細菌內(nèi)毒素檢驗操作程序

1、標題：細菌內(nèi)毒素檢測操作程序編號：S0P-QM-243-B頁碼：1/9制定人：審核人：批準人：頒發(fā)部門：日期：日期：日期：生效日期：分發(fā)部門：品質(zhì)部、中心化驗室、過程分析室LI的：規(guī)范細菌內(nèi)毒素檢驗操作程序。范圍：適用于細菌內(nèi)毒素檢查操作。責任：品質(zhì)部組織制定，中心化驗室負責實施。內(nèi)容1準備工作實驗設備及用具1.1.1 刻度吸管、稱量瓶、銀子、安瓶瓶（2ml、5M）x藥匙、250烘烤1小時。1.1.2 干燥箱、恒溫水浴鍋、漩渦混合器、精密天平。1.1.3 剪刀、砂輪片、醫(yī)用膠布、洗耳球、試管架、脫脂棉球、水銀溫度汁、試管內(nèi)毒素標準品與實驗試劑1.2.1堂試劑：在使用前應進行靈敏度測定，原則上購

2、進一個批號測定一次。1.2.2細菌內(nèi)毒素檢查用水（內(nèi)毒素含量mL滅菌注射用水）。1.2.3細菌內(nèi)毒素國家標準品和工作標準品。75%乙醇、輅酸洗液。實驗用具的消毒處理：凡是參與實驗樣品或試劑接觸的器具，在實驗前必須經(jīng)除細菌內(nèi)毒素處理，將洗凈的器具經(jīng)純化水沖洗后，在250干熱滅菌至少60分鐘。恒溫水浴箱內(nèi)水浴溫度調(diào)節(jié)到37±1o2鯊試劑靈敏度復核根據(jù)登試劑靈墩度的標示值（如：.X=EU/ml）,細菌內(nèi)毒素工作標準品加入1ml細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在漩渦混合器上混勻15分鐘。將工作標準品制備成2人、入、入、入四個濃度（EU/mlsEU/ml、EU/mi、EU/ml）的內(nèi)毒素標準溶液，備用

3、。山東天力藥業(yè)有限公司標題：細菌內(nèi)毒素檢測操作程序編號:SOP-QM-243-B頁碼：2/9例：工作標準品為160EU/ml時160EUini6EU/ml.8EU.ini.1EU/in!iniml標準品溶液fmlml注惠.土禹釋一步均應孔3I忌上混勻30秒。取18支EU/ml試劑，每支中加入水，然后分別加入中制備好的4個濃度的標準液，按濃度從高到低依次加入，每個濃度加4支，；最后2支加入水作陰性對照。將上述試管用醫(yī)用膠布封口，垂直放入37°C±rC水浴鍋中，保溫60±2分鐘。放入水浴前把水攪動兒下，以使水溫均勻。再次檢查溫度是否在所要求的范圍，注意保溫和取放過程應

4、避免受到振動造成的假陰性結果。保溫結束后將試管輕輕取出，緩緩轉(zhuǎn)到180。，若關內(nèi)形成凝膠，不變形、不從管壁滑落者為陽性；未形成凝膠或形成凝膠變形從壁滑落者為陰性。（注意：保溫盒拿取試管過程應避免受到震動而造成的假陰性結果）結果判定當最大濃度2人4支管均為陽性，最低濃度人4支管均為陰性，陰性對照2支管為陰性，實驗方有效。如圖12 AX0.5J J o o o o © o人。0.25人勰J J o o o o山東天力藥業(yè)有限公司標題：細菌內(nèi)毒素檢測操作程序編號:SOP-QM-243-B頁碼：3/9按下述公式計算反應終點濃度的兒何平均值，即為強試劑靈敬度的測定值xco當Ac在X-2X時，方

5、可用于細菌內(nèi)毒素的檢查，并以標示靈敬度人為該批鯊試劑的靈敬度。Xc 二 antilg（工式中：X為反應終點濃度的對數(shù)值1g。反應重點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度。anti1g是1g函數(shù)的反函數(shù)，在excel里可以用power公式，power(數(shù)值)舉例設待復核強試劑的靈敬度為EU/ml,即EU/mlo實驗結果如下：內(nèi)毒素濃度(EU/ml)Nc反應終點濃度X1+山東天力藥業(yè)有限公司標題：細菌內(nèi)毒素檢測操作程序編號:SOP-QM-243-B頁碼：4/9則：入c=antilg(EX/4)=antilg(+)/4=antiIgtantilg=(EU/ml)Ac在X-2X范圍內(nèi)

6、，符合規(guī)定。結果不是內(nèi)毒素最大濃度(2X)4管全部陽性，最小濃度(人)4管全部陰性，本批鯊試劑不能使用。需查找原因，可能是靈敏度標示不準確或內(nèi)毒素效價標示不準確，或操作不當所致。3.干擾實驗干擾試驗的口的是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和登試劑的反應不存在干擾作用，為能否使用細菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。制備內(nèi)毒素標準對照溶液取1支細菌內(nèi)毒素標準品，用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成4個濃度的標準溶液即入、X、入、才。制備含內(nèi)毒素的供試品溶液將供試品稀釋至預實驗中確定的不干擾稀釋倍數(shù)，再用此稀釋液將中的同支細菌內(nèi)毒素標準品稀釋成4個濃度即X、入、X、入的含內(nèi)毒素的供試品溶液。強試劑的準備取規(guī)格

7、為支的強試劑36支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。若待復核生:試劑的規(guī)格不是支時，按其標示量加入檢查用水復溶，將復溶后的強試劑帑液混和在一起,然后每分裝到10X75nlm凝集管中，要求至少分裝36管備用。凝膠反應山東天力藥業(yè)有限公司標題：細菌內(nèi)毒素檢測操作程序|編號：S0PQM-243B|頁碼：5/9將準備好的鯊試劑18支（管）放在試管架上，排成5歹II，4歹IJ4支（管人1歹IJ2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入的入、入、入、入的內(nèi)毒素標準對照液，另一

8、列2支（管）加入檢查用水作為陰性對照。將另外18支（管）宿:試劑放在試管架上，排成5歹U，4歹U4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入的X、入、X、X的內(nèi)毒素的含供試品溶液；另一列2支（管）加入供試品溶液作為樣品陰性對照，如表1所示。加樣結束后，用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，兩同試管架放入37°c±rc水浴或適宜恒溫器中，保溫60±2分鐘后，觀察并記錄結果。表1凝膠法干擾試驗溶液的制備編號內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液2B2X/供試品溶液供試品溶液1242IX44X48X4C2

9、人/檢查用水檢查用水12X421X44X48X4D無/檢查用水2注：A為供試品溶液；B為干擾試劑系列；C強試劑標示靈敬度的對照系列；D為陰性對照。山東天力藥業(yè)有限公司標題：細菌內(nèi)毒素檢測操作程序編號:SOP-QM-243-B頁碼:6/9判定并計算C和B的反應終點濃度的集合平均值（Es和Et）只有當溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結果在鯊試劑靈敬度復核范圍內(nèi)時，試驗方為有效。按下式計算系列溶液C和B的反應終點濃度的兒何平均值（Es和Et）:Es=anti1g（EXs/4）Et=antilg（LXt/4）式中Xs、Xt分別為系列溶液C和溶液B的反應終點濃度的對數(shù)值（1g

10、）。當Es在入2X（包括X和2X）及Et在2Es（包括和2Es）時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗?？赏ㄟ^對供試品進行更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內(nèi)毒素失去活性，要使用預先添加了標準內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品洛液進行干擾試驗。當進行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前，或無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法時，須進行干擾試驗。當鯊試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結果的變化

11、時，須重新進行干擾試驗。3供試品細菌內(nèi)毒素檢查凝膠限度試驗要求：在細菌內(nèi)毒素檢查中，每批供試品必須做2支供試品和2支供試品陽性對照，同時每次試驗必須做2支陽性對照和2支陰性對照。4.1.1因藥典對甘露醇原料藥內(nèi)毒素無要求，參照甘露醇注射液內(nèi)毒素限值，每1g甘露醇中含內(nèi)毒素的量應小于。根據(jù)MVD二CL/入，且當供試品為注射用原料藥時，MVD取1。故20%甘露醇注射液的工試劑限度為：Xmixg二ml操作方法4. 2.1供試品溶液的制備標題：細菌內(nèi)毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243-B頁碼:7/9準確稱取I寸露醇用E1BET水落解，制成20%H-露醇溶液。根據(jù)MVD二CL/X,將供試品進行稀

12、釋，其稀釋倍數(shù)不得超過MVD。式中：C為供試品濃度。L為供試品的細菌內(nèi)毒素限值。X為在凝膠法中登試劑的標示靈敬度。例：當用標示值為ml靈敏度的黨:試劑時，MVD二CL/A-20%X二1（倍），所以把供試品制成20%的稀釋液即可。 當用標示值為ml靈敬度的強試劑時，MVD二CL/X二20%X二2（倍），所以把供試品制成10%的稀釋液即可。 當用標示值為ml靈墩度的強試劑時，MVD二CL/人二20%X二4（倍），所以把供試品制成5%的稀釋液即可。陽性對照溶液的制備用檢查用水將內(nèi)毒素標準品稀釋制成2X濃度的內(nèi)毒素標準溶液。取規(guī)格為10EU的細菌內(nèi)毒素標準品一支用酒精棉球?qū)⑵款i消毒后開啟，加BET檢查

13、用水混合15分鐘后備用。例：當用標示值為ml靈敬度的強試劑時，2A二ml,（10EU/inl標準品溶液）ml標準品溶液）1OEU/mlA1. OEU/mlml標準品溶液例：當用標示值為ml靈敬度的登試劑時，2X=ml,（lOEU/ml標準品溶液）ill標準品溶液）ml標準品涪液）10EU/inl>1.OEV/mlini標準品溶液山東天力藥業(yè)有限公司標題：細菌內(nèi)毒素檢測操作程序I編號：S0P-QL243-BI頁碼：8/9供試品陽性對照溶液的制備用待檢測的供試品溶液或其稀釋液將內(nèi)毒素標準品制成2X濃度的內(nèi)毒素溶液。例：當用標示值為ml靈敬度的蚩試劑時,2X=ml,vlOEU/nl標HE品涪液

14、ml標準品溶液）1OEU/mlml供試品陽性對照溶液l.OEU/inl標準品溶液,（20%供試品溶液）（20%供試品溶液）例：當用標示值為ml靈墩度的強試劑時，2人二ml,（lOEU/ml標準品溶液）nil標準品溶液）ml標準品涪液）標準品溶液（10%供試品溶液）（10%供試品溶液）（10米供試品涪液）si iRiAnn陽桂加昭溶游陰性對照液即細菌內(nèi)毒素檢查用水4.5.1鯊試劑的準備取規(guī)格為的登試劑8支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后開啟備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入檢查用水溶解。4.5.2加樣取8支2.2.5溶解好的鯊試劑，其中2支加入供試品溶液，作為供試品管；2支加入陽性對照溶液，作為陽性對照管（PC）；2支加入供試品陽性對照溶液，作為供試品陽性對照管（PPC）；2支加入檢查用水作為陰性對照管（NC）。試驗加樣如：（單位ml）參照管試劑'供試品管陽性對照PC供試品陽性對照PPC陰性對照NC12121212化:試劑山東天力藥業(yè)有限公司標題：細菌內(nèi)毒素檢測操作程序編號:SOP-QM-243-B頁碼9/9供試品液BET用水供試品陽性對照液陽性對照液4.5.3將試管中溶液輕輕混勻后，用封口膜封閉管口，垂直放入37°C