包涵體蛋白的純化與復(fù)性

1、1 .菌體的收集和破碎用50ml離心管分別收集誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)物，8000rpm4C離心10min（離心時(shí)間和速度應(yīng)該都不夠）。沉淀用適量的超聲破菌緩沖液重懸?！緜渥ⅰ砍暺凭彌_液：20mmol/LTris-HClpH8.0、0.5mol/LNaCl、1mmol/LEDTA、1mg/mL溶菌酶（暫時(shí)我沒用）重懸后的菌液于冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，其條件為：功率為300W,占空比50%,每個(gè)循環(huán)30s,總時(shí)間20min。破碎后的勻漿，4C、12000rpm離心15min。分別取上清液和沉淀進(jìn)行12%SDS-PAGE分析，確定目的蛋白是否以包涵體的形式表達(dá)。2 .包涵體的處理洗滌：沉淀用適量的包涵體

2、洗滌緩沖液重懸后,攪拌洗滌2030min，于4C,12000rpm離心15min,棄去上清液。重復(fù)一次。再用適量的50mmol/LTrispH8.0溶液洗滌一遍（以去除殘留的EDTA）,于4c12000rpm離心15min,棄去上清液?！緜渥ⅰ堪w洗滌緩沖液（20mmol/LTris-HClpH8.0,0.5mol/LNaCl,2mol/L尿素，2%Triton）2 %TritonX-100溶液：量取2mlTritonX-100（聚乙二醇辛基苯基酸）液，加M緩沖液98ml即可。溶解：沉淀用適量的包涵體溶解緩沖液重懸,室溫?cái)嚢?-6小時(shí)或過夜。12000rpm4C離心15min,收集上清液?！?/p>

3、備注】包涵體溶解緩沖液（即結(jié)合buffer）:20mmol/LTrisHClpH8.0,0.5mol/LNaCl,8mol/L尿素，0.2mmol/LDTT或100mmol/L0-琉基乙醇，2%Triton3 .目的蛋白的純化親和層析基于目的蛋白與固相化的配基特異結(jié)合而滯留，其他雜蛋白會(huì)流過柱子。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）是最常用的親和層析純化標(biāo)簽之一，帶有此標(biāo)簽的重組蛋白可用交聯(lián)谷胱甘肽的層析介質(zhì)純化，但本方法有以下缺點(diǎn)：首先，蛋白上的GST必須能合適的折疊，形成與谷胱甘肽結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)才能用此方法純化；其次，GST標(biāo)簽多達(dá)220個(gè)氨基酸，如此大的標(biāo)簽可能會(huì)影響表達(dá)蛋白的可溶性，使形成包涵

4、體，這會(huì)破壞蛋白的天然結(jié)構(gòu)，難于進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，有時(shí)即便純化后再酶切去除GST標(biāo)簽也不一定能解決問題。另一種可應(yīng)用的親和純化標(biāo)簽是6組氨酸標(biāo)簽，組氨酸的咪嘎側(cè)鏈可親和結(jié)合銀、鋅和鉆等金屬離子，在中性或弱堿性條件下帶組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白與銀柱結(jié)合，在低pH下用咪嘎競爭洗脫。組氨酸標(biāo)簽與GST相比有許多優(yōu)點(diǎn)：首先,由于只有6個(gè)組氨酸，分子量很小，一般不需要用酶切去除；其次，可以在變性條件下純化蛋白，在高濃度的尿素和服中仍能夠保持結(jié)合力；另外6組氨酸標(biāo)簽無免疫原性，重組蛋白可直接用來注射動(dòng)物，也不影響免疫學(xué)分析。雖然有這么多的優(yōu)點(diǎn)，但此標(biāo)簽仍有不足，如目的蛋白易形成包涵體、難以溶解、穩(wěn)定性差及錯(cuò)誤折疊

5、等。銀柱純化時(shí)金屬銀離子容易脫落漏出混入蛋白溶液，不但會(huì)通過氧化破壞目的蛋白的氨基酸側(cè)鏈，而且柱子也會(huì)非特異吸附蛋白質(zhì)，影響純化效果。若目的蛋白可與某種碳水化合物特異結(jié)合，或者需要某種特殊的輔因子，可將該碳水化合物或輔因子固相化制成親和柱，結(jié)合后目的蛋白可用高濃度的碳水化合物或輔因子洗脫。融合蛋白的表達(dá)和純化過程:1 .挑單菌落于3-5ml2YT或LB培養(yǎng)中，37c過夜培養(yǎng)。2 .按1:100的比例取過夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接。37c擴(kuò)大培養(yǎng)至OD0.5左右。3 .加入IPTG終濃度0.20.4mM/L。37c搖床培養(yǎng)46h。4.12000g離心15min,去上清。按40ml/100ml菌液加入'

6、BindingBuffer破碎緩沖液組成：50mMTrispH7.08.5左右,1mMEDTA,溶菌酶(10磴/gcell),;或20mmol/lTris-HCl,pH7.5,1mmol/lEDTA,0.1mMPMSF,DNAse(10磴/gcell)細(xì)胞破碎緩沖液中不含月尿等變性劑，故不溶解包涵體?；?XPBS重懸細(xì)胞。5 .超聲波破碎：占空比50%,超聲15s,停15s,1020min。破碎后的勻漿在4C,12,000rpm下離心30min,棄去上清液。6 .洗滌包涵體：2M尿素在50mMTrispH7.08.5左右,1mMEDTA,10%TritonX-100中洗滌。洗滌24h去除膜碎片

7、和膜蛋白。8M尿素在50mMTrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA,10%TritonX-100，二硫鍵還原劑中洗滌。洗滌48h,使包涵體變性可溶。7 .過Ni柱：Ni2+親和層析柱純化包涵體溶解后的上清液，用銀親和層析柱純化。操作過程參照AmershamPharmaciaBiotech公司提供的操作指南進(jìn)行。具體過程如下：轉(zhuǎn)移樹脂到柱子，待完全沉淀后，用三蒸水洗滌鎮(zhèn)親和層析柱，以除盡基質(zhì)中的乙醇和空氣，并防止下一步Ni2+沉淀；5X柱體積的ChargeBuffer充電；20X柱體積的三蒸水洗滌，去盡游離的守+；10小體積的BindingBuffer平衡柱子；手工上樣，根據(jù)蛋白的濃度來

8、確定上樣體積；20X柱體積的BindingBuffer洗滌，至檢出無蛋白，并收集流出液，用于12%SDS-PAGE電泳檢測；6X柱體積的WashBuffer洗滌，至檢出無蛋白；ElutionBuffer洗脫，每次1mL,收集洗脫流出液，洗脫至檢出無蛋白；10X柱體積的BindingBuffer平衡。此時(shí)，即可用于純化同種蛋白，不需重新充電。純化操作完成后，加5小體積的StripBuffer洗滌，去盡Ni2+;10X柱體積的三蒸水洗滌去盡EDTA;加5X柱體積的0.5mol/LNaOH,靜置0.5-2h,去沉淀的蛋白質(zhì)；三蒸水洗滌，至流出液的pH值為7.0;20%乙醇洗滌，再加適量20%乙醇，于

9、4c保存。A、過柱前的注意事項(xiàng)：a、樣品必須澄清、無顆粒物，否則會(huì)堵塞柱子、縮短其使用壽命；b、包含體洗滌的最后一步及溶解時(shí)所用的Buffer中不能含EDTA、DTT、2ME;c、確保樣品及BindingBuffer中有適量的NaCl,以防止雜離子與Ni離子競爭;B、過Ni柱的操作步驟:用DDW洗滌，洗去20%的乙醇、除盡基質(zhì)中的空氣，并能防止下一步中Ni離子沉淀；5書體積的ChargeBuffer(50mMNiSO4)充電；5書體積的DDW洗滌，去游離的Ni離子；10X柱體積的BindingBuffer(20mMTris-HCl,0.5MNaCl,5mM咪嘎，pH8.0)平衡；上樣(手工上樣

10、，樣品體積應(yīng)根據(jù)目的蛋白的濃度來確定)；10X柱體積的BindingBuffer洗滌，至無蛋白檢出，用三氯醋酸檢測，收集流出液；ElutionBuffer(20mMTris-HCl,0.5MNaCl,5001000mM咪嘎，pH8.0)洗脫，每次1ml,應(yīng)呈現(xiàn)正態(tài)分布(兩邊稀,中間濃)；10X柱體積的BindingBuffer洗滌。此時(shí)，即可用于純化同種蛋白，很少需要重新充電。用20%的乙醇充滿柱子，保存在4Co注：同種蛋白純化510次后，應(yīng)進(jìn)行strip和re-charge。C、柱的清洗與保存(最好每天清洗一次):(1)去Ni離子：5書體積的StripBuffer(20mMTris-HCl,

11、0.5MNaCl,50mMEDTA,pH7.4)洗滌；10X柱體積的DDW洗滌。(2)去沉淀的蛋白質(zhì)：5書體積的0.5MNaOH裝滿柱子，靜置0.52hr；DDW洗滌，至流出液的pH值為7。(3)保存：20%乙醇洗滌，再加20%乙醇保存于4C。D、柱的再生:當(dāng)流速很慢、充電后基質(zhì)不變成藍(lán)綠色時(shí)，應(yīng)進(jìn)行柱的再生2港體積的6M鹽酸服洗滌，然后3X柱體積的DDW洗滌；1港體積的2%SDS洗滌；5港體積的0.5MNaOH裝滿柱子，靜置0.52hr；5港體積的DDW洗滌，然后5X柱體積的100mMEDTA,pH8.0洗滌;3港體積的DDW洗滌，然后3X柱體積的20%乙醇洗滌；20%乙醇保存于4Co【備注

12、】Ni2+親和層析柱純化緩沖液(1XBuffer):?/P>reagentsBindingBufferWashBufferEluteBufferStripBufferChargeBufferMTris-HClpH7.920mM20mM20mM20mM121.14Imidazole5mM60mM1M60.08NaCl0.5M0.5M0.5M0.5M58.44EDTA100mM372.24NiSO450mM262.854.目的蛋白的SDS-PAGE分別取加有IPTG的空載體pET22(b+)表達(dá)的上清液、未加IPTG和加IPTG誘導(dǎo)的重組子全提取物、超聲波破碎后的上清液和沉淀(即包涵體)、純

13、化后的蛋白溶液，進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。通過蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，判斷目的蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量，并對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行純度分析。5、蛋白質(zhì)的復(fù)性目的蛋白在大腸桿菌中以包含體形式存在，要獲得有活性的產(chǎn)物，必須對(duì)純化的目的蛋白進(jìn)行復(fù)性。將收集的洗脫流出液裝入透析袋，對(duì)含適量甘油的0.01mol/LPBSpH8.0透析48h,每48h更換一次PBS溶液。然后，將上述透析袋包埋在聚乙二醇粉末中，對(duì)蛋白溶液進(jìn)行濃縮。【備注】PBS配方：配制0.01MPH7.4PBS2L:0.2mol/LNa2HPO4(mL)81.00.2mol/LNaH2POmL)19.0NaCL17g用水稀釋到2L即可。另外，可加入

14、下列重折疊（復(fù)性）介質(zhì)：氧化還原系統(tǒng)：還原/氧化型谷胱甘肽（10:13:1）L-Arg或Gly（0.5mol/L）甘油：10%聚乙二醇（濃縮）高摩爾濃度的Tris（0.41mol/L）1 .學(xué)習(xí)親和層析的原理。2 .掌握親和層析法分離蛋白質(zhì)的技術(shù)與操作。【實(shí)驗(yàn)原理】親和層析是以普通凝膠作載體，連接上金屬離子制成螯合吸附劑，用于分離純化蛋白質(zhì)，這樣的方法稱為金屬螯合親和層析。蛋白質(zhì)對(duì)金屬離子具有親和力是這種方法的理論依據(jù)。已知蛋白質(zhì)中的組氨酸和半胱氨酸殘基在接近中性的水溶液中能與饃或銅離子形成比較穩(wěn)定的絡(luò)合物，因此，連接上饃或銅離子的載體凝膠可以選擇性地吸附含咪吵基和疏基的肽和蛋白質(zhì)。過渡金屬元

15、素饃在較低pH范圍時(shí)（pH6-8）,有利于選擇性地吸附帶咪吵基和疏基的肽和蛋白質(zhì)，在堿性pH時(shí)，使吸附更有效，但選擇性降低。金屬螯合親和層析行為在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白質(zhì)分子表面咪吵基和疏基的稠密程度所支配，口引味基可能也很重要。本實(shí)驗(yàn)室純化的目的蛋白是用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的pGFPuv,該蛋白是和6His融和表達(dá)的，含有特定的組氨酸標(biāo)記物，這種可溶性蛋白質(zhì)能用金屬親和層析法進(jìn)行分離，且操作簡單，快速，純化效率高?！驹噭┡c器材】一試劑1.0.05mol/LEDTA0.5mol/L,NaCL溶液100mL2 .2mol/LNaCL溶液50mL3 .1mol/LNaOH溶液50mL4 .0.

16、2mol/LNiSO4溶液50mL5 .平衡緩沖液：50mmol/LTris-HCL,500mmol/LNaCL,pH7.0500mL6 .Ni2+ChelatingSepharoseFastFlow510mL7 .重組pGFPuv質(zhì)粒大腸桿菌工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞裂解蛋白樣品20-50ml8 .洗滌?50mmol/L咪口坐，50mmol/LTris-HCL,500mmol/LNaC,pH7.09 .洗脫?300mmol/L咪口坐，50mmol/LTris-HCL,500mmol/LNaCL.pH7.010 20%乙醇溶液50ml二器材1 .1.5cmX50cm層析柱2 .蠕動(dòng)泵3 .紫外檢測

17、儀4 .自動(dòng)收集器5 .伍豪色譜工作站【操作方法】1 .樣品的制備細(xì)胞的培養(yǎng)及熒光蛋白表達(dá)看實(shí)驗(yàn)十，細(xì)胞的破碎及蛋白的收集如下：收集在25C用細(xì)胞培養(yǎng)液，8000r/min,離心5min,去上清液，菌體用平衡緩沖液洗滌一次，離心收集菌體，用三分之一（細(xì)胞培養(yǎng)液）體積的平衡緩沖液充分懸浮，冰浴下進(jìn)行高壓破菌處理。然后8000r/min。離心30min,取上清液。放冰箱備用。2 .親和層析柱的安裝把層析柱固定在鐵支架上，上端的柱頭擰下，柱下端出口用夾子封閉。加入少量的無離子水，排去下端的空氣泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝膠510mL到燒杯中，加入少量的無離子水制成糊狀，沿著貼緊柱內(nèi)壁的玻璃棒把糊狀

18、凝膠倒進(jìn)柱內(nèi)，打開下端的排水口，讓親和凝膠劑隨水流自然沉下。親和層析劑為510mL。然后，將上端的柱頭擰緊，并將頂端和下端用軟管連接封閉備用。3 .層析系統(tǒng)的安裝、調(diào)試(1)蠕動(dòng)泵的調(diào)試：打開背后電源開關(guān)，按下start按鈕，上下箭頭調(diào)節(jié)流速為15rpm(約2ml/min),將軟管充滿去離子水。(2)系統(tǒng)的連接：將蠕動(dòng)泵的出水管與層析柱上端管相連，層析柱的下端管與紫外檢測儀的進(jìn)樣端連接，將紫外檢測儀的out端與自動(dòng)收集器相連。(3)紫外收集器的調(diào)試：打開紫外背后開關(guān)，調(diào)節(jié)靈敏度旋鈕(ABSRange),調(diào)節(jié)調(diào)零旋鈕。(4)自動(dòng)收集器的設(shè)置：打開電源開關(guān)，按復(fù)位”鍵，確定出液管的位置，按手動(dòng)”按

19、鈕,進(jìn)行設(shè)置，如選擇120seconds一管進(jìn)行收集，按自動(dòng)”即開始計(jì)時(shí)收集。(5)伍豪色譜工作站的使用方法：點(diǎn)擊桌面的伍豪色譜工作站圖標(biāo)打開程序，點(diǎn)擊左上角的圖標(biāo)，選擇A或B通道，點(diǎn)擊“即開始采樣，采樣結(jié)束后點(diǎn)擊“咚吉束采樣，然后載入A或B通道譜圖，保存結(jié)果，并打印結(jié)果。4 .層析柱的使用前處理：(1)用5X柱床體積去離子水清洗乙醇封存的Ni2+-ChelatingSepharoseFastFlow親和層析柱，去除乙醇(2)用2X柱床體積的0.2MNiSO4過柱，注意觀察現(xiàn)象(3)用10X柱床體積的去離子水清洗，用5X柱床體積平衡緩沖液平衡柱子5 .上樣：先從20mL裂解上清液中取出50用于電泳，作為親和層析分離前上清液中的總蛋白區(qū)帶對(duì)照?qǐng)D譜。然后以每分鐘2mL的流速上層析柱，分部收集流出液，每管3mL(記錄的紫外吸收峰為穿流峰，取最高的一管樣品液用作電泳)。平衡緩沖液過層析柱，直到紫外吸收峰不再下降(達(dá)到平臺(tái)期為止)。6 .洗滌:用含5