5.淀粉水解試驗(yàn) 細(xì)菌如產(chǎn)生淀粉酶，可將培養(yǎng)基中的淀粉分解為糖類，滴加碘液在培養(yǎng)基上，在菌落周圍透明區(qū)。將被檢菌劃線接種或點(diǎn)種淀粉血清瓊脂平板，35培養(yǎng)24h，在培養(yǎng)基上滴加革蘭碘液，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基呈藍(lán)色，菌落周圍有透明圈為陽(yáng)性

26、。白喉棒狀桿菌可產(chǎn)生淀粉酶，分解淀粉。6.甲基紅MR試驗(yàn) 細(xì)菌在代謝過(guò)程中分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，某些細(xì)菌可進(jìn)一步將丙酮酸分解為乳酸、乙酸、甲酸等，使培養(yǎng)基的pH下降至4.5以下，參加甲基紅指示劑出現(xiàn)紅色陽(yáng)性。有些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)如醇、酮、醛、氣體和水，那么培養(yǎng)基的酸堿度維持在pH6.2以上，參加甲基紅指示劑呈黃色陰性。將被檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)，于35培養(yǎng)24d，參加甲基紅指示劑2滴，立即觀察結(jié)果。紅色為陽(yáng)性；桔紅色為弱陽(yáng)性；黃色為陰性。主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別，前者為陽(yáng)性，后者為陰性。此外沙門(mén)菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌、變形桿菌等為

27、陽(yáng)性，腸桿菌屬、克雷伯菌等為陰性。7.V-P試驗(yàn) 細(xì)菌在葡萄糖的代謝過(guò)程中生成丙酮酸，有些細(xì)菌可將丙酮酸進(jìn)一步脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣中的氧氧化為二乙酰丁二酮，進(jìn)而與培養(yǎng)基中的精氨酸所含的胍基發(fā)生反響，生成紅色化合物，即VP反響陽(yáng)性。將被檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基后，參加5%-萘酚0.6ml，再參加40%KOH0.2ml，振搖后觀察結(jié)果。于數(shù)分鐘內(nèi)呈紅色為陽(yáng)性，如無(wú)紅色出現(xiàn)，而且于35中4h仍無(wú)紅色者為陰性。本試驗(yàn)常與甲基紅試驗(yàn)一起使用。前者為陽(yáng)性的細(xì)菌，后者為陰性，反之亦如此。如大腸埃希菌、沙門(mén)菌屬、志賀菌屬等甲基紅呈陽(yáng)性反響，V-P反響那么陰性。相反，如沙雷

28、菌、陰溝腸桿菌等，VP反響陽(yáng)性，而甲基紅反響陰性。8.葡萄糖酸氧化試驗(yàn) 某些細(xì)菌可氧化葡萄糖酸鉀，生成2-酮基葡萄糖酸。2-酮基葡萄糖酸是一種復(fù)原性物質(zhì)，可與班氏試劑起反響，出現(xiàn)棕色或磚紅色的Cu2O沉淀。接種細(xì)菌至改進(jìn)Haynes培養(yǎng)基中，48h后取培養(yǎng)液1ml，參加班氏定性試劑1ml，于水浴中煮沸10min并迅速冷卻。觀察結(jié)果。出現(xiàn)黃到磚紅色沉淀為陽(yáng)性。不變或仍為藍(lán)色為陰性。主要用于假單胞菌的鑒定。(二)、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)1.苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn) 某些細(xì)菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸和游離的氨，參加三氯化鐵試劑與苯丙酮酸螯合后產(chǎn)生綠色反響。大量接種被檢菌于苯

29、丙氨酸瓊脂斜面上，35培養(yǎng)1824h，參加10%三氯化鐵試劑出現(xiàn)綠色為陽(yáng)性。主要用于鑒定變形桿菌屬、摩根菌屬和普羅威登菌屬細(xì)菌，均為強(qiáng)陽(yáng)性，腸桿菌科中其它細(xì)菌均為陰性。2.氨基酸脫羧酶試驗(yàn) 細(xì)菌分解氨基酸使其脫羧基，生成胺和CO2。各種細(xì)菌的產(chǎn)生的脫羧酶種類不一樣，但氨基酸經(jīng)脫羧后所產(chǎn)生的胺，均可使培養(yǎng)基變堿。最常測(cè)定的氨基酸有三種：賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸和精氨酸。挑取待測(cè)菌分別接種三種氨基酸培養(yǎng)基及對(duì)照培養(yǎng)基，于35培養(yǎng)14d，每天檢查一次結(jié)果。氨基酸測(cè)定管由黃變?yōu)樽仙S色為陰性僅發(fā)酵葡萄糖。對(duì)照無(wú)氨基酸為黃色發(fā)酵葡萄糖。沙門(mén)菌屬中除傷寒和雞沙門(mén)菌之外，其余沙門(mén)菌屬的鳥(niǎo)氨酸和賴氨酸脫羧酶均陽(yáng)性。致

30、賀菌屬中除宋內(nèi)和鮑氏志賀菌外，其它志賀菌均陰性。對(duì)鏈球菌和弧菌科細(xì)菌的鑒定也有重要價(jià)值。3.精氨酸雙水解酶試驗(yàn) 精氨酸經(jīng)兩次水解，先生成瓜氨酸和氨，瓜氨酸又在瓜氨酸酶的作用下，形成鳥(niǎo)氨酸、氨及二氧化碳。鳥(niǎo)氨酸又在鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的作用下生成腐胺及二氧化碳。將被檢菌接種于脫羧酶培養(yǎng)基培養(yǎng)基，腸桿菌科應(yīng)覆蓋滅菌液體石蠟。假單胞菌通常采用Thornley氏培養(yǎng)基,不加石蠟。指示劑顏色轉(zhuǎn)為堿性為陽(yáng)性，即溴甲酚紫轉(zhuǎn)為紫色，酚紅轉(zhuǎn)為紅色。Thornley氏培養(yǎng)基通常陽(yáng)性在2448h后，最長(zhǎng)可觀察至7d。4.尿素酶試驗(yàn) 某些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶分解尿素，產(chǎn)生大量的氨使培養(yǎng)基變堿。將被檢菌接種于相應(yīng)的尿素培養(yǎng)基，于3

31、5培養(yǎng)1824h觀察結(jié)果。陰性時(shí)應(yīng)繼續(xù)觀察4d。細(xì)菌分解尿素后培養(yǎng)基變堿，使酚紅指示劑變紅為陽(yáng)性，不變?yōu)殛幮?。奇異變形桿菌和普通變形桿菌、雷極普羅威登菌和摩根摩根菌陽(yáng)性，斯氏和產(chǎn)堿普羅威登菌陰性。5.吲哚試驗(yàn) 細(xì)菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚與試劑中的對(duì)二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈紅色。挑取純培養(yǎng)物接種蛋白胨水培養(yǎng)基，于35培養(yǎng)12d，沿管壁徐徐參加Kovac氏試劑或歐氏試劑0.5ml，使成兩層，觀察結(jié)果。兩者液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，無(wú)色為陰性。主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。6.硫化氫試驗(yàn) 某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸如胱氨酸、半胱氨酸生成硫化氫，遇鉛或亞鐵離子生成黑色硫化物。

32、將培養(yǎng)物接種于醋酸鉛或克氏鐵瓊脂等培養(yǎng)基，經(jīng)35培養(yǎng)12d，觀察結(jié)果。醋酸鉛培養(yǎng)基變黑色為陽(yáng)性，不變?yōu)殛幮??？耸翔F瓊脂等培養(yǎng)基，復(fù)原含硫化合物而產(chǎn)生硫化氫，與二價(jià)鐵生成黑色的硫化亞鐵，陰性不產(chǎn)生黑色沉淀。腸桿菌科中沙門(mén)菌屬、愛(ài)德華菌屬、枸櫞酸桿菌屬和變形桿菌屬細(xì)菌，絕大多數(shù)硫化氫陽(yáng)性，其它菌屬陰性。此外，腐敗假單胞菌、口腔類桿菌和某些布魯菌硫化氫也陽(yáng)性。7.明膠液化試驗(yàn) 明膠酶是細(xì)菌產(chǎn)生的一種胞外酶，能分解明膠為氨基酸，從而失去凝固力，使半固體的明膠培養(yǎng)基成為流動(dòng)的液體。將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，于20培養(yǎng)7d，逐日觀察結(jié)果。如室溫高培養(yǎng)基自行溶化時(shí)，可于冰箱內(nèi)放置30min，不再凝固為陽(yáng)

33、性。沙雷菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、陰溝腸桿菌等可液化明膠，腸桿菌科其它細(xì)菌很少液化明膠。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、腐敗假單胞菌也能產(chǎn)生明膠酶。有些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等也能液化明膠。(三)、 碳源和氮源利用試驗(yàn)1.枸櫞酸鹽利用試驗(yàn) 當(dāng)細(xì)菌利用銨鹽作為唯一氮源，并能利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源時(shí)，可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)分解枸櫞酸鈉，使培養(yǎng)基變堿。在枸櫞酸鹽瓊脂斜面上濃密劃線，大量接種被檢菌，于35培養(yǎng)14d，逐日觀察結(jié)果。枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上有細(xì)菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)基變藍(lán)為陽(yáng)性；無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)、顏色不變綠色為陰性。埃希菌屬、志賀菌屬、愛(ài)德華菌屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門(mén)菌屬

34、、克雷伯菌屬、粘質(zhì)和液化沙雷菌及某些變形桿菌以及枸櫞酸桿菌陽(yáng)性。此外，銅綠假單胞菌、洋蔥假單胞菌和嗜水氣單胞菌也能利用枸櫞酸鹽。2.丙二酸鹽利用試驗(yàn) 細(xì)菌利用丙二酸鹽作為唯一碳源時(shí)，丙二酸鈉可被分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿。將被檢菌接種于丙二酸鹽培養(yǎng)基，于35培養(yǎng)2448h后觀察結(jié)果.培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色為陽(yáng)性，顏色無(wú)變化為陰性。3.醋酸鹽利用試驗(yàn) 細(xì)菌可利用銨鹽作為唯一碳源，同時(shí)利用醋酸鹽作為唯一碳源時(shí)，可在醋酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，同時(shí)生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。將被檢菌接種于醋酸鹽培養(yǎng)基的斜面上，于35培養(yǎng)7d，逐日觀察結(jié)果。斜面上生長(zhǎng)有菌落，培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色為陽(yáng)性。腸桿菌科中埃希菌屬為陽(yáng)性，

35、志賀菌屬為陰性。銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、洋蔥假單胞菌等也為陽(yáng)性。4.馬尿酸鹽水解試驗(yàn) B群鏈球菌具有馬尿酸水解酶，可使馬尿酸水解為苯甲酸和甘氨酸。苯甲酸與三氯化鐵試劑結(jié)合，形成苯甲酸鐵沉淀。甘氨酸在茚三酮強(qiáng)氧化劑的作用下，經(jīng)氧化脫氨基反響，生成氨、二氧化碳和相應(yīng)的醛，而茚三酮那么生成了復(fù)原型茚三酮。反響過(guò)程中形成的氨和復(fù)原型茚三酮，與殘留的茚三酮起反響，那么形成了紫色化合物。(四)、呼吸酶類試驗(yàn)1.氧化酶試驗(yàn) 氧化酶或稱細(xì)胞色素氧化酶，是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶。作氧化酶試驗(yàn)時(shí)，此酶首先使細(xì)胞色素C氧化，然后氧化型細(xì)胞色素C再使對(duì)苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反響。本試驗(yàn)?zāi)c桿菌科陰性，弧菌科、

36、非發(fā)酵菌陽(yáng)性除個(gè)別菌種外、奈瑟菌屬均陽(yáng)性。 2.過(guò)氧化氫酶試驗(yàn) 黃酶系統(tǒng)的呼吸酶最后把氫交給分子氧而形成過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫對(duì)活細(xì)胞有毒，過(guò)氧化氫酶的作用是使過(guò)氧化氫分解為分子態(tài)氧。于半分鐘內(nèi)大量氣泡產(chǎn)生者為陽(yáng)性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性。絕大多數(shù)細(xì)菌均可產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶。但鏈球菌屬的觸媒陰性，金氏桿菌屬細(xì)菌的觸媒也陰性。3.硝酸鹽復(fù)原試驗(yàn) 硝酸鹽復(fù)原試驗(yàn)包括兩個(gè)過(guò)程：其一是在合成代謝過(guò)程中，硝酸鹽復(fù)原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)胞內(nèi)其它含氮化合物；其次是在分解代謝過(guò)程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。硝酸鹽復(fù)原的過(guò)程可因細(xì)菌不同而異，大腸埃希菌等僅使硝酸鹽復(fù)原為亞硝酸鹽

37、；假單胞菌等能使硝酸鹽或亞硝酸鹽復(fù)原為氮；有的細(xì)菌那么可使其復(fù)原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨。硝酸鹽或亞硝酸鹽如果復(fù)原生成氣體的終末產(chǎn)物如氮或氧化氮，就稱為脫硝化或脫氮化作用。硝酸鹽復(fù)原試驗(yàn)系測(cè)定復(fù)原過(guò)程中所產(chǎn)生的亞硝酸.接種硝酸鹽培養(yǎng)基后于35培養(yǎng)14d，將硝酸鹽復(fù)原試劑甲液和乙液的等量混合液用時(shí)混合0.1ml加于試管內(nèi)，立即或10min內(nèi)觀察結(jié)果。1出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性。2如欲檢查有無(wú)氮?dú)猱a(chǎn)生，可于培養(yǎng)基內(nèi)加1只小倒管Durham管，如有氣泡產(chǎn)生，表示有氮?dú)馍伞?如參加硝酸鹽復(fù)原試劑不出現(xiàn)紅色，需檢查硝酸鹽是否被復(fù)原，可于原試管內(nèi)再參加少許鋅粉，如出現(xiàn)紅色表示硝酸鹽仍然存在。假設(shè)仍不產(chǎn)生紅色，表示硝

38、酸鹽已被復(fù)原為氨和氮。腸桿菌科細(xì)菌均能復(fù)原硝酸鹽為亞硝酸鹽，銅綠假單胞菌、嗜麥芽假單胞菌等可產(chǎn)生氮?dú)?。五、?xì)菌感染免疫學(xué)檢測(cè) 細(xì)菌感染后宿主體內(nèi)抗體的檢測(cè)方法有：輔助診斷腸熱癥的肥達(dá)試驗(yàn)，輔助診斷立克次體病的外斐試驗(yàn)，診斷鉤端螺旋體感染的顯微鏡凝集試驗(yàn)等直接凝集試驗(yàn)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，膠乳凝集試驗(yàn)。細(xì)菌抗原的測(cè)定方法有：凝集試驗(yàn)：玻片法凝集試驗(yàn)、膠乳凝集法、協(xié)同凝集試驗(yàn)、反向間接血凝試驗(yàn)。免疫熒光技術(shù)：直接法、間接法。莢膜腫脹試驗(yàn)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。非特異性凝集素的測(cè)定有：與原發(fā)性非典型性肺炎相關(guān)的冷凝集試驗(yàn)；用于診斷傳染性單核細(xì)胞增多癥的嗜異性凝集試驗(yàn)。六、細(xì)菌感染的分子生物學(xué)檢測(cè)一常用的分

39、子生物學(xué)技術(shù)1.核酸雜交 常用的雜交技術(shù)有：斑點(diǎn)雜交、southern印跡、原位雜交、Northern印跡等。探針的種類有全染色體DNA探針、染色體克隆片段DNA探針、質(zhì)粒DNA探針、rRNA基因探針、寡核苷酸探針等。2.核酸擴(kuò)增技術(shù) 核酸擴(kuò)增技術(shù)是分子生物學(xué)中最具有重大意義的技術(shù)之一。對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增的方法很多，如聚合酶鏈反響polymerase chain reaction ,PCR、連接酶鏈反響、自保存序列擴(kuò)增及Q-beta擴(kuò)增等。以聚合酶鏈反響最為廣泛應(yīng)用。PCR技術(shù)在細(xì)菌的快速檢測(cè)、細(xì)菌的毒素基因檢測(cè)、細(xì)菌的耐藥性檢測(cè)及感染細(xì)菌的流行病學(xué)調(diào)查中得到日益廣泛的應(yīng)用。生物芯片是新近開(kāi)展的一

40、項(xiàng)對(duì)基因、蛋白質(zhì)、細(xì)胞及其他生物組分進(jìn)行大信息量分析的檢測(cè)技術(shù)。常用的有基因芯片gene chips和蛋白芯片(protein chips)。目前正在研制和評(píng)價(jià)中。二鑒定感染細(xì)菌種屬的方法1.細(xì)菌種屬的鑒定DNA堿基組成的測(cè)定 G+C mol%含量不同的細(xì)菌，為不同種細(xì)菌；含量相同的可能為不同種的細(xì)菌。細(xì)菌的G+C mol%相當(dāng)穩(wěn)定，不受培養(yǎng)條件、菌齡和其他外界因素影響。最常用的方法是熱變性法。DNA-DNA雜交 DNA雜交可得出DNA之間核苷酸順序的互補(bǔ)程度，從而推斷不同細(xì)菌基因組間的同源性。16S rRNA同源性分析 rRNA-DNA雜交、16S rRNA序列測(cè)定、16S-23S rRNA

41、序列測(cè)定 此外限制性內(nèi)切酶長(zhǎng)度多態(tài)性分析RFLP、脈沖場(chǎng)凝膠電泳PFGE、隨機(jī)引物擴(kuò)增法RAPD等技術(shù)常用于菌株間的差異比擬。2.細(xì)菌種屬特異基因某些基因?yàn)榧?xì)菌種特有或?qū)俟灿?，通過(guò)對(duì)這些基因的檢測(cè)可以鑒定細(xì)菌的種或?qū)?。如編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞外表蛋白的inv基因：invA、invB、invC、invD、invE等是一組只存在于致病性沙門(mén)菌中的獨(dú)特的保守基因序列。鞭毛蛋白dlh基因通常只存在于傷寒沙門(mén)菌；IS6110、IS986插入片段為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群所擁有等。3.細(xì)菌毒力基因可以測(cè)定霍亂弧菌的霍亂毒素基因、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌的耐熱ST和不耐熱腸毒素LT以及白喉棒狀桿菌的外毒素基因以示相應(yīng)的

42、細(xì)菌存在。三細(xì)菌耐藥性的分子生物學(xué)檢測(cè)1.內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥基因青霉素結(jié)合蛋白PBP基因 耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌是由mec A基因介導(dǎo)的耐藥，肺炎鏈球菌對(duì)青霉素耐藥是由于PBP基因突變而致。革蘭陰性菌產(chǎn)生的內(nèi)酰胺酶 由質(zhì)粒介導(dǎo)的內(nèi)酰胺酶種類繁多，可以用PCR或基因探針的方法檢測(cè)和分類，如TEM、SHV、OXA、ROB型等。2.糖肽類抗生素耐藥基因 腸球菌對(duì)糖肽類抗生素的耐藥基因由Van A、Van B、Van C等介導(dǎo)，測(cè)定這些基因可以預(yù)測(cè)對(duì)萬(wàn)古霉素和壁霉素的耐藥性。3.大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥基因 紅霉素甲基酶erm基因、大環(huán)內(nèi)酯類泵出基因mef A、mef E、msr A等基因參與了紅霉

43、素的耐藥。4.喹喏酮類抗生素耐藥基因 喹喏酮類抗生素的主要耐藥機(jī)制是由于螺旋酶和拓?fù)涿傅耐蛔?，常與gyr和par基因突變有關(guān)。5.分枝桿菌耐藥基因 對(duì)利福平的耐藥與rpoB變異有關(guān)，對(duì)異煙肼的耐藥與kat G和inh A有關(guān)。七、細(xì)菌毒素的檢測(cè)一內(nèi)毒素的檢測(cè) 對(duì)注射液和生物制品采用家兔發(fā)熱法，即將可疑標(biāo)本注射進(jìn)家兔的靜脈中，觀察有無(wú)發(fā)熱反響；對(duì)臨床標(biāo)本采用鱟試驗(yàn)。二外毒素的檢測(cè)1.生物學(xué)檢測(cè) 金黃色葡萄球菌腸毒素中毒，可以選用幼貓?jiān)囼?yàn)；破傷風(fēng)梭菌的創(chuàng)口分泌物或肉湯培養(yǎng)液，可接種小鼠或豚鼠的皮下，觀察肌肉痙攣的現(xiàn)象；白喉棒狀桿菌肉湯或?yàn)V液，可接種豚鼠的皮下，觀察接種局部的病變；大腸埃希菌耐熱腸毒

44、素(ST)可以用乳鼠灌胃法等測(cè)試。進(jìn)行生物學(xué)測(cè)試時(shí)，須同時(shí)設(shè)置對(duì)照動(dòng)物。測(cè)試破傷風(fēng)梭菌和白喉棒狀桿菌時(shí)，須設(shè)置抗毒素保護(hù)組動(dòng)物對(duì)照。由于動(dòng)物試驗(yàn)有許多不確定因素，往往有假陽(yáng)性或假陰性存在。有些毒素可以用細(xì)胞培養(yǎng)的方式觀察可疑毒素對(duì)單層細(xì)胞的作用，如不耐熱腸毒素LT可導(dǎo)致中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO及Y1一腎上腺細(xì)胞的形態(tài)變化。2.免疫學(xué)測(cè)定雙向瓊脂擴(kuò)散、瓊脂擴(kuò)散法Elek法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、反向血凝、免疫電泳、放射免疫測(cè)定等技術(shù)已被廣泛應(yīng)用。八細(xì)菌自動(dòng)化檢測(cè)傳統(tǒng)的鑒定方法被認(rèn)為是菌種鑒定的參考方法。1.常規(guī)表型試驗(yàn)的自動(dòng)化檢測(cè) 不同的鑒定系統(tǒng)有不同的生化反響，如腸桿菌科細(xì)菌、非發(fā)酵菌、革蘭陽(yáng)性球菌

45、、革蘭陰性球菌、厭氧菌、酵母菌等都各自需要特別的生化反響，需要建立不同的反響鑒定系統(tǒng)。許多編碼鑒定系統(tǒng)幾乎都是采用利用底物后反響液中pH的變化，色原性或熒光原性底物的酶解來(lái)測(cè)定酶反響，采用四唑啉的指示劑來(lái)指示對(duì)各種碳源的利用結(jié)果，或識(shí)別是否生長(zhǎng)等方法。2.細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)成物質(zhì)的分析細(xì)菌細(xì)胞的構(gòu)成成分中有許多成分比擬固定，如脂肪酸、單糖、酶等。可以用不同的技術(shù)方法進(jìn)行分析，得到細(xì)菌的鑒定。3.自動(dòng)化培養(yǎng)系統(tǒng) 細(xì)菌的自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)有血培養(yǎng)系統(tǒng)和分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)。九實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制 質(zhì)量控制Quality control是臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室為了保證檢驗(yàn)結(jié)果實(shí)事求是地反映客觀存在而建立的操作程序體系。包括室內(nèi)

46、質(zhì)量控制和室間質(zhì)量控制評(píng)價(jià)。室內(nèi)質(zhì)量控制是質(zhì)量保證的核心和根底。室間質(zhì)量控制評(píng)價(jià)是由實(shí)驗(yàn)室外部的組織或機(jī)構(gòu)對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的質(zhì)量評(píng)價(jià)。1.室內(nèi)質(zhì)量控制1人員與組織管理 2標(biāo)準(zhǔn)操作程序手冊(cè)3培養(yǎng)基1一般質(zhì)量控制 外觀 每種培養(yǎng)基均應(yīng)標(biāo)注清楚。液體培養(yǎng)基應(yīng)澄清、無(wú)混濁，有濃度要求的培養(yǎng)基如1%馬尿酸鈉培養(yǎng)基應(yīng)觀察失水情況。固體培養(yǎng)基應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)，不干裂。一般平板培養(yǎng)基28可貯存12周。用塑料袋密封冷藏可使用一月，兔血平板至多保存一周。無(wú)菌試驗(yàn)應(yīng)檢測(cè)每批培養(yǎng)基的滅菌效果。分裝后滅菌的培養(yǎng)基隨機(jī)抽取510%的量，放35孵箱中24h，無(wú)菌生長(zhǎng)為合格。無(wú)菌分裝的培養(yǎng)基那么將全部培養(yǎng)基置35孵箱中24h，無(wú)菌生

47、長(zhǎng)為合格。選擇性培養(yǎng)基，取局部培養(yǎng)基參加1020倍無(wú)抑制性肉湯培養(yǎng)基如TSB，稀釋抑制物質(zhì)，置35孵箱中24h，無(wú)菌生長(zhǎng)為合格。培養(yǎng)基的量 斜面培養(yǎng)基的長(zhǎng)度為試管長(zhǎng)度的2/3。雙糖鐵培養(yǎng)基底層至少有1cm的直立段。MH平板的厚度應(yīng)為4mm。其他平板厚度一般為3mm。培養(yǎng)基pH 用pH計(jì)法測(cè)定。配制好的培養(yǎng)基pH應(yīng)與規(guī)定的pH相差±0.2以內(nèi)。2性能試驗(yàn) 每一批新配制的、新購(gòu)入的培養(yǎng)基，均應(yīng)用性質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行預(yù)測(cè)。合格者方可使用。4試劑、染色液和診斷血清的質(zhì)量控制試劑及染色液：各種試劑必須注明配制或購(gòu)入的日期，有效日期及貯存條件。有的試劑須在測(cè)試同時(shí)進(jìn)行陽(yáng)性和陰性對(duì)照試驗(yàn)。診斷血清的

48、質(zhì)量控制 診斷血清的來(lái)源必須可靠。應(yīng)注明購(gòu)入的日期，如為凍干制品，那么還應(yīng)注明配成水溶液的日期。診斷血清應(yīng)澄清。第一次使用時(shí)，應(yīng)用菌效價(jià)和特異性進(jìn)行測(cè)定。合格者方可使用。每月用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行一次測(cè)定。5、體外抗菌藥物敏感試驗(yàn)的質(zhì)量控制1紙片擴(kuò)散法的質(zhì)量控制培養(yǎng)基 每批新購(gòu)入的MH瓊脂應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)菌株、在控的藥敏紙片和標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)試。平板厚度應(yīng)為4mm。28保存可使用7d。使用前放35孵箱30min。室溫下MH瓊脂的pH應(yīng)為7.27.4，可使用外表電極來(lái)測(cè)量。MH培養(yǎng)基中的胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶含量可用磺胺甲基異惡唑/甲氧芐胺嘧啶紙片對(duì)糞腸球菌ATCC29212或ATCC33186在MH平板上進(jìn)行

49、測(cè)試，如有清晰的抑菌環(huán)直徑大于等于20mm為合格。懸液濃度標(biāo)準(zhǔn) 用于紙片擴(kuò)散法的菌懸液濃度為1.5×108/ml，相當(dāng)于0.5管麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)管或其它光學(xué)等同物如乳膠顆粒懸液。濁度標(biāo)準(zhǔn)管在625nm處吸光度值為0.080.10。每月更換標(biāo)準(zhǔn)管。使用前用混勻。含藥紙片 紙片含藥量上下是影響抑菌環(huán)大小的重要因素，從藥物制造日起在-20最多可保存一年。少量正在使用的紙片可在28保存一周，某些不穩(wěn)定的抗生素如亞胺培南、頭孢克洛、棒酸復(fù)合制劑等應(yīng)冷凍保存至使用前。使用前應(yīng)置室溫平衡12h。新購(gòu)入的含藥紙片每批用標(biāo)準(zhǔn)菌株和在控培養(yǎng)基，用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定抑菌環(huán)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果測(cè)量 配制好的菌懸液應(yīng)在15

50、min內(nèi)接種至MH平板，接種后的平板應(yīng)在室溫平放35min后將藥物紙片貼到平板上，100mm直徑的平皿不能超過(guò)5張。各紙片之間的中心間距不少于24mm，與平皿邊緣的距離不少于15mm。翻轉(zhuǎn)置35孵育箱中1824h，最多2只疊放在一起。結(jié)果的測(cè)量應(yīng)使用帶表卡尺或精確度達(dá)1/10mm的其它量具。質(zhì)控菌株 質(zhì)控菌株有：大腸埃希菌ATCC25922、大腸埃希菌ATCC35218用于內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑；金黃色葡萄球菌ATCC25923；糞腸球菌ATCC29212；銅綠假單胞菌ATCC27853；流感嗜血桿菌用于HTM培養(yǎng)基ATCC49247、49766；淋病奈瑟菌用于GC瓊脂ATCC49226；肺炎鏈