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文檔簡介

1、分子生物學(xué)實驗思考題答案實驗一、基因組DNA的提取1、 為什么構(gòu)建DNA文庫時,一定要用大分子DNA? 答、文庫的大小(即數(shù)目)取決于基因組的大小和片段的大小,片段大則文庫數(shù)目小一些也可以包含99%甚至以上的基因組。而文庫數(shù)目小則方便研究人員操作和文庫的保存。所以構(gòu)建文庫要用攜帶能力大的載體克隆盡量大的DNA片段.2、如何檢測和保證DNA的質(zhì)量? 答、用凝膠電泳看,有沒有質(zhì)白質(zhì)和RNA等物質(zhì)的污染,還可以測OD,用OD260/280來判斷, 當(dāng)OD260/OD280< 1.8,表示蛋白質(zhì)含量較高 當(dāng)OD260/OD280> 2.0,表示RNA含量較高 當(dāng)OD260/OD280=1.

2、82.0,表示DNA較純。實驗二、植物總RNA的提取1、 RNA酶的變性和失活劑有哪些?其中在總RNA的抽提中主要可用哪幾種? 答、有DEPC,Trizol,氧釩核糖核苷復(fù)合物,RNA酶的蛋白抑制劑以及SDS,尿素,硅藻土等;在總RNA提取中用PEPC,Trizol 2、 怎樣從總RNA中進(jìn)行mRNA的分離和純化。 答、利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特點合成一段oligo(dT)的引物,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則,可將mRNA從總RNA中分離出來 實驗四、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1、 感受態(tài)細(xì)胞制備過程中應(yīng)該注意什么? 答、A)細(xì)菌的生長狀態(tài):不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于4的培養(yǎng)菌,最好從-

3、80甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時為宜,可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5菌株的OD600為0.5時,細(xì)胞密度在5×107 個/mL左右,這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。 B)所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行;實驗操作時要格外小心,懸浮細(xì)胞時要輕柔,以免造成菌體破裂,影響轉(zhuǎn)化。 C)經(jīng)CaCl2處理的細(xì)胞,在低溫條件下,一定的時間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時間的推移而增加,24小時達(dá)到最高,之后轉(zhuǎn)化率再下降(這是由于總的活菌數(shù)隨時間延長而減少造成的); D) 化合物及無機(jī)離子的影響:在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價金屬離子(如

4、Mn2+或 Co2+)、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌,可使轉(zhuǎn)化效率大大提高(100-1000倍); E)所使用的器皿必須干凈。少量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率;2、 感受態(tài)細(xì)胞制備可用在哪些研究和應(yīng)用領(lǐng)域? 答、在基因工程中將質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞是如果受體細(xì)胞是細(xì)菌則將它用Ca2+處理變?yōu)楦惺軕B(tài)細(xì)胞質(zhì)粒進(jìn)入。實驗五、質(zhì)粒在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化和鑒定1、 在熱激以后進(jìn)行活化培養(yǎng),這時的培養(yǎng)基中為什么不加入抗生素? 答、活化培養(yǎng)用的一般是SOC培養(yǎng)基,這種培養(yǎng)基比LB培養(yǎng)基營養(yǎng),此時進(jìn)行的活化培養(yǎng)只是為了讓大腸桿菌迅速復(fù)蘇,恢復(fù)分裂活性,此時的細(xì)胞還不具抗性,加入抗生素會細(xì)胞會

5、死亡。2、 什么是質(zhì)粒?根據(jù)在細(xì)菌中的復(fù)制,質(zhì)粒有幾種類型?用于基因重組的主要用到哪些質(zhì)粒? 答、質(zhì)粒是細(xì)菌體內(nèi)的環(huán)狀DNA分子。質(zhì)粒也是作為細(xì)菌遺傳載體的一部分,但通常其攜帶的基因?qū)?xì)菌而言必要性要比核內(nèi)DNA的小很多。比如,抗性基因,熒光蛋白基因等等。 根據(jù)質(zhì)粒隨細(xì)胞分裂而分裂的次數(shù),將其分為兩類:一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒,當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時,質(zhì)粒也復(fù)制一次,每個細(xì)胞內(nèi)只有12個質(zhì)粒;另一類是松弛型質(zhì)粒,當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制,每一個細(xì)胞內(nèi)一般有20個左右質(zhì)粒。 常用于基因重組的質(zhì)粒是pBR322質(zhì)粒,因為其基因測序已經(jīng)完成,而且它攜帶了兩個標(biāo)記基因,一個是氨芐青霉素抗性基因Apr,

6、另一個是四環(huán)素抗性基因Tetr。實驗六、質(zhì)粒DNA的分離純化和鑒定1、在實驗過程中,加入的EDTA、SDS分別起什么作用? 答、EDTA可以結(jié)合DNA酶等,可以抑制其活性;SDS主要是裂解細(xì)菌和沉淀蛋白。2、 乙酸鉀在實驗過程中主要起什么作用? 答、主要是在分離過程中起著中和PH的作用,DNA經(jīng)堿(NaoH)裂解后,染色體DNA氫鍵斷裂,雙螺旋解開,質(zhì)粒DNA氫鍵斷裂,互補(bǔ)鏈不能完全分離,再經(jīng)乙酸鉀中和成中性后則復(fù)性離心就可以達(dá)到分離的效果。3、 氯仿在核酸的提取過程中有何作用? 答、克服酚的特點,加速有機(jī)層和液相的分層。最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中跡量酚。4、 本實驗整個過程中應(yīng)該注意些什

7、么? 答、1、提取過程應(yīng)盡量保持低溫; 2、提取質(zhì)粒DNA過程中除去蛋白質(zhì)很重要,采用酚、氯仿去除蛋白質(zhì)要比單獨(dú)用酚或者氯仿要好,要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。 3、沉淀DNA一般使用冰乙醇,在低溫條件下放置時間稍長可以使沉淀完全。沉淀DNA也可以使用異丙醇(一般使用等體積),且沉淀完全,速度快,但常把鹽沉淀,所以多數(shù)還是用乙醇。實驗七、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一般原理和技術(shù)1、 降低退火溫度對反應(yīng)有何影響? 答、變性所需的加熱溫度取決于模板及 PCR 產(chǎn)物雙鏈 DNA 中的 G+C 含量。 雙鏈 DNA 中的 G+C 的比率越高,則雙鏈 DNA 分離變性的溫度也就越高。變性所需的時間與 DNA 分子的

8、長度 相關(guān),DNA 分子越長,在特定的變性溫度下使雙鏈 DNA 分子完全分離所需的時間就越長。 若變性溫度太低或變性時間太短,則只能使 DNA 模板中富含 AT 的區(qū)域產(chǎn)生變性,當(dāng) PCR 循環(huán)中的反應(yīng)溫度降低時,部分變性的 DNA 模板又重新結(jié)合成雙鏈 DNA,從而導(dǎo)致 PCR 的失敗。非特異性條帶數(shù)增多。2、 PCR 循環(huán)次數(shù)是否越多越好?為何? 答、循環(huán)次數(shù)越多,非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。3、 PCR技術(shù)可應(yīng)用與哪些方面?舉例。 答、1、核酸的基礎(chǔ)研究:基因組克隆 2、 不對稱PCR制備單鏈DNA用于DNA測序 3、反向PCR測定未知DNA區(qū)域 4、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA 5、熒光定量PCR用于對PCR產(chǎn)物實時監(jiān)控6、cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù) 7、檢測基因的表達(dá) 8、醫(yī)學(xué)應(yīng)用:檢測細(xì)菌、病毒類疾??;診斷遺傳疾?。辉\斷腫瘤;應(yīng)用于法醫(yī)物證學(xué)實驗八、DNA的限制性內(nèi)切酶酶切和鑒定1、寫出ECORI和Hind3兩種內(nèi)切酶消化產(chǎn)物的末端序列。 答、GAATTC EcoRI的識別序列和切割位點,粘性末端即:AATTC- CTTAAG G- Hind的識別序列為:AAGCTT “”為切割位點,黏性末端為:AGCTT- A-2、 什么

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