PRL-3上調VEGF、VEGF-C表達并與肺癌的MVD、LVD呈正相關

1、PRL-3 上調 VEGF、VEGF-C表達并與肺癌的MVD、LVD呈正相關前言 PRL-3（phosphatase of regenerating liver-3）是一種蛋白酪氨酸磷酸酶 , 通過調節(jié)蛋白質分子酪氨酸殘基的磷酸化調控蛋白質活性, 參與多種細胞生命活動。 Saha 等篩選結直腸原發(fā)癌與肝轉移灶的差異表達基因時發(fā)現(xiàn), 正常結直腸組織、 良性腺瘤和結直腸癌原發(fā)灶中,PRL-3 基本不表達或低表達 , 而在肝轉移灶中均高表達 , 因此推測 , 該基因與結直腸癌的轉移相關。 隨后許多學者相繼發(fā)現(xiàn) PRL-3 在乳腺癌、卵巢癌、腸癌、胃癌和肺癌等腫瘤中呈現(xiàn)高表達并與其轉移密切相關。但 P

2、RL-3 的作用底物及分子機制尚不完全清楚。 鑒定出 PRL-3 底物對于理解它們在腫瘤演進中的作用以及作為腫瘤治療的新靶點是很重要的。 VEGF是促進血管形成 , 增強血管內皮細胞增殖和遷移能力的重要介質。VEGF家族的 VEGF-C與其受體 VEGFR-3結合后 , 誘導淋巴管內皮細胞增殖, 促進淋巴管形成。VEGF和 VEGF-C在腫瘤血管形成和淋巴管形成過程中其重要作用。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn) :PRL-3 在 NSCLC組織中存在高表達且與VEGF和 VEGF-C的表達以及與 NSCLC組織的 MVD和 LVD數(shù)目呈正相關。我們推測 PRL-3可能通過促進 VEGF、VEGF-C表達分

3、別誘導肺癌組織微血管、淋巴管形成 , 促進肺癌血行和淋巴結的轉移。已有實驗證實ERK1/2磷酸化為p-ERK,可以促進 VEGF基因轉錄 , 調控血管形成。我們探討 PRL-3是否通過 ERK1/2磷酸化 , 從而促進 VEGF、VEGF-C表達。材料和方法 1、細胞培養(yǎng)肺腺癌A549細胞在含 10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液中貼壁生長 ,37 ,5%CO2條件下培養(yǎng)。待細胞至對數(shù)生長期呈單層亞融合狀態(tài),加入含不同處理因素的培養(yǎng)液, 在不同時間點收取細胞。2、方法 2.1 WesternBlot 法 : 在收集的細胞或組織內加入裂解液充分裂解, 低溫高速離心 , 提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為

4、 60ug。電泳（ 12%SDS-PAGE凝膠）、轉印（ 50V,120min）、 5%正常小牛血清封閉 , 一抗 ERK1/2（1:200 ）、p-ERK（ 1:200 ）, -actin （1:200 ）,VEGF（ 1:100 ）、VEGF-C（1:200 ） ,4 孵育過夜 , 分別與各自對應的二抗（ 1:2500,chemicon,USA ）室溫孵育 2h,DAB顯色 , 結果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀（ Chemi Imager 5500,Alpha Innotech,USA ）采集 , 進行灰度值測定。2.2 細胞遷移和侵襲能力檢測在 transwell 小室（ Corning 公

5、司）下室加入 600ul含 10%小牛血清 DMEM培養(yǎng)基 , 上室中加入 100ul 無血清 DMEM培養(yǎng)基 , 接種 A549細胞數(shù)為 2.5 ×10⁴個。37、5%C0₂孵箱中培養(yǎng) 6hr 后吸盡培養(yǎng)基 ,PBS 清洗后 , 甲醇室溫固定 15min, 用棉簽輕擦掉微孔膜上表面的細胞, 蘇木素染色 , 室溫干燥過夜。取下微孔膜 , 置載玻片上 , 鏡下觀察。細胞侵襲能力的測定用預冷的無血清培養(yǎng)基以 1:7 稀釋 Matrigel （BDBiosciences,USA ）加入上室 100u

6、l, 在室溫下放置 6h。使用前用培養(yǎng)基重新水化并吸凈 , 其他與遷移實驗相同 , 培養(yǎng) 18hr 后觀察結果。2.3 逆轉錄 - 聚合酶鏈式反應（RT-PCR）: 提取細胞總 RNA,按 RT-PCR（TaKaRa）試劑盒方法進行反應。 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳進行檢測, 采用凝膠成像分析系統(tǒng)進行半定量分析。2.4 MTT法測定細胞增殖率的變化, 以不含細胞的等體積培養(yǎng)基作對照, 重復3 次 , 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。流式細胞儀檢測細胞凋亡率, 重復 3 次取均值。細胞免疫熒光染色 , 觀察 VEGF（1:100 ）、VEGF-C（1:200 ）、ERK1/2（1:200 ）、p-ERK（

7、1:200 ）的定位及表達強度。3、統(tǒng)計學分析采用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件 ,P<0.05為有統(tǒng)計學意義。結果 1、阻斷 PRL-3能抑制 VEGF、VEGF-C的表達 , 抑制 ERK1/2磷酸化可下調 VEGF。用 PRL-3 抗體封閉 PRL-3 24h 后 , 細胞免疫熒光檢測結果顯示p-ERK、VEGF和VEGF-C的表達均降低。我們進一步用 Western 和 RT-PCR檢測加入 PRL-3 抗體（ 100ng/mL）封閉后0h,1h,2h,4h,8h,24h,發(fā)現(xiàn) VEGF和 VEGF-C的 mRNA和蛋白表達隨封閉時間延長而逐漸下調。加入PRL-3 抗體封閉

8、 PRL-3 后 p-ERK蛋白表達逐漸下調 , 而 ERK1/2表達基本不變。 為了深入探討PRL-3調控 VEGF和 VEGF-C的機制 , 我們用 ERK1/2抑制劑 PD98059（20nmol/mL）培養(yǎng) A549細胞。結果顯示 , 加入 ERK1/2抑制劑 PD98059（20nmol/mL）后 VEGF的 mRNA和蛋白表達隨時間延長明顯下調, 但是 VEGF-C的表達基本保持不變。 2、阻斷 PRL-3、ERK1/2能抑制肺腺癌 A549細胞遷移和侵襲能力。 細胞遷移能力測定實驗結果顯示 , 加入 PRL-3 抗體組肺腺癌 A549 細胞的細胞穿透數(shù)目 （ 17.67 

9、7;2.46 ）, 與未加入 PRL-3 抗體組（ 37.465 ±5.32 ）相比明顯減少 , 差異有統(tǒng)計學意義（ t=4.236,P<0.001 ） ; 加入 ERK1/2 抑制劑 PD98059組肺腺癌 A549 細胞的細胞穿透數(shù)目（ 20.54 ± 3.77 ） , 與對照培養(yǎng)組相比 , 差異有統(tǒng)計學意義（ t=3.996,P<0.001 ）?；|膠侵襲實驗結果顯示, 加入 PRL-3抗體組肺腺癌 A549細胞的細胞穿透數(shù)目（8.546 ±1.64 ）, 與對照培養(yǎng)組（ 27±3.325 ）相比明顯減少 , 差異有統(tǒng)計學意義（ t=7.295,P<0.001）; 加入 ERK1/2抑制劑 PD98059組肺腺癌 A549 細胞的細胞穿透數(shù)目（ 13.875 ± 2.9 ）, 與對照培養(yǎng)組相比明顯減少, 差異有統(tǒng)計學意義（ t=4.52,P<0.001）。3、阻斷 PRL-3 對肺腺癌 A549 細胞增殖和凋亡無明顯影響。MTT法測定結果顯示 , 用 PRL-3 抗體培養(yǎng)的肺腺癌A549 細胞與對照細胞相比無明顯差異（ P>0.05 ）。流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期結果顯示, 用 PRL-3 抗體培養(yǎng)的肺腺癌A549細胞與對照