細菌實驗診斷技術與質(zhì)量控制

1、 第六章 細菌實驗診斷技術與質(zhì)量控制一、 教學大綱要求1、 掌握臨床常見標本的細菌學檢驗程序和方法2、 掌握細菌學檢驗的形態(tài)學檢查方法3、 掌握細菌的別離培養(yǎng)技術和方法4、 掌握細菌代謝產(chǎn)物檢測與鑒定技術5、 掌握細菌檢驗的質(zhì)量控制6、 了解細菌感染的分子生物學檢測技術、細菌感染免疫學檢測、細菌毒素的檢測、細菌自動化檢測技術。二、 教材內(nèi)容精要一標本采集、處理與檢測標本采集的根本原那么：盡早采集、根據(jù)可疑的病原體，選擇不同采集時機和標本種類、在抗生素應用前采集、遵守無菌操作、正確保存和運送。容器應密封不易碎，標本不得污染容器的口和外壁。1.血液標本 正常人的血液是無菌的。當細菌侵入時可引起嚴重

2、的菌血癥或敗血癥。 一般情況下在患者發(fā)熱初期或發(fā)熱頂峰時采集；持續(xù)性菌血癥可隨時采集；間歇性菌血癥，應預測其體溫上升期進行采血。一般在使用抗生素前采集23次；多部位采集，如兩側肘靜脈或動、靜脈同時采?。粚τ谝咽褂每股囟鵁o法停止的患者，也應在下次用藥前采取。在感染局部的附近血管中采血，可提高陽性率。采血量成人一般510ml，嬰幼兒12ml。采集的血液標本注入培養(yǎng)瓶中先進行增菌培養(yǎng)，培養(yǎng)基和血液標本量的比例應>10：1，將血液中的各類殺抑菌物質(zhì)充分稀釋。需氧菌常用培養(yǎng)基有胰酪蛋白大豆胨肉湯和葡萄糖酚紅肉湯等，常參加對氨基苯甲酸PABA50g/ml中和磺胺類，青霉素酶2單位/ml破壞青霉素類

3、，硫酸鎂中和鏈霉素、四環(huán)素、土霉素、金霉素、新霉素及多粘菌素等抗生素。參加0.030.05%的聚茴香磺酸鈉sodium polyanethol sulfonate, SPS可抑制血清中的抗菌物質(zhì)，并對氨基糖苷類和多肽類抗生素有滅活效果。并參加、因子等生長因子。培養(yǎng)瓶每天觀察一次。如發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶內(nèi)液體渾濁；血球?qū)由厦娉霈F(xiàn)顆粒狀的生長物，并且有自下而上的溶血；有明顯的凝塊；液體外表有菌膜，培養(yǎng)液清晰或渾濁等，說明有細菌生長。直接進行涂片染色初步報告。同時分別接種血平板、巧克力色平板，普通培養(yǎng)和5%CO2 35培養(yǎng)。也可直接進行體外藥敏試驗。無細菌生長跡象的培養(yǎng)瓶孵育至第7d，接種血平板、巧克力色平板

4、，分別進行普通培養(yǎng)和5%CO2環(huán)境35孵育24h。為了提高檢出的速度，在培養(yǎng)的第23d時應移種一次。有厭氧菌感染時，同時注入需氧瓶和厭氧瓶，厭氧培養(yǎng)基通常用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、牛心腦浸液肉湯等；培養(yǎng)液中有刃天青，無氧時無色，有氧時呈紅色。需氧瓶和厭氧瓶同時渾濁，或需氧瓶無生長而厭氧瓶液體渾濁，提示厭氧菌生長。分別接種血平板和厭氧血平板，置需氧和厭氧環(huán)境中，如果都只生長1種細菌，那么為兼性厭氧菌；如果僅在厭氧環(huán)境中生長，可以直接報告“有厭氧菌檢出。假設長期應用抗細胞壁類抗生素，應考慮細菌L型存在，將血液接種高滲培養(yǎng)基中，分別進行需氧、厭氧和5%CO2環(huán)境培養(yǎng)。每周移種23次于高滲固體培養(yǎng)基上，觀察

5、有無細菌L型菌落生長。2.呼吸道標本正常上呼吸道有正常菌群。下呼吸道正常情況下無細菌或僅有少量細菌侵入咽拭子直接涂片檢查 疑心白喉的標本，應立即進行涂片革蘭染色和異染顆粒染色。如發(fā)現(xiàn)有呈Y、V、T等排列的棒狀桿菌，有異染顆粒時可報告“找到有異染顆粒的革蘭陽性桿菌。也可用特異性的熒光染色法檢查A群溶血性鏈球菌和百日咳鮑特菌。培養(yǎng)檢查 接種血平板，觀察細菌的生長情況。有無特別的菌落生長，如為上呼吸道的正常菌群，比例大致正常，那么報告“未檢出致病菌；如果某一種菌群明顯占多數(shù)或接近純培養(yǎng)，應考慮該菌與疾病有關，鑒定后報告。呼吸道標本特殊菌的培養(yǎng) 百日咳鮑特菌接種在鮑-金B(yǎng)order-Gengou平板；

6、白喉棒狀桿菌接種呂氏血清斜面或雞蛋培養(yǎng)基，同時接種亞碲酸鉀血平板；腦膜炎奈瑟菌帶菌者的鼻咽拭子35保溫運送，盡快接種在35預溫的卵黃雙抗平板上，置35%CO2環(huán)境中35孵育24h。流感嗜血桿菌用巧克力平板或選擇性平板?；撔訟群鏈球菌的接種血平板，在接種原始區(qū)貼一張0.04U的桿菌肽紙片作為A群鏈球菌存在的指示。痰液標本，采集晨痰為好。觀察標本的性狀，選取膿血性的局部，如發(fā)現(xiàn)有顆粒、菌塊及干酪樣物，可能是放線菌或真菌感染。有異常惡臭，與厭氧菌有關。直接涂片染色檢查發(fā)現(xiàn)，以柱狀上皮細胞為主，有中性白細胞及細菌，那么可根據(jù)形態(tài)和染色性直接報告，并且作為別離細菌時選擇培養(yǎng)基的依據(jù)。如果以鱗狀上皮細胞

7、為主，很少發(fā)現(xiàn)白細胞，那么為不合格標本。如有顆粒、菌塊及干酪樣物也應進行涂片檢查，發(fā)現(xiàn)具有典型的真菌或放線菌樣的菌落特點，可直接報告“找到真菌放線菌。痰液標本在別離接種前一般進行前處理，方法有均質(zhì)化和洗凈法。痰液標本至少同時接種血平板、巧克力平板和EMB或Mac Conkey平板。3.尿液標本正常人的尿液是無菌的，女性月經(jīng)期間容易污染，不宜采集。尿液的采集方法有：中段尿采集法、腎盂尿采集法、膀胱穿刺法，膀胱穿刺法一般用于厭氧菌培養(yǎng)的標本采集或不能正確留取中段尿而需確定診斷的兒童。尿液標本檢驗 采用定量培養(yǎng)的方法進行尿液菌落計數(shù)區(qū)別污染和病原菌。一般認為尿液中的菌落數(shù)>105/ml為病原菌

8、，<104/ml為污染菌，<105/ml >104/ml為可疑需重新復查，重新復查后仍為同樣結果，那么應視為病原菌。會受到尿量、尿液在膀胱中停留的時間長短及使用利尿劑等影響。計數(shù)的方法有：平板涂布法、傾注培養(yǎng)法和標準接種環(huán)法。一般接種血平板和EMB或Mac Conkey平板，或CLED平板。尿液細菌L型較為常見，可同時接種L型平板。尿液標本的快速檢驗 用于尿液快速細菌檢驗的方法有硝酸鹽復原法、氯化三苯四氮唑TTC復原法、尿中抗體包被細菌法和產(chǎn)色培養(yǎng)基法等。4.腦脊液標本正常人的腦脊液是無菌的。腦脊液標本的采集 以無菌手續(xù)通過腰椎穿刺采集腦脊液35ml，應立即送檢或床邊接種。應

9、在35保溫運送。直接涂片檢查 由細菌引起的化膿性腦膜炎一般呈現(xiàn)混濁，在抗生素治療后亦可不混濁。此外結核性腦膜炎、無菌性腦膜炎等也不混濁?？芍苯油科锾m染色檢查，不混濁的可3000r/min離心1015min后取沉淀涂片染色檢查。如發(fā)現(xiàn)革蘭陰性、凹面相對的雙球菌，位于中性白細胞內(nèi)外，那么可報告“找到革蘭陰性雙球菌，位于細胞內(nèi)外，疑似腦膜炎奈瑟菌；有革蘭陽性矛頭狀的雙球菌，菌體周圍有明顯的莢膜，可報告“找到革蘭陽性雙球菌，疑似肺炎鏈球菌。用肺炎鏈球菌全價抗血清進行莢膜腫脹試驗，陽性者可報告“莢膜腫脹試驗檢出肺炎鏈球菌；發(fā)現(xiàn)其他形態(tài)的細菌，可根據(jù)形態(tài)和染色性進行報告。涂片陽性的標本最好進行標本的直接

10、藥敏試驗。應立即接種在35預保溫的血平板和巧克力平板上,置510%CO2環(huán)境35培養(yǎng)1824h。腦脊液標本一般經(jīng)3d培養(yǎng)仍未見細菌生長，可報告“經(jīng)3天培養(yǎng)無細菌生長。腦脊液標本特殊病原菌的檢驗結核分枝桿菌 將腦脊液4000r/min離心30min，取沉淀抗酸染色；或?qū)⒛X脊液在室溫下靜置1824h，待形成纖維網(wǎng)后，傾倒在潔凈玻片上抗酸染色。或用金胺“O進行熒光染色觀察。取沉淀接種羅-瓊培養(yǎng)基進行結核分枝桿菌的培養(yǎng)。新型隱球菌 將腦脊液離心沉淀后，進行墨汁負染，可在黑色背景中觀察到折光性很強的菌體和周圍似暈輪樣的透明莢膜，有時可見到生芽的新型隱球菌。5.糞便標本的采集 糞便標本于急性腹瀉期及未使用

11、抗生素之前采取自然排出的糞便，挑選粘液、膿血局部，置無菌容器、保存液或增菌培養(yǎng)基中。可用肛門拭子。不能立即送檢的標本應放入Cary-Blair運送培養(yǎng)基中。1直接涂片檢查 臨床疑心是霍亂弧菌、結核分枝桿菌感染或菌群失調(diào)需要大致估計菌群比例、二重感染偽膜性腸炎、真菌性或葡萄球菌性腸炎時進行直接涂片染色檢查。霍亂弧菌的涂片檢查 取“米泔水樣糞便或肛門拭子涂片2張，枯燥后用乙醇或甲醇固定，分別進行革蘭染色和1：10稀釋石炭酸復紅染色，用油鏡觀察有無革蘭陰性、魚群樣排列的弧菌。另外也可進行懸滴法動力試驗和制動試驗。菌群失調(diào)及菌交替癥 取糞便標本直接涂片，進行革蘭染色油鏡觀察，根據(jù)菌群的形態(tài)和染色特征可

12、大致描述菌群的情況。疑為偽膜性腸炎的患者標本中如發(fā)現(xiàn)大量革蘭陽性呈葡萄狀排列的球菌，那么可報告“找到革蘭陽性呈葡萄狀排列的球菌；如發(fā)現(xiàn)革蘭陽性粗大桿菌、無莢膜，通常有位于菌體一端的卵圓形芽胞者，可報告“找到革蘭陽性芽胞桿菌，疑似艱難梭菌。結核分枝桿菌 取半個指甲大小糞便塊，與飽和鹽水1015ml攪和，靜置，12h后取最上層液體作涂片，進行抗酸染色檢查。2別離培養(yǎng)沙門菌屬和志賀菌屬 直接接種腸道強選擇性培養(yǎng)基SS瓊脂、木糖賴氨酸去氧膽酸鈉瓊脂和弱選擇性培養(yǎng)基如Mac Conkey、EMB、中國藍瓊脂各1個；攜帶者的檢查，可將糞便標本接種于GN增菌液適用于沙門菌屬和志賀菌屬和亞硒酸鹽或四硫磺酸鹽增

13、菌液適用于沙門菌屬增菌后轉(zhuǎn)種于腸道強和弱選擇性培養(yǎng)基上觀察菌落特征?；魜y弧菌 可疑標本接種于堿性蛋白胨水中進行35增菌，同時接種含糖雙洗平板、慶大霉素瓊脂平板或TCBS瓊脂平板。增菌培養(yǎng)6h后，取增菌液表層菌膜移種于上述平板中進行別離培養(yǎng)，同時取增菌液作革蘭涂片染色和懸滴法動力試驗和制動試驗。副溶血性弧菌 取可疑糞便或可疑食物接種于副溶血性弧菌增菌液中，同時劃線接種于副溶血性弧菌選擇性平板和SS平板上。腸致病性大腸埃希菌 取可疑糞便標本接種在中國藍平板或Mac Conkey平板或EMB平板。小腸結腸炎耶爾森菌 將可疑標本接種于新耶爾森菌選擇培養(yǎng)基NYE、Mac Conkey及SS瓊脂平板。帶菌

14、者可將標本接種于1/15mol/LpH7.47.8的PBS中，在4進行冷增菌?？漳c彎曲菌 取可疑糞便或在Cary-Bair運送培養(yǎng)基中的糞便標本接種于Camp-BAP血瓊脂或Skirrow血瓊脂，或接種于CEM增菌液在微需氧環(huán)境下培養(yǎng)1824小時后接種上述平板，在微需氧環(huán)境下培養(yǎng)4248h。菌群失調(diào)及菌交替癥 要對糞便中的所有菌群進行觀察，將糞便定量接種在腸道選擇性培養(yǎng)基、需氧和厭氧血平板，甘露醇鹽瓊脂，沙保弱培養(yǎng)基等，觀察各菌群的生長情況，進行鑒定后報告各菌群比例。疑心艱難梭菌的菌交替癥時，如為黃色、夾有偽膜的糞便應立即接種CCFA平板，進行厭氧培養(yǎng)。如為綠色、海水樣糞便，應疑心為金黃色葡萄

15、球菌感染，接種甘露醇鹽瓊脂，有黃色菌落按葡萄球菌鑒定。如為真菌性腹瀉，常發(fā)生在抗生素使用之后，將標本接種在沙保弱培養(yǎng)基及血平板上，進行鑒定。6.生殖道標本男性尿道、生殖器分泌物 用無菌棉簽將膿液采集在無菌試管中。由臨床醫(yī)師從肛門進行前列腺按摩，收集前列腺液。女性生殖道標本 直視采集陰道后穹隆分泌物。盆腔膿腫的患者應消毒陰道后從后穹隆穿刺抽取膿液。子宮分泌物的采集采用雙套管的方式插入子宮腔吸取分泌物。外陰分泌物 對外陰部位的硬下疳,從其潰瘍底部擠出少許組織液，以潔凈玻片直接沾取，加蓋玻片后送檢。涂片檢查 對一般細菌和淋球菌的檢查用革蘭染色；梅毒螺旋體用暗視野顯微鏡或鍍銀染色法檢查；結核分枝桿菌進

16、行抗酸染色。培養(yǎng)檢查 一般細菌培養(yǎng)用血平板和Mac Conkey平板各一個；培養(yǎng)淋病奈瑟菌需要巧克力平板或卵黃雙抗平板.7.膿液、胸腹水及分泌物等其它標本封閉性膿腫直接穿刺；疑為厭氧菌感染者，應立即將注射器內(nèi)的空氣排空，將針頭插入橡皮塞中隔絕空氣；開放性膿腫或瘺管從深部采取標本。標本直接涂片革蘭染色發(fā)現(xiàn)細菌可以直接報告，然后用血平板接種培養(yǎng)。胸、腹水通過胸腔或腹腔穿刺獲得，注入無菌試管中送檢。二細菌形態(tài)檢查顯微鏡是觀察細菌形態(tài)的必備儀器。分為光學顯微鏡和電子顯微鏡。光學顯微鏡有普通光學顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡等。1.不染色可以觀察細菌的動力及運動等活體狀況，由于細菌的折光性

17、不強，不能清楚的看到細菌的形態(tài)特征和結構。標本的制作懸滴法、壓滴法和毛細管法，后者主要用于厭氧菌的動力觀察。用普通光學顯微鏡、暗視野顯微鏡或位相差顯微鏡觀察。2.染色標本的形態(tài)檢查細菌的染色可能是由于毛細管現(xiàn)象和染料的滲透作用、染料的溶解和吸收作用使染料進入細胞內(nèi)，或由于電荷的吸附和結合使細菌著色。也可能與細菌細胞內(nèi)的化學成分有關。此外細菌的染色性與細菌細胞膜的通透性、細胞結構的完整性，以及培養(yǎng)基的種類、菌齡，染色液的離子強度、pH，染色溫度等密切相關。醫(yī)學檢驗中常用的染料：酸性染料 細菌一般情況下都帶負電荷，故酸性染料一般不著色。如剛果紅、伊紅等。堿性染料 細菌一般情況下都帶負電荷，因此能與

18、細菌結合，細菌學檢查中常用此類染料。如美藍、結晶紫和堿性復紅等。復合染料 如姬姆薩染料，是堿性和酸性染料的復合物。單純?nèi)玖?如蘇丹類染料，溶于脂肪溶劑中，不溶于水，化學親和力低。3.染色方法應先制作細菌涂片。方法有單染色法和復合染色法。1革蘭染色法 染液由革蘭結晶紫染液、革蘭碘液、95%酒精和稀釋石炭酸復紅沙黃組成。革蘭陽性菌為紫色，革蘭陰性菌呈紅色。影響因素：涂片過厚將使脫色不完全，酒精脫色時間過長將導致過度脫色；染液儲存過久由于蒸發(fā)而影響濃度，特別是碘液久存或見光而形成碘酸，失去媒染作用；95%酒精如果密封不佳易揮發(fā)，失去脫色作用；細菌形態(tài)學檢查以對數(shù)生長期的細菌形態(tài)最為典型，菌齡過長易致

19、陰性。2抗酸染色法 染液由石炭酸復紅、3%鹽酸酒精和美藍組成?？顾峋始t色，非抗酸菌和細胞呈藍色。本法主要用于結核分枝桿菌和麻風分枝桿菌的檢查，每張載玻片上只能涂1份標本，最好使用新玻片，否那么必須徹底清洗干凈。染色使不得使用染色缸，吸水紙1片1張不得重復使用。脫色時間不得過短。為了防止實驗室感染可將標本先進行高壓蒸氣滅菌，然后進行抗酸染色。三、細菌的接種與別離培養(yǎng)（一） 培養(yǎng)基培養(yǎng)基是供細菌生長用的，由人工方法將多種營養(yǎng)物質(zhì)根據(jù)各種細菌的需要而組合成的混合營養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基的根本成分有營養(yǎng)物質(zhì)、凝固物質(zhì)、抑制劑和指示劑。常用的營養(yǎng)物質(zhì)有：蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、各種糖類、血液、無機鹽、雞蛋和動

20、物血清、生長因子等。最常用凝固物質(zhì)為瓊脂100ml培養(yǎng)基中參加22.5g瓊脂可制成固體培養(yǎng)基；100ml培養(yǎng)基中參加0.30.5g瓊脂可制成半固體培養(yǎng)基。有時也使用明膠、卵白蛋白、血清等作為賦形劑。常用的抑制劑有膽鹽、煌綠、玫瑰紅酸、亞硫酸鈉、亞硒酸鈉、一些染料和某些抗生素。培養(yǎng)基中參加的指示劑有酚紅、中性紅、甲基紅、酸性復紅、溴甲酚紫、溴麝香草酚藍等酸堿指示劑和美藍作為氧氣指示劑。根據(jù)其形狀分為固體、液體和半固體培養(yǎng)基；按用途可分為根底培養(yǎng)基、增菌培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基等；按成分可分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。二細菌的培養(yǎng)方法普通培養(yǎng)法 普通培養(yǎng)法是指需氧菌或兼性厭氧菌等在

21、普通大氣條件下的培養(yǎng)方法，又稱需氧培養(yǎng)法。假設用明膠培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌，應22培養(yǎng)。二氧化碳培養(yǎng)法 某些細菌，如腦膜炎奈瑟菌、布魯菌等在初別離時，需在510二氧化碳環(huán)境中才能良好生長。二氧化碳培養(yǎng)方法有以下幾種：二氧化碳培養(yǎng)箱、燭缸法、化學法。厭氧培養(yǎng)法 常用方法有厭氧罐法、氣袋法和厭氧手套箱等。大多數(shù)厭氧菌的初代培養(yǎng)生長較慢，故厭氧培養(yǎng)在37至少應培養(yǎng)48h。如疑為放線菌那么應延長7296h。四、細菌代謝產(chǎn)物檢測與鑒定一碳水化合物的代謝試驗1.糖醇、苷類發(fā)酵試驗 兼性厭氧菌和厭氧菌一般能發(fā)酵糖類。各種細菌含有不同糖醇、苷類的發(fā)酵酶。不同細菌分解糖類后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物因菌種而異。因此測定細菌對糖類的

22、分解能力和產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可以鑒別細菌。接種入的細菌假設能分解培養(yǎng)基中的糖類產(chǎn)酸時，那么使指示劑呈酸性反響。假設產(chǎn)氣可使液體培養(yǎng)基中的倒管Durham管內(nèi)出現(xiàn)氣泡，或使半固體培養(yǎng)基內(nèi)出現(xiàn)氣泡、裂開等現(xiàn)象。假設不分解那么無變化。不同細菌可發(fā)酵不同的糖類，如大腸埃希菌可發(fā)酵葡萄糖及乳糖。沙門菌屬那么只發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵乳糖；大腸埃希菌和志賀菌屬均可發(fā)酵葡萄糖，但前者產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，而后者僅產(chǎn)酸。2.氧化一發(fā)酵試驗O-F試驗又稱HughLeifsonHL試驗。細菌在分解葡萄糖的過程中，必須以分子氧作為電子受體的，稱為氧化型。細菌在分解葡萄糖的過程中，可以進行無氧降解的，稱為發(fā)酵型，此類細菌無論在有氧或無氧

23、的環(huán)境中都能分解葡萄糖，通常為兼性厭氧菌。不分解葡萄糖的細菌，稱為產(chǎn)鹼型。挑取少許純種細菌，同時穿刺接種兩支HughLeifson培養(yǎng)基，其中1支在接種后，滴加高度不少于1cm的無菌液體石臘于培養(yǎng)基上進行封蓋。于35C培養(yǎng)48h以上，觀察結果。培養(yǎng)基變黃表示細菌分解葡萄糖而產(chǎn)酸，顏色不變?yōu)椴环纸馄咸烟?。假設兩支培養(yǎng)基均為黃色為發(fā)酵型；均不變?yōu)楫a(chǎn)鹼型或不分解糖型；僅不加液體石臘的培養(yǎng)基管內(nèi)變黃為氧化型。用于細菌種屬間的鑒別。腸桿菌科細菌為發(fā)酵型，非發(fā)酵菌通常為氧化型或產(chǎn)鹼型。此外微球菌屬可氧化葡萄糖，而葡萄球菌屬那么能發(fā)酵葡萄糖。3.-半乳糖苷酶試驗ONPG試驗細菌分解乳糖必須有半乳糖苷滲透酶g

24、alact osidepermease和-半乳糖苷酶的參加。前者可將乳糖通過細胞壁送到細胞內(nèi)。后者存在于細菌的細胞內(nèi)，將進入菌細胞的乳糖分解為葡萄糖和半乳糖。具有上述兩種酶的細菌可迅速分解乳糖。緩慢分解乳糖的細菌只有-半乳糖苷酶，缺乏半乳糖苷滲透酶，或是其活性很弱，不能很快將乳糖運送到菌細胞內(nèi)，所以通常需要幾天時間乳糖才被分解。ONPG與乳糖的分子結構相似，且分子較小，不需半乳糖苷滲透酶的運送就可進入菌細胞內(nèi)，由菌細胞內(nèi)的-半乳糖苷酶將其分解為半乳糖和黃色的鄰位-硝基酚。采用ONPG試驗，可將緩慢分解乳糖的細菌迅速取得陽性結果。無色的ONPG經(jīng)-半乳糖苷酶水解后生成黃色的鄰位-硝基酚。迅速及緩

25、慢分解乳糖的細菌如埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬等陽性。而不發(fā)酵乳糖的細菌如沙門菌、變形桿菌等均為陰性。4.七葉苷水解試驗 某些細菌能水解七葉苷生成七葉素與培養(yǎng)基中枸櫞酸鐵的亞鐵離子起反響，生成黑色的化合物。將被檢菌接于七葉苷培養(yǎng)基上35孵育1824h。使培養(yǎng)基變黑為陽性?？死撞鷮佟⒛c桿菌屬和沙雷菌屬能水解七葉苷，腸球菌屬和D群鏈球菌也能水解七葉苷，并耐受膽汁。5.淀粉水解試驗 細菌如產(chǎn)生淀粉酶，可將培養(yǎng)基中的淀粉分解為糖類，滴加碘液在培養(yǎng)基上，在菌落周圍透明區(qū)。將被檢菌劃線接種或點種淀粉血清瓊脂平板，35培養(yǎng)24h，在培養(yǎng)基上滴加革蘭碘液，觀察結果。培養(yǎng)基呈藍色，菌落周圍有透明圈為陽性

26、。白喉棒狀桿菌可產(chǎn)生淀粉酶，分解淀粉。6.甲基紅MR試驗 細菌在代謝過程中分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，某些細菌可進一步將丙酮酸分解為乳酸、乙酸、甲酸等，使培養(yǎng)基的pH下降至4.5以下，參加甲基紅指示劑出現(xiàn)紅色陽性。有些細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)如醇、酮、醛、氣體和水，那么培養(yǎng)基的酸堿度維持在pH6.2以上，參加甲基紅指示劑呈黃色陰性。將被檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)，于35培養(yǎng)24d，參加甲基紅指示劑2滴，立即觀察結果。紅色為陽性；桔紅色為弱陽性；黃色為陰性。主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別，前者為陽性，后者為陰性。此外沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌、變形桿菌等為

27、陽性，腸桿菌屬、克雷伯菌等為陰性。7.V-P試驗 細菌在葡萄糖的代謝過程中生成丙酮酸，有些細菌可將丙酮酸進一步脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣中的氧氧化為二乙酰丁二酮，進而與培養(yǎng)基中的精氨酸所含的胍基發(fā)生反響，生成紅色化合物，即VP反響陽性。將被檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基后，參加5%-萘酚0.6ml，再參加40%KOH0.2ml，振搖后觀察結果。于數(shù)分鐘內(nèi)呈紅色為陽性，如無紅色出現(xiàn)，而且于35中4h仍無紅色者為陰性。本試驗常與甲基紅試驗一起使用。前者為陽性的細菌，后者為陰性，反之亦如此。如大腸埃希菌、沙門菌屬、志賀菌屬等甲基紅呈陽性反響，V-P反響那么陰性。相反，如沙雷

28、菌、陰溝腸桿菌等，VP反響陽性，而甲基紅反響陰性。8.葡萄糖酸氧化試驗 某些細菌可氧化葡萄糖酸鉀，生成2-酮基葡萄糖酸。2-酮基葡萄糖酸是一種復原性物質(zhì)，可與班氏試劑起反響，出現(xiàn)棕色或磚紅色的Cu2O沉淀。接種細菌至改進Haynes培養(yǎng)基中，48h后取培養(yǎng)液1ml，參加班氏定性試劑1ml，于水浴中煮沸10min并迅速冷卻。觀察結果。出現(xiàn)黃到磚紅色沉淀為陽性。不變或仍為藍色為陰性。主要用于假單胞菌的鑒定。(二)、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗1.苯丙氨酸脫氨酶試驗 某些細菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸和游離的氨，參加三氯化鐵試劑與苯丙酮酸螯合后產(chǎn)生綠色反響。大量接種被檢菌于苯

29、丙氨酸瓊脂斜面上，35培養(yǎng)1824h，參加10%三氯化鐵試劑出現(xiàn)綠色為陽性。主要用于鑒定變形桿菌屬、摩根菌屬和普羅威登菌屬細菌，均為強陽性，腸桿菌科中其它細菌均為陰性。2.氨基酸脫羧酶試驗 細菌分解氨基酸使其脫羧基，生成胺和CO2。各種細菌的產(chǎn)生的脫羧酶種類不一樣，但氨基酸經(jīng)脫羧后所產(chǎn)生的胺，均可使培養(yǎng)基變堿。最常測定的氨基酸有三種：賴氨酸、鳥氨酸和精氨酸。挑取待測菌分別接種三種氨基酸培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基，于35培養(yǎng)14d，每天檢查一次結果。氨基酸測定管由黃變?yōu)樽仙?，黃色為陰性僅發(fā)酵葡萄糖。對照無氨基酸為黃色發(fā)酵葡萄糖。沙門菌屬中除傷寒和雞沙門菌之外，其余沙門菌屬的鳥氨酸和賴氨酸脫羧酶均陽性。致

30、賀菌屬中除宋內(nèi)和鮑氏志賀菌外，其它志賀菌均陰性。對鏈球菌和弧菌科細菌的鑒定也有重要價值。3.精氨酸雙水解酶試驗 精氨酸經(jīng)兩次水解，先生成瓜氨酸和氨，瓜氨酸又在瓜氨酸酶的作用下，形成鳥氨酸、氨及二氧化碳。鳥氨酸又在鳥氨酸脫羧酶的作用下生成腐胺及二氧化碳。將被檢菌接種于脫羧酶培養(yǎng)基培養(yǎng)基，腸桿菌科應覆蓋滅菌液體石蠟。假單胞菌通常采用Thornley氏培養(yǎng)基,不加石蠟。指示劑顏色轉(zhuǎn)為堿性為陽性，即溴甲酚紫轉(zhuǎn)為紫色，酚紅轉(zhuǎn)為紅色。Thornley氏培養(yǎng)基通常陽性在2448h后，最長可觀察至7d。4.尿素酶試驗 某些細菌能產(chǎn)生尿素酶分解尿素，產(chǎn)生大量的氨使培養(yǎng)基變堿。將被檢菌接種于相應的尿素培養(yǎng)基，于3

31、5培養(yǎng)1824h觀察結果。陰性時應繼續(xù)觀察4d。細菌分解尿素后培養(yǎng)基變堿，使酚紅指示劑變紅為陽性，不變?yōu)殛幮?。奇異變形桿菌和普通變形桿菌、雷極普羅威登菌和摩根摩根菌陽性，斯氏和產(chǎn)堿普羅威登菌陰性。5.吲哚試驗 細菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚與試劑中的對二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈紅色。挑取純培養(yǎng)物接種蛋白胨水培養(yǎng)基，于35培養(yǎng)12d，沿管壁徐徐參加Kovac氏試劑或歐氏試劑0.5ml，使成兩層，觀察結果。兩者液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性。主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。6.硫化氫試驗 某些細菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸如胱氨酸、半胱氨酸生成硫化氫，遇鉛或亞鐵離子生成黑色硫化物。

32、將培養(yǎng)物接種于醋酸鉛或克氏鐵瓊脂等培養(yǎng)基，經(jīng)35培養(yǎng)12d，觀察結果。醋酸鉛培養(yǎng)基變黑色為陽性，不變?yōu)殛幮??？耸翔F瓊脂等培養(yǎng)基，復原含硫化合物而產(chǎn)生硫化氫，與二價鐵生成黑色的硫化亞鐵，陰性不產(chǎn)生黑色沉淀。腸桿菌科中沙門菌屬、愛德華菌屬、枸櫞酸桿菌屬和變形桿菌屬細菌，絕大多數(shù)硫化氫陽性，其它菌屬陰性。此外，腐敗假單胞菌、口腔類桿菌和某些布魯菌硫化氫也陽性。7.明膠液化試驗 明膠酶是細菌產(chǎn)生的一種胞外酶，能分解明膠為氨基酸，從而失去凝固力，使半固體的明膠培養(yǎng)基成為流動的液體。將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，于20培養(yǎng)7d，逐日觀察結果。如室溫高培養(yǎng)基自行溶化時，可于冰箱內(nèi)放置30min，不再凝固為陽

33、性。沙雷菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、陰溝腸桿菌等可液化明膠，腸桿菌科其它細菌很少液化明膠。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、腐敗假單胞菌也能產(chǎn)生明膠酶。有些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等也能液化明膠。(三)、 碳源和氮源利用試驗1.枸櫞酸鹽利用試驗 當細菌利用銨鹽作為唯一氮源，并能利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源時，可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長分解枸櫞酸鈉，使培養(yǎng)基變堿。在枸櫞酸鹽瓊脂斜面上濃密劃線，大量接種被檢菌，于35培養(yǎng)14d，逐日觀察結果。枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上有細菌生長，培養(yǎng)基變藍為陽性；無細菌生長、顏色不變綠色為陰性。埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門菌屬

34、、克雷伯菌屬、粘質(zhì)和液化沙雷菌及某些變形桿菌以及枸櫞酸桿菌陽性。此外，銅綠假單胞菌、洋蔥假單胞菌和嗜水氣單胞菌也能利用枸櫞酸鹽。2.丙二酸鹽利用試驗 細菌利用丙二酸鹽作為唯一碳源時，丙二酸鈉可被分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿。將被檢菌接種于丙二酸鹽培養(yǎng)基，于35培養(yǎng)2448h后觀察結果.培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{色為陽性，顏色無變化為陰性。3.醋酸鹽利用試驗 細菌可利用銨鹽作為唯一碳源，同時利用醋酸鹽作為唯一碳源時，可在醋酸鹽培養(yǎng)基上生長，同時生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。將被檢菌接種于醋酸鹽培養(yǎng)基的斜面上，于35培養(yǎng)7d，逐日觀察結果。斜面上生長有菌落，培養(yǎng)基變?yōu)樗{色為陽性。腸桿菌科中埃希菌屬為陽性，

35、志賀菌屬為陰性。銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、洋蔥假單胞菌等也為陽性。4.馬尿酸鹽水解試驗 B群鏈球菌具有馬尿酸水解酶，可使馬尿酸水解為苯甲酸和甘氨酸。苯甲酸與三氯化鐵試劑結合，形成苯甲酸鐵沉淀。甘氨酸在茚三酮強氧化劑的作用下，經(jīng)氧化脫氨基反響，生成氨、二氧化碳和相應的醛，而茚三酮那么生成了復原型茚三酮。反響過程中形成的氨和復原型茚三酮，與殘留的茚三酮起反響，那么形成了紫色化合物。(四)、呼吸酶類試驗1.氧化酶試驗 氧化酶或稱細胞色素氧化酶，是細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶。作氧化酶試驗時，此酶首先使細胞色素C氧化，然后氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反響。本試驗腸桿菌科陰性，弧菌科、

36、非發(fā)酵菌陽性除個別菌種外、奈瑟菌屬均陽性。 2.過氧化氫酶試驗 黃酶系統(tǒng)的呼吸酶最后把氫交給分子氧而形成過氧化氫，過氧化氫對活細胞有毒，過氧化氫酶的作用是使過氧化氫分解為分子態(tài)氧。于半分鐘內(nèi)大量氣泡產(chǎn)生者為陽性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性。絕大多數(shù)細菌均可產(chǎn)生過氧化氫酶。但鏈球菌屬的觸媒陰性，金氏桿菌屬細菌的觸媒也陰性。3.硝酸鹽復原試驗 硝酸鹽復原試驗包括兩個過程：其一是在合成代謝過程中，硝酸鹽復原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細胞內(nèi)其它含氮化合物；其次是在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。硝酸鹽復原的過程可因細菌不同而異，大腸埃希菌等僅使硝酸鹽復原為亞硝酸鹽

37、；假單胞菌等能使硝酸鹽或亞硝酸鹽復原為氮；有的細菌那么可使其復原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨。硝酸鹽或亞硝酸鹽如果復原生成氣體的終末產(chǎn)物如氮或氧化氮，就稱為脫硝化或脫氮化作用。硝酸鹽復原試驗系測定復原過程中所產(chǎn)生的亞硝酸.接種硝酸鹽培養(yǎng)基后于35培養(yǎng)14d，將硝酸鹽復原試劑甲液和乙液的等量混合液用時混合0.1ml加于試管內(nèi)，立即或10min內(nèi)觀察結果。1出現(xiàn)紅色為陽性。2如欲檢查有無氮氣產(chǎn)生，可于培養(yǎng)基內(nèi)加1只小倒管Durham管，如有氣泡產(chǎn)生，表示有氮氣生成。3如參加硝酸鹽復原試劑不出現(xiàn)紅色，需檢查硝酸鹽是否被復原，可于原試管內(nèi)再參加少許鋅粉，如出現(xiàn)紅色表示硝酸鹽仍然存在。假設仍不產(chǎn)生紅色，表示硝

38、酸鹽已被復原為氨和氮。腸桿菌科細菌均能復原硝酸鹽為亞硝酸鹽，銅綠假單胞菌、嗜麥芽假單胞菌等可產(chǎn)生氮氣。五、細菌感染免疫學檢測 細菌感染后宿主體內(nèi)抗體的檢測方法有：輔助診斷腸熱癥的肥達試驗，輔助診斷立克次體病的外斐試驗，診斷鉤端螺旋體感染的顯微鏡凝集試驗等直接凝集試驗。酶聯(lián)免疫吸附試驗，膠乳凝集試驗。細菌抗原的測定方法有：凝集試驗：玻片法凝集試驗、膠乳凝集法、協(xié)同凝集試驗、反向間接血凝試驗。免疫熒光技術：直接法、間接法。莢膜腫脹試驗。酶聯(lián)免疫吸附試驗。非特異性凝集素的測定有：與原發(fā)性非典型性肺炎相關的冷凝集試驗；用于診斷傳染性單核細胞增多癥的嗜異性凝集試驗。六、細菌感染的分子生物學檢測一常用的分

39、子生物學技術1.核酸雜交 常用的雜交技術有：斑點雜交、southern印跡、原位雜交、Northern印跡等。探針的種類有全染色體DNA探針、染色體克隆片段DNA探針、質(zhì)粒DNA探針、rRNA基因探針、寡核苷酸探針等。2.核酸擴增技術 核酸擴增技術是分子生物學中最具有重大意義的技術之一。對核酸進行擴增的方法很多，如聚合酶鏈反響polymerase chain reaction ,PCR、連接酶鏈反響、自保存序列擴增及Q-beta擴增等。以聚合酶鏈反響最為廣泛應用。PCR技術在細菌的快速檢測、細菌的毒素基因檢測、細菌的耐藥性檢測及感染細菌的流行病學調(diào)查中得到日益廣泛的應用。生物芯片是新近開展的一

40、項對基因、蛋白質(zhì)、細胞及其他生物組分進行大信息量分析的檢測技術。常用的有基因芯片gene chips和蛋白芯片(protein chips)。目前正在研制和評價中。二鑒定感染細菌種屬的方法1.細菌種屬的鑒定DNA堿基組成的測定 G+C mol%含量不同的細菌，為不同種細菌；含量相同的可能為不同種的細菌。細菌的G+C mol%相當穩(wěn)定，不受培養(yǎng)條件、菌齡和其他外界因素影響。最常用的方法是熱變性法。DNA-DNA雜交 DNA雜交可得出DNA之間核苷酸順序的互補程度，從而推斷不同細菌基因組間的同源性。16S rRNA同源性分析 rRNA-DNA雜交、16S rRNA序列測定、16S-23S rRNA

41、序列測定 此外限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性分析RFLP、脈沖場凝膠電泳PFGE、隨機引物擴增法RAPD等技術常用于菌株間的差異比擬。2.細菌種屬特異基因某些基因為細菌種特有或?qū)俟灿校ㄟ^對這些基因的檢測可以鑒定細菌的種或?qū)?。如編碼吸附和侵襲上皮細胞外表蛋白的inv基因：invA、invB、invC、invD、invE等是一組只存在于致病性沙門菌中的獨特的保守基因序列。鞭毛蛋白dlh基因通常只存在于傷寒沙門菌；IS6110、IS986插入片段為結核分枝桿菌復合群所擁有等。3.細菌毒力基因可以測定霍亂弧菌的霍亂毒素基因、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌的耐熱ST和不耐熱腸毒素LT以及白喉棒狀桿菌的外毒素基因以示相應的

42、細菌存在。三細菌耐藥性的分子生物學檢測1.內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥基因青霉素結合蛋白PBP基因 耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌是由mec A基因介導的耐藥，肺炎鏈球菌對青霉素耐藥是由于PBP基因突變而致。革蘭陰性菌產(chǎn)生的內(nèi)酰胺酶 由質(zhì)粒介導的內(nèi)酰胺酶種類繁多，可以用PCR或基因探針的方法檢測和分類，如TEM、SHV、OXA、ROB型等。2.糖肽類抗生素耐藥基因 腸球菌對糖肽類抗生素的耐藥基因由Van A、Van B、Van C等介導，測定這些基因可以預測對萬古霉素和壁霉素的耐藥性。3.大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥基因 紅霉素甲基酶erm基因、大環(huán)內(nèi)酯類泵出基因mef A、mef E、msr A等基因參與了紅霉

43、素的耐藥。4.喹喏酮類抗生素耐藥基因 喹喏酮類抗生素的主要耐藥機制是由于螺旋酶和拓撲酶的突變，常與gyr和par基因突變有關。5.分枝桿菌耐藥基因 對利福平的耐藥與rpoB變異有關，對異煙肼的耐藥與kat G和inh A有關。七、細菌毒素的檢測一內(nèi)毒素的檢測 對注射液和生物制品采用家兔發(fā)熱法，即將可疑標本注射進家兔的靜脈中，觀察有無發(fā)熱反響；對臨床標本采用鱟試驗。二外毒素的檢測1.生物學檢測 金黃色葡萄球菌腸毒素中毒，可以選用幼貓試驗；破傷風梭菌的創(chuàng)口分泌物或肉湯培養(yǎng)液，可接種小鼠或豚鼠的皮下，觀察肌肉痙攣的現(xiàn)象；白喉棒狀桿菌肉湯或濾液，可接種豚鼠的皮下，觀察接種局部的病變；大腸埃希菌耐熱腸毒

44、素(ST)可以用乳鼠灌胃法等測試。進行生物學測試時，須同時設置對照動物。測試破傷風梭菌和白喉棒狀桿菌時，須設置抗毒素保護組動物對照。由于動物試驗有許多不確定因素，往往有假陽性或假陰性存在。有些毒素可以用細胞培養(yǎng)的方式觀察可疑毒素對單層細胞的作用，如不耐熱腸毒素LT可導致中國倉鼠卵巢細胞CHO及Y1一腎上腺細胞的形態(tài)變化。2.免疫學測定雙向瓊脂擴散、瓊脂擴散法Elek法、酶聯(lián)免疫吸附試驗、反向血凝、免疫電泳、放射免疫測定等技術已被廣泛應用。八細菌自動化檢測傳統(tǒng)的鑒定方法被認為是菌種鑒定的參考方法。1.常規(guī)表型試驗的自動化檢測 不同的鑒定系統(tǒng)有不同的生化反響，如腸桿菌科細菌、非發(fā)酵菌、革蘭陽性球菌

45、、革蘭陰性球菌、厭氧菌、酵母菌等都各自需要特別的生化反響，需要建立不同的反響鑒定系統(tǒng)。許多編碼鑒定系統(tǒng)幾乎都是采用利用底物后反響液中pH的變化，色原性或熒光原性底物的酶解來測定酶反響，采用四唑啉的指示劑來指示對各種碳源的利用結果，或識別是否生長等方法。2.細菌細胞構成物質(zhì)的分析細菌細胞的構成成分中有許多成分比擬固定，如脂肪酸、單糖、酶等?？梢杂貌煌募夹g方法進行分析，得到細菌的鑒定。3.自動化培養(yǎng)系統(tǒng) 細菌的自動培養(yǎng)系統(tǒng)有血培養(yǎng)系統(tǒng)和分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)。九實驗室質(zhì)量控制 質(zhì)量控制Quality control是臨床微生物學實驗室為了保證檢驗結果實事求是地反映客觀存在而建立的操作程序體系。包括室內(nèi)

46、質(zhì)量控制和室間質(zhì)量控制評價。室內(nèi)質(zhì)量控制是質(zhì)量保證的核心和根底。室間質(zhì)量控制評價是由實驗室外部的組織或機構對實驗室進行的質(zhì)量評價。1.室內(nèi)質(zhì)量控制1人員與組織管理 2標準操作程序手冊3培養(yǎng)基1一般質(zhì)量控制 外觀 每種培養(yǎng)基均應標注清楚。液體培養(yǎng)基應澄清、無混濁，有濃度要求的培養(yǎng)基如1%馬尿酸鈉培養(yǎng)基應觀察失水情況。固體培養(yǎng)基應無菌落生長，不干裂。一般平板培養(yǎng)基28可貯存12周。用塑料袋密封冷藏可使用一月，兔血平板至多保存一周。無菌試驗應檢測每批培養(yǎng)基的滅菌效果。分裝后滅菌的培養(yǎng)基隨機抽取510%的量，放35孵箱中24h，無菌生長為合格。無菌分裝的培養(yǎng)基那么將全部培養(yǎng)基置35孵箱中24h，無菌生

47、長為合格。選擇性培養(yǎng)基，取局部培養(yǎng)基參加1020倍無抑制性肉湯培養(yǎng)基如TSB，稀釋抑制物質(zhì)，置35孵箱中24h，無菌生長為合格。培養(yǎng)基的量 斜面培養(yǎng)基的長度為試管長度的2/3。雙糖鐵培養(yǎng)基底層至少有1cm的直立段。MH平板的厚度應為4mm。其他平板厚度一般為3mm。培養(yǎng)基pH 用pH計法測定。配制好的培養(yǎng)基pH應與規(guī)定的pH相差±0.2以內(nèi)。2性能試驗 每一批新配制的、新購入的培養(yǎng)基，均應用性質(zhì)的標準菌株進行預測。合格者方可使用。4試劑、染色液和診斷血清的質(zhì)量控制試劑及染色液：各種試劑必須注明配制或購入的日期，有效日期及貯存條件。有的試劑須在測試同時進行陽性和陰性對照試驗。診斷血清的

48、質(zhì)量控制 診斷血清的來源必須可靠。應注明購入的日期，如為凍干制品，那么還應注明配成水溶液的日期。診斷血清應澄清。第一次使用時，應用菌效價和特異性進行測定。合格者方可使用。每月用標準菌株進行一次測定。5、體外抗菌藥物敏感試驗的質(zhì)量控制1紙片擴散法的質(zhì)量控制培養(yǎng)基 每批新購入的MH瓊脂應使用標準菌株、在控的藥敏紙片和標準方法進行測試。平板厚度應為4mm。28保存可使用7d。使用前放35孵箱30min。室溫下MH瓊脂的pH應為7.27.4，可使用外表電極來測量。MH培養(yǎng)基中的胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶含量可用磺胺甲基異惡唑/甲氧芐胺嘧啶紙片對糞腸球菌ATCC29212或ATCC33186在MH平板上進行

49、測試，如有清晰的抑菌環(huán)直徑大于等于20mm為合格。懸液濃度標準 用于紙片擴散法的菌懸液濃度為1.5×108/ml，相當于0.5管麥氏濁度標準管或其它光學等同物如乳膠顆粒懸液。濁度標準管在625nm處吸光度值為0.080.10。每月更換標準管。使用前用混勻。含藥紙片 紙片含藥量上下是影響抑菌環(huán)大小的重要因素，從藥物制造日起在-20最多可保存一年。少量正在使用的紙片可在28保存一周，某些不穩(wěn)定的抗生素如亞胺培南、頭孢克洛、棒酸復合制劑等應冷凍保存至使用前。使用前應置室溫平衡12h。新購入的含藥紙片每批用標準菌株和在控培養(yǎng)基，用標準方法測定抑菌環(huán)。實驗過程及結果測量 配制好的菌懸液應在15

50、min內(nèi)接種至MH平板，接種后的平板應在室溫平放35min后將藥物紙片貼到平板上，100mm直徑的平皿不能超過5張。各紙片之間的中心間距不少于24mm，與平皿邊緣的距離不少于15mm。翻轉(zhuǎn)置35孵育箱中1824h，最多2只疊放在一起。結果的測量應使用帶表卡尺或精確度達1/10mm的其它量具。質(zhì)控菌株 質(zhì)控菌株有：大腸埃希菌ATCC25922、大腸埃希菌ATCC35218用于內(nèi)酰胺酶抑制劑復合制劑；金黃色葡萄球菌ATCC25923；糞腸球菌ATCC29212；銅綠假單胞菌ATCC27853；流感嗜血桿菌用于HTM培養(yǎng)基ATCC49247、49766；淋病奈瑟菌用于GC瓊脂ATCC49226；肺炎鏈