免疫細(xì)胞功能檢測(cè)技術(shù)

1、第十五章免疫細(xì)胞功能檢測(cè)技術(shù)免疫細(xì)胞是指參加機(jī)體免疫應(yīng)答的細(xì)胞，大致可分為兩類，一類能識(shí)別特異性抗原，一旦被激活則顯示出特異性應(yīng)答的功能，主要指淋巴細(xì)胞群，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、K細(xì)胞等；另一類能捕獲抗原，處理抗原，以肯定方式提呈給淋巴細(xì)胞或表現(xiàn)其他免疫功能，包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等。測(cè)定這些細(xì)胞功能可以有效評(píng)價(jià)機(jī)體特異性和非特異性免疫功能。第一節(jié)淋巴細(xì)胞的功能檢測(cè)淋巴細(xì)胞功能測(cè)定可分為體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)。體內(nèi)試驗(yàn)主要是進(jìn)行遲發(fā)型超敏反應(yīng)，借此間接了解淋巴細(xì)胞對(duì)抗原、半抗原或有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)；體外試驗(yàn)主要包括淋巴細(xì)胞對(duì)抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應(yīng)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)及淋

2、巴細(xì)胞分泌產(chǎn)物的測(cè)定。一、T細(xì)胞功能檢測(cè)T細(xì)胞具有多種免疫生物學(xué)功能，如直接殺傷靶細(xì)胞、幫助或抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，對(duì)特異性抗原或絲裂原刺激產(chǎn)生增殖反應(yīng)及產(chǎn)生各種細(xì)胞因子。據(jù)此，建立了一系列檢測(cè)T細(xì)胞功能的體內(nèi)和體外試驗(yàn)。（一）T細(xì)胞增殖試驗(yàn)1.原理：T細(xì)胞在體外受到有絲分裂原或抗原的刺激后，細(xì)胞增殖，并轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞。因此，淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)又稱淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。2.刺激物：植物血凝素（PHA）、刀豆素A（ConA）和美洲商陸（PWM）、白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、純化蛋白衍生物（PPD）和白色念珠菌等。3.方法學(xué)：檢測(cè)T細(xì)胞增殖反應(yīng)的方法有：（1）形態(tài)學(xué)檢查法：運(yùn)用一般光學(xué)顯微鏡，簡(jiǎn)便易行。缺點(diǎn)

3、是依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)變化，推斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復(fù)性和精確性較差。（2）3H-TdR摻入法：敏感性高，客觀性強(qiáng)，重復(fù)性好，但需肯定設(shè)備條件，及存在放射性核素污染問題。（3）MTT比色法：本方法的敏感性雖不及3H-TdR摻入法，但操作簡(jiǎn)便，無放射性污染。較常接受。（二）T細(xì)胞分泌功能測(cè)定體外培育的T細(xì)胞經(jīng)各種絲裂原或抗原刺激后，分泌各種細(xì)胞因子，可借助免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)通過對(duì)于T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的含量、生物學(xué)活性和基因表達(dá)水平，以反映T細(xì)胞功能。（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)常選用可傳代的已建株的人腫瘤細(xì)胞，與待檢淋巴細(xì)胞混合，觀察腫瘤細(xì)胞殺傷的情況。是評(píng)價(jià)機(jī)體細(xì)胞免疫水平的

4、常用指標(biāo)，特別是測(cè)定腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，常作為推斷預(yù)后和觀察療效的指標(biāo)之一。（四）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)正常機(jī)體對(duì)某種特別抗原建立了細(xì)胞免疫后，如用相同的抗原做皮膚試驗(yàn)，?？上ш栃缘倪t發(fā)型超敏反應(yīng)。目前臨床上常用于診斷某些病原微生物感染（結(jié)核、麻風(fēng)等）和細(xì)胞免疫缺陷等疾病，也常用于觀察細(xì)胞免疫功能在治療過程中的變化及推斷預(yù)后等。1.特異性抗原皮膚試驗(yàn)：常用的特異性抗原皮膚試驗(yàn)為結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)。其他皮試抗原還有白色念珠菌素、皮膚毛癬菌素、腮腺炎病毒等。受試者對(duì)所試抗原過去的致敏情況直接影響試驗(yàn)結(jié)果。若受試者從未接觸過該抗原，則不會(huì)消失陽性反應(yīng)，因此陰性者也不肯定表明細(xì)胞免疫功能低下。為避開推

5、斷錯(cuò)誤，往往需用兩種以上抗原進(jìn)行皮試，綜合推斷結(jié)果。2.PHA皮膚試驗(yàn)：將定量PHA注射到受試者前臂皮內(nèi)，可非特異性刺激T細(xì)胞發(fā)生母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，呈現(xiàn)以單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎性反應(yīng)。PHA皮膚試驗(yàn)敏感性高，比較平安牢靠，臨床常用于檢測(cè)機(jī)體的細(xì)胞免疫水平。二、B細(xì)胞功能檢測(cè)B細(xì)胞主要產(chǎn)生Ig參加機(jī)體體液免疫應(yīng)答，B細(xì)胞功能低下或缺乏者對(duì)外源性抗原刺激的應(yīng)答能力減弱或缺陷，特異性抗體產(chǎn)生削減或缺如。因此，B細(xì)胞功能試驗(yàn)方法有受試者血清Ig含量檢測(cè)和體外B細(xì)胞增殖和產(chǎn)生抗體能力檢測(cè)等。（一）B細(xì)胞增殖試驗(yàn)：原理與T細(xì)胞增殖試驗(yàn)相同，但刺激物不同，小鼠B細(xì)胞可用細(xì)菌脂多糖（LPS）作為刺激物，人則用含SP

6、A的金黃色葡萄球菌菌體及抗IgM抗體等刺激。（二）溶血空斑試驗(yàn)1.原理：將SRBC免疫的小鼠脾臟（或家兔淋巴結(jié)）制成單個(gè)細(xì)胞懸液，與SRBC在瓊脂糖凝膠內(nèi)混合后傾注于小平皿或玻片上。脾細(xì)胞中的抗體生成細(xì)胞釋放抗SRBC抗體，使其周圍的SRBC致敏，在補(bǔ)體參加下可將SRBC溶解，形成肉眼可見的溶血空斑。每一個(gè)空斑中央含一個(gè)抗體形成細(xì)胞，空斑數(shù)目即為抗體形成細(xì)胞數(shù)。空斑大小表示抗體形成細(xì)胞產(chǎn)生抗體的多少。2.方法學(xué)（1）經(jīng)典溶血空斑形成試驗(yàn)：用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抗體形成細(xì)胞的功能?？煞譃橹苯臃ê烷g接法。直接法所測(cè)到的細(xì)胞為IgM類抗體形成細(xì)胞，其他類型的Ig由于溶血效應(yīng)較低，不能直接檢測(cè)；間接法，即在

7、小鼠脾細(xì)胞和SRBC混合時(shí)，再加抗鼠Ig抗體（如兔抗鼠Ig），使抗體產(chǎn)生細(xì)胞所產(chǎn)生的IgG或IgA與抗Ig抗體結(jié)合成復(fù)合物,此時(shí)能活化補(bǔ)體導(dǎo)致溶血。上述直接法和間接法都只能檢測(cè)抗RBC抗體的產(chǎn)生細(xì)胞，而且需要事先免疫，難以檢測(cè)人類的抗體產(chǎn)生情況。（2）被動(dòng)溶血空斑試驗(yàn)：是指抗體形成細(xì)胞產(chǎn)生的Ig與SRBC上的抗原結(jié)合，在補(bǔ)體參加下消失溶血反應(yīng)。方法是將吸附有已知抗原的SRBC、待檢B細(xì)胞、補(bǔ)體及適量瓊脂糖液混合，傾注平皿，溫育13小時(shí)后，形成肉眼可見的溶血空斑。這種非紅細(xì)胞抗體性溶血空斑試驗(yàn)可檢測(cè)SRBC上抗原相應(yīng)的抗體形成細(xì)胞，因此應(yīng)用范圍較廣3.臨床應(yīng)用與評(píng)價(jià)：溶血空斑試驗(yàn)主要用于測(cè)定藥物

8、和手術(shù)等因素對(duì)體液免疫功能的影響，評(píng)價(jià)免疫治療或免疫重建后機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力。（三）酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）1.原理：用抗原包被固相載體，加入待檢的抗體產(chǎn)生細(xì)胞，即可誘導(dǎo)抗體的分泌。分泌的抗體與包被抗原結(jié)合，在抗體分泌細(xì)胞周圍形成抗原抗體復(fù)合物，使細(xì)胞吸附于載體上，加入酶標(biāo)記的其次抗體與細(xì)胞上的抗體結(jié)合，通過底物顯色反應(yīng)的深淺，可測(cè)定誕生成的抗體量，并可在鏡下計(jì)數(shù)著色的斑點(diǎn)形成細(xì)胞。2.應(yīng)用與方法學(xué)評(píng)價(jià)該方法既可檢測(cè)抗體分泌細(xì)胞，又可檢測(cè)抗體分泌量。其優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時(shí)檢測(cè)不同抗原誘導(dǎo)的不同抗體分泌，并可定量；可檢測(cè)組織切片中分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞。（四）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)B細(xì)胞

9、功能減低或缺陷，可表現(xiàn)為體內(nèi)Ig和血型抗體量下降或缺如。常用于體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、多價(jià)肺炎鏈球菌菌苗等。將適量抗原皮下或肌內(nèi)注射免疫，并于免疫前及免疫后1、2、3周分別采血，分離血清，測(cè)定受檢者免疫前后相應(yīng)抗體的效價(jià)，推斷受檢者體內(nèi)B細(xì)胞的功能。三、NK細(xì)胞活性測(cè)定NK細(xì)胞具有ADCC，能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，故將單個(gè)核細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共同培育，腫瘤細(xì)胞存活率低，NK細(xì)胞的活性則高。測(cè)定人NK細(xì)胞活性的靶細(xì)胞多用K562細(xì)胞株，而測(cè)定小鼠NK細(xì)胞活性則常接受YAC-1細(xì)胞株。體外檢測(cè)NK細(xì)胞活性的方法有形態(tài)學(xué)法、酶釋放法、放射性核素釋放法、化學(xué)發(fā)光法、流式細(xì)胞術(shù)法等。

10、其次節(jié)吞噬細(xì)胞功能檢測(cè)技術(shù)大吞噬細(xì)胞：包括血液中的大單核細(xì)胞及其進(jìn)入各種組織后發(fā)育而成的巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等。功能：非特異性地吞噬殺滅病原體、年輕病殘和突變的細(xì)胞；在特異性免疫形成過程中，參加抗原識(shí)別和遞呈，生成多種細(xì)胞因子，參加遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和多種自身免疫性疾病的病理損傷。小吞噬細(xì)胞：中性粒細(xì)胞。功能：以吞噬功能為主，發(fā)揮非特異性免疫防疫作用并參加機(jī)體的免疫應(yīng)答炎癥損傷等。吞噬細(xì)胞的吞噬活動(dòng)大體分為趨化、吞噬和胞內(nèi)殺滅作用三個(gè)階段，據(jù)此建立相應(yīng)的檢測(cè)方法。一、中性粒細(xì)胞功能檢測(cè)（一）趨化功能檢測(cè)1.原理：中性粒細(xì)胞在趨化因子如微生物的細(xì)胞成分及其代謝產(chǎn)物、補(bǔ)體活性片段（C5a、C3a）、某

11、些細(xì)胞因子等作用下產(chǎn)生趨化運(yùn)動(dòng)，其趨化運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度可反映中性粒細(xì)胞的趨化功能。2.方法學(xué)：（1）濾膜滲透法（Boyden小室法）；（2）瓊脂糖平板法。（二）吞噬和殺菌功能測(cè)定1.顯微鏡檢查法：將白細(xì)胞與葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合溫育，涂片，固定，堿性亞甲藍(lán)液染色。油鏡下計(jì)數(shù)吞噬細(xì)菌和未吞噬細(xì)菌的白細(xì)胞數(shù)。對(duì)有吞噬作用的白細(xì)胞，應(yīng)同時(shí)記錄所吞噬的細(xì)菌數(shù)。2.溶菌法：將白細(xì)胞懸液與經(jīng)新奇人血清調(diào)理過的細(xì)菌（大腸桿菌或金黃色葡萄球菌）按肯定比例混合，溫育。每隔肯定時(shí)間取定量培育物，稀釋后接種固體平板培育基。37培育18小時(shí)后，計(jì)數(shù)生長(zhǎng)菌落數(shù)，以了解中性粒細(xì)胞的殺菌能力。3.硝基四氮唑藍(lán)還原試驗(yàn)（NBT

12、還原試驗(yàn)）。二、巨噬細(xì)胞功能檢測(cè)人巨噬細(xì)胞一般從外周血或經(jīng)斑蝥敷貼形成的皮泡液中獵取，也可從肺泡灌洗液或患者腹膜透析液中分離。實(shí)驗(yàn)室商量中常用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。（一）炭粒廓清試驗(yàn)（二）吞噬功能檢測(cè)巨噬細(xì)胞對(duì)顆粒性抗原物質(zhì)具有很強(qiáng)的吞噬功能，常用雞紅細(xì)胞（CRBC）、白色念珠菌、酵母細(xì)胞等作為吞噬顆粒。將巨噬細(xì)胞與雞紅細(xì)胞懸液在體外混合，溫育，涂片，染色，油鏡下觀察、計(jì)數(shù)，通過計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)來反映巨噬細(xì)胞的吞噬功能，并通過觀察雞紅細(xì)胞的消化程度，推斷巨噬細(xì)胞消化功能。（三）巨噬細(xì)胞溶酶體酶的測(cè)定巨噬細(xì)胞富含溶酶體酶，如酸性磷酸酶、非特異性酯酶和溶菌酶等，測(cè)定這些酶的活性也是衡量巨噬細(xì)胞功能

13、的指標(biāo)之一。（四）細(xì)胞毒作用的測(cè)定（五）巨噬細(xì)胞促凝血活性測(cè)定第三節(jié)免疫細(xì)胞功能檢測(cè)的臨床應(yīng)用免疫細(xì)胞功能檢測(cè)可以反映機(jī)體免疫功能狀態(tài)，同時(shí)還可用于腫瘤、免疫缺陷病等疾病的診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)。如免疫細(xì)胞的功能試驗(yàn)可幫助免疫缺陷病的診斷；腫瘤患者的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)監(jiān)測(cè)有助于了解腫瘤的進(jìn)展與預(yù)后推斷；組織器官移植后對(duì)受者的細(xì)胞免疫學(xué)功能監(jiān)測(cè)則有利于排斥反應(yīng)的早期發(fā)現(xiàn)，以便準(zhǔn)時(shí)實(shí)行有效措施。用斑蝥敷貼法可以從人體組織液中獵取較純的A.巨噬細(xì)胞B.B細(xì)胞C.T細(xì)胞D.粒細(xì)胞E.漿細(xì)胞  正確答案A答案解析人巨噬細(xì)胞一般從外周血或經(jīng)斑蝥敷貼形成的皮泡液中獵取，也可從肺泡灌洗液或患者腹膜透

14、析液中分離。檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)常接受A.NBT還原試驗(yàn)B.殺菌試驗(yàn)C.斑蝥發(fā)泡試驗(yàn)D.趨化試驗(yàn)E.雞紅細(xì)胞吞噬試驗(yàn)  正確答案E答案解析吞噬功能檢測(cè)：巨噬細(xì)胞對(duì)顆粒性抗原物質(zhì)具有很強(qiáng)的吞噬功能，常用雞紅細(xì)胞（CRBC）、白色念珠菌、酵母細(xì)胞等作為吞噬顆粒。將巨噬細(xì)胞與雞紅細(xì)胞懸液在體外混合，溫育，涂片，染色，油鏡下觀察、計(jì)數(shù)，通過計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)來反映巨噬細(xì)胞的吞噬功能，并通過觀察雞紅細(xì)胞的消化程度，推斷巨噬細(xì)胞消化功能。濾膜小室法是檢測(cè)哪種細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)的功能A.巨噬細(xì)胞B.中性粒細(xì)胞C.T細(xì)胞D.B細(xì)胞E.漿細(xì)胞  正確答案B答案解析中性粒細(xì)胞趨化功能檢測(cè)方法學(xué)：濾膜滲透法（Boyden小室法）；瓊脂糖平板法。溶血空斑試驗(yàn)檢測(cè)的是A.T淋巴細(xì)胞B.巨噬細(xì)胞C.NK細(xì)胞D.B淋巴細(xì)胞E.LAK細(xì)胞