生物轉化技術在中藥研究中的應用

1、生物轉化技術在中藥研究中的應用摘要 近年來的研究表明，生物轉化技術不僅能改變中藥中主要成分的含量、活性物質的結構，擴大藥源范圍，亦能對有毒中藥進行持效減毒。本文以部分中藥材種類為例，分別從側重于改變主要成分含量、改變單一化合物結構、擴大藥源和對有毒中藥持效減毒等方面介紹生物轉化技術在中藥研究中的應用。關鍵詞 生物轉化; 中藥; 單一成分; 藥源; 持效減毒生物轉化( Biotransformation) ，也稱生物催化( Biocatalysis) ，是利用植物離體培養(yǎng)細胞或器官、動物、微生物及細胞器等生物體系對外源底物進行結構修飾而獲得有價值產(chǎn)物的生理生化反應，其本質是利用生物體系本身所產(chǎn)生

2、的酶對外源化合物進行的酶催化反應。它具有反應選擇性強、條件溫和、副產(chǎn)物少、環(huán)保和后處理簡單等一般傳統(tǒng)炮制方法所不能比擬的優(yōu)點，并且可以進行傳統(tǒng)化學合成所不能或很難進行的化學反應1。生物轉化技術與中藥歷史淵源已久，隋唐時期就出現(xiàn)了中藥發(fā)酵初級產(chǎn)品 “神曲”2。生物轉化技術應用于毒性中藥的炮制古已有之。 本草綱目曰: “半夏研末，以姜汁、白礬湯和作餅，楮葉包置籃中，待生黃衣，曬干用，謂之半 夏曲”3。即用天然的混合菌群處理半夏，伴以其他中藥作為輔料，在發(fā)酵過程中使它們共同成為藥性基質，最終發(fā)酵形成具有一定功效的以半夏為主的炮制品( 半夏曲) 。生物轉化體系分為微生物生物轉化系統(tǒng)及植物生物轉化系統(tǒng)。

3、微生物轉化是以細菌、霉菌等微生物為體系對外源底物進行結構修飾的化學反應，其實質是利用微生物體內的酶對外源化合物進行催化反應。微生物種類繁多，分布廣，繁殖快，易變異，對自然環(huán)境的變化有極強的適應能力，含有豐富的酶。利用微生物及其產(chǎn)生的酶進行生物轉化能夠產(chǎn)生許多有用的化合物4。該方法具有生物量倍增時間短，微生物的基因操作方法已廣泛建立等優(yōu)點。以微生物轉化技術為先導建立起來的植物生物轉化5，是利用植物、植物組織培養(yǎng)體或從植物體系提取的酶進行的生物轉化，能夠用來進行生物轉化的底物種類眾多，幾乎包括所有的天然產(chǎn)物，如生物堿類、香豆素類等，一些合成產(chǎn)物也可以進行生物轉化6。植物生物轉化系統(tǒng)與微生物生物轉化

4、系統(tǒng)相比，生物量倍增時間長，產(chǎn)生酶的種類較少且量也較低。但植物生物轉化亦有其獨特之處: 植物中有許多獨特的酶，而微生物中不具有，它們可以催化一定的反應生成許多復雜的化合物，甚至是新化合物7。有研究報道顯示，生物轉化技術不僅能改變中藥中主要成分的含量、活性物質的結構，擴大藥源范圍，亦能對有毒中藥進行持效減毒8-52。但關于轉化機制研究則尚未成熟，需要努力挖掘其中的關鍵酶及代謝過程，才能搞清楚其轉化的過程及規(guī)律，從而完善生物轉化技術的理論及應用。本文以部分中藥材種類為例，分別從側重于改變主要成分含量、改變單一化合物結構、擴大藥源和對有毒中藥持效減毒等方面介紹生物轉化技術在中藥研究中的應用。1 生物

5、轉化技術對中藥主要成分含量的改變1. 1 植物藥藥材五倍子中主要含有鞣質、沒食子酸等物質。鞣質經(jīng)過腸道時會與蛋白質結合而降低藥物作用。為了克服這一缺點，鄭利華等8采用含有根霉菌和L-賴氨酸等的酵曲發(fā)酵五倍子，形成更多的 L-賴氨酸。由于 L-賴氨酸能促進胃腸道黏膜吸收食物中的蛋白質，有效地避免鞣酸在胃腸道內競爭性消耗，從而提高了五倍子的收斂作用。瞿燕等9通過對五·3·2012 年 2 月 第 14 卷 第 2 期 中國現(xiàn)代中藥 Modern Chinese Medicine Feb. 2012 Vol. 14 No. 2倍子生品、發(fā)酵品中沒食子酸的含量測定，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵品中沒食

6、子酸的含量高，抗菌和祛痰作用強于生品。大黃中結合型蒽醌是瀉下作用的主要有效成分，游離型蒽醌瀉下作用極弱。戴萬生等10用酒精酵母、面包酵母對大黃進行分別發(fā)酵 16 d 后，結合型蒽醌含量明顯降低，游離型蒽醌含量大大提高，提示發(fā)酵能使大黃中的結合型蒽醌轉化為游離型蒽醌，從而緩解大黃的瀉下作用。三七的根中有效成分為皂苷。Li 等11采用枯草芽孢桿菌對三七根進行發(fā)酵，結果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后的三七中含有發(fā)酵前三七根中所沒有的人參皂苷 Rh4，說明它是通過發(fā)酵由其他成分轉化而成的。甘草經(jīng)加工后產(chǎn)生大量殘渣。李艷賓等12研究菌種發(fā)酵處理對甘草渣中黃酮類化合物提取的影響，結果表明，與乙醇直接提取法相比，經(jīng)微生物發(fā)酵

7、處理能有效提高甘草黃酮的得率，其中經(jīng)白腐菌、纖維素分解菌發(fā)酵后黃酮得率分別為 0. 89%、0. 87% ，比乙醇直接提取法的黃酮得率 ( 0. 66% )提高了 34. 85%、31. 82%; 白腐菌與纖維素分解菌混合發(fā)酵處理，黃酮得率達到 1. 32%，與乙醇直接提取法相比提高了 100%。陳易彬等13采用濕熱法、氧化法、生物發(fā)酵法等方法對銀杏葉進行處理，考察不同的處理方法對提取銀杏葉黃酮含量的影響，結果生物發(fā)酵法所得銀杏葉黃酮的含量為 7. 97%，高于其他幾種方法。表明，生物發(fā)酵法對銀杏葉黃酮的作用明顯，能夠提高銀杏葉黃酮的含量。1. 2 動物藥斑蝥素是昆蟲類中藥斑蝥體內的有毒物質，

8、亦是斑蝥抗癌作用的主要有效成分14。臨床研究表明，斑蝥素有顯著的抗癌作用，對肝癌、食道癌、胃癌、肺癌等均有抑制效果，但斑蝥素的毒副作用較大15。劉高強等16采用微生物轉化法對斑蝥素進行結構改造研究，發(fā)酵結束后，采用毛細管氣相色譜法對藥用真菌培養(yǎng)液中斑蝥素的含量進行了測定，結果顯示，靈斑菌質等發(fā)酵液中斑蝥素的含量較原藥材有顯著降低。1. 3 礦物藥屠娟等17發(fā)現(xiàn)發(fā)酵工業(yè)廢水的黑根霉菌對鉛、錳、鎘、銅有很好的吸附作用，且經(jīng)化學改性的黑根霉能不同程度地提升吸附能力。這對于含鉛等中藥，如鉛丹、密陀僧、黑錫丹等發(fā)酵減毒值得深入研究。2 生物轉化技術對單一化合物的結構轉化2. 1 生物堿類士的寧是馬錢子成

9、熟種子的主要毒性成分。潘揚等18通過真菌發(fā)酵技術對馬錢子進行生物轉化，發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)生的藥性菌質中馬錢子類生物堿成分發(fā)生了質和量的明顯變化，并在生物堿 HPLC 圖中可看出多個含量變化較大的或新產(chǎn)生的未知成分。結構鑒定表明，士的寧、馬錢子堿都被轉化為各自氮氧化物。2. 2 有機酸類劉瑩等19利用 25 種真菌對齊墩果酸進行生物轉化，經(jīng) HPLC 檢測，發(fā)現(xiàn)其中有 5 種真菌對齊墩果酸有轉化，測得的轉化率分別為 56. 2%、69. 7%、77. 9% 、81. 6% 、83. 0% 。關木通的莖藤等含有馬兜鈴酸，這類物質具肝腎毒性和致癌作用。郭永超等20選取短刺小克銀漢霉菌對毒性較強的馬兜鈴酸 A(

10、 AA ) 和馬兜鈴酸B( AA ò) 進行轉化研究，結果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中主要的轉化產(chǎn)物是 AA 的去甲基化物( AA a) ，該產(chǎn)物與報道的哺乳動物在攝入 AA 后尿中發(fā)現(xiàn)的一種代謝產(chǎn)物結構相同。天然香蘭素一直是香精香料行業(yè)關注的重點。董長穎等21通過研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌 L1936 能將阿魏酸轉化為香蘭素，研究結果顯示，鏈霉菌 L1936 能夠將 6 g·L 1阿魏酸轉化為 2. 02 g·L 1香蘭素，相應的摩爾轉化率為 42. 97%。此外，趙丹等22研究觀察了 150 種真菌對丹參酚酸 B 進行的轉化，結果發(fā)現(xiàn)一株真菌可高產(chǎn)率轉化丹參酚酸 B，轉化后得到新的酚

11、酸類活性物質原紫草酸。馬晶等23采用刺囊毛霉 AS3. 3450 對甘草次酸進行微生物轉化研究，生成的主產(chǎn)物經(jīng)分析鑒定為 7-羥基甘草次酸。2. 3 內酯類雷公藤去皮的根所含主要有效成分和有毒成分為雷公藤甲素、雷公藤內酯酮等內酯化合物。葉敏等24利用微生物轉化技術對雷公藤甲素和雷公藤內酯酮進行生物轉化，共得到 17 個產(chǎn)物，其中 11 個為新化合物，體外篩選結果表明大多數(shù)轉化產(chǎn)物表現(xiàn)出較強的細胞毒活性。據(jù)研究報道，短刺小克銀漢霉能轉化雷公藤甲素，產(chǎn)物種類較多。其中羥基化酶起主要作用，能分別在不同的甲基、亞甲基和次甲基位點上進行單羥基化反應，分別得到5-羥基雷公藤甲素、19-羥基雷公藤甲素、19

12、-羥基雷公藤甲素、1-羥基雷公藤甲素、雷公藤乙素、16-羥基雷公藤甲素、雷醇內·4·2012 年 2 月 第 14 卷 第 2 期 中國現(xiàn)代中藥 Modern Chinese Medicine Feb. 2012 Vol. 14 No. 2酯，其中前 4 個物質為新化合物25。2. 4 苷類李于善等26以自三峽白首烏提取分離得到的C21甾苷元告達庭甾苷元和開德甾苷元作為底物，采用黑根霉和赭曲霉兩種微生物在水-正丁醇雙相體系中，以連續(xù)轉化或同步轉化的方法制備 C11-羥基化的白首烏 C21甾苷元告達庭甾苷元和開德甾苷元。包海鷹等27利用菌種黑根霉對人參皂苷 Re 進行生物轉化

13、，轉化后的人參皂苷發(fā)酵產(chǎn)物中含有人參皂苷Rg2及 Rg2的同分異構體和人參皂苷 Rg5/ Rk1。白龍律等28利用 18 種菌株對人參皂苷 Rb1進行生物轉化研究，結果發(fā)現(xiàn)一種綠毛狀 GY-06 菌擴展青霉能夠使得人參皂苷 Rb1有效地轉化為 Rg3。田天麗等29從中藥材虎杖中篩選到一株具有轉化虎杖苷能力的根霉菌株 T-34，利用該菌株產(chǎn)生的 -葡萄糖苷酶能將虎杖苷轉化為白藜蘆醇，并測得虎杖苷的轉化率達 98%。王永宏等30篩選到一株產(chǎn)葡萄糖苷酶酶活可達到 8. 2 U·mL 1的青霉，并優(yōu)化了發(fā)酵轉化條件，使得梔子中主要成分京尼平苷轉化成具直接作用的有效成分京尼平，轉化率可達到95

14、%以上。2. 5 其他檸檬苦素類化合物是三萜類植物次生代謝產(chǎn)物，主要分布于蕓香科和楝科植物中，尤其在柑橘屬植物中，此類化合物含量較為豐富。黃柏酮是白鮮皮中含量較高的一個檸檬苦素類化合物，可使昆蟲產(chǎn)生拒食行為31，并能使具有抑制微管作用的抗腫瘤藥( 如長春新堿) 的活性增強32。為了研究微生物對檸檬苦素類化合物的轉化作用，楊若林等33應用黑曲霉等真菌對黃柏酮進行了轉化試驗，結果表明雅致小克銀漢霉在培養(yǎng)溫度低于 30時可以催化黃柏酮的結構轉化，使其 C-11 位被羥基化。孫敏鴿等34使用蕁麻青霉對莪術醇進行生物轉化研究。結果分離得到 2 個化合物，分別為 3-羥基莪術醇和 11-R-12-羥基莪術

15、醇。趙明強等35利用人參毛狀根可對外源氫醌進行轉化得到熊果苷產(chǎn)物。蔡潔等36利用人參毛狀根將外源對羥基苯甲醇轉化為天麻素，為工業(yè)化生產(chǎn)人參屬植物所不能合成的熊果苷、天麻素等天然化合物奠定了基礎。Hirata等37利用煙草植物懸浮培養(yǎng)細胞對羥基香豆素進行轉化，得到相應的 -D-葡萄糖苷產(chǎn)物。為了增加芝麻酚的水溶性，有學者利用煙草懸浮培養(yǎng)細胞和桉樹懸浮培養(yǎng)細胞對其進行生物轉化38。結果，煙草懸浮培養(yǎng)細胞轉化芝麻酚得到芝麻酚-D-吡喃葡萄糖苷和芝麻酚-龍膽二糖苷，桉樹懸浮培養(yǎng)細胞對其進行生物轉化得到芝麻酚-D-吡喃葡萄糖苷和芝麻酚-蕓香糖苷。3 生物轉化技術對藥源范圍的擴大3. 1 紫杉醇紫杉醇是從

16、紅豆杉屬植物的樹皮中分離提取到的一種二萜類化合物，亦是繼阿霉素和順鉑后備受青睞的抗癌藥，但其來源一直缺乏39。美國施貴寶公司 Patel 等利用微生物轉化方法進行紫杉醇的半合成，他們分別從白色類諾卡菌、藤黃類諾卡菌、莫拉菌的發(fā)酵液中分離得到 C-13 紫杉醇酶、C-7 木糖苷酶和 C-10 去乙酰酶，分別將紅豆杉中的幾種紫杉烷如巴卡亭、紫杉醇 C、cephalomannie、10-去乙?；仙即嫉鹊?7，10，13 位進行水解，得到較多而單一的10-去乙酰-巴卡亭3，該產(chǎn)物為紫杉醇合成的重要前體化合物，再利用化學反應，連接上 13 位的側鏈，即可得到紫杉醇40-41。這提示了生物轉化技術有利于

17、紫杉醇前體物質的得到，從而為紫杉醇的來源提供了一個新的有效途徑。3. 2 喜樹堿喜樹堿是 Wall 和 Wani 等從珙桐科喬木、我國特有的植物喜樹的樹葉和樹皮中分離得到的具有較強的抗腫瘤和抗病毒活性的生物堿。微生物轉化喜樹堿可以獲得 10-羥基喜樹堿42。10-羥基喜樹堿可選擇性地抑制拓撲異構酶干擾 DNA 的復制，與其他常用的抗癌藥無交叉耐藥性，因而對耐藥性腫瘤有效。10-羥基喜樹堿的抗癌作用相當于喜樹堿的 30倍，但是它在喜樹果實中含量甚低，僅十萬分之二43。朱 關 平42采 用 無 毒 黃 曲 霉 菌 株 T-419( CGMCCO158) ，將在喜樹中含量較高的喜樹堿轉化為 10-羥

18、基喜樹堿，轉化率達 50% 以上。采用該法能夠產(chǎn)生比喜樹堿更為有效的抗腫瘤物質10-羥基喜樹堿，間接地擴大了抗癌藥物的來源。3. 3 人參皂苷人參皂苷是人參功效的主要成分。大多數(shù)天然皂苷在體內轉化為次級苷 Rh2、Compound K( C-K)或者原人參苷元等，這些次級皂苷具有重要的抗癌、防輻射等藥理活性。天然人參皂苷可能是抗腫瘤的前體物質，其轉化產(chǎn)物才具有抗腫瘤作用44。因此，利用生物轉化技術預先合成藥物體內的代謝產(chǎn)物能夠間接地提高原藥物的利用度及擴大靶點藥物的藥源。目前，有人利用黑曲霉對人參皂苷進行微生物轉化，以生成具有抗腫瘤作用的次級皂苷。金鳳燮45利用酶轉化法使得人參總皂苷轉化成人參

19、皂苷 Rh2，轉化率超過 60%，現(xiàn)已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。·5·2012 年 2 月 第 14 卷 第 2 期 中國現(xiàn)代中藥 Modern Chinese Medicine Feb. 2012 Vol. 14 No. 24 生物轉化技術對毒性中藥的持效減毒作用毒性中藥系指毒性劇烈、治療劑量與中毒劑量相近、使用不當會致人中毒或死亡的藥品。國家已將毒性中藥列入重點研究課題，以防止中藥毒性及不良反應46。中醫(yī)在長期的用藥實踐中積累了許多經(jīng)驗，對藥材進行特殊加工處理，可使之達到持效減毒的目的，保證臨床用藥安全。大部分炮制方法需要在高溫條件下操作，生產(chǎn)過程中溫度不好控制，而且污染環(huán)境，同

20、時產(chǎn)品往往含有糖及脂肪轉化成的強致癌物質。與其他炮制方法相比，發(fā)酵法不但可定向分解或轉化中藥中的毒性成分，而且工藝條件溫和，不會對生態(tài)造成污染。因此，將發(fā)酵法用于對毒性中藥的持效減毒研究具有普通理化炮制手段所無法比擬的獨特優(yōu)勢。4. 1 川烏、草烏王身艷47等利用靈芝等菌種與川烏進行雙向發(fā)酵，結果表明，在一定的時間范圍內，大多數(shù)的菌株在川烏基質上的適應性良好，菌絲體生長旺盛，發(fā)酵之后的多數(shù)菌質中烏頭堿、新烏頭堿及次烏頭堿含量較生藥材有明顯的降低，藥效試驗結果顯示川烏及草烏發(fā)酵品仍保持其原有的藥效。這提示了生物轉化技術有利于川烏的持效減毒研究。4. 2 馬錢子潘揚等48發(fā)現(xiàn)紅栓菌等 10 種真菌

21、能夠在馬錢子藥材上正常生長，且大部分藥性菌質中士的寧和馬錢子堿含量都明顯降低，同時通過對紅栓菌等 7種藥性菌質的藥理實驗研究，發(fā)現(xiàn)它們均保持了馬錢子原有的止痛、抗炎作用49，且毒性得到顯著降低。4. 3 雷公藤莊毅50用 2 種真菌對雷公藤進行雙向發(fā)酵，結果所產(chǎn)生的藥性菌質毒性明顯減小，并保持了雷公藤原有的免疫抑制作用，同時，藥性菌質中毒性成分雷公藤甲素的含量有所下降。王衛(wèi)倩等51對靈雷菌質進行了急性毒性試驗，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵 30 d 的靈雷菌質毒性最低且仍保持一定的免疫抑制作用。張普照等52研究雷公藤雙向固體發(fā)酵過程中化學成分的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵 90 d 時，雷公藤甲素含量降低了 89. 4%

22、。5 展望隨著中醫(yī)藥研究的深入發(fā)展，生物轉化技術已被不同時期的醫(yī)藥專家不斷充實和發(fā)展。如莊毅教授在此基礎上創(chuàng)立的雙向發(fā)酵技術，研發(fā)出了抗癌新藥槐耳顆粒及槐芪菌質，已獲得國家一類新藥證書并上市生產(chǎn); 此外，青霉素的大量生產(chǎn)為抗生素的開發(fā)應用提供了新的途徑等。同時，我們仍需要從現(xiàn)代科學的角度去探討生物轉化的工藝和機理，極大地豐富中藥的發(fā)酵實踐與理論。筆者認為，生物轉化反應中的酶可能會作用于同類成分中的某個位點，以使之發(fā)生類似的結構轉化，從而引起相應的藥效或毒理變化。因此，運用生物轉化技術，可能會使得越來越多的同類成分發(fā)生預想的結構轉化，避免了化學合成的復雜程序及副產(chǎn)物多等缺點，從而加快了同類成分的

23、研發(fā)并豐富了生物轉化的機制與理論。對于一些來源稀缺的天然藥物，可以試著通過生物轉化技術將同科屬的其他植物內的相似成分進行結構轉化，極有可能合成出所需的結構，從而擴大了某些稀缺藥物的來源范圍。前人的研究提示生物轉化技術已廣泛地應用于多類中藥及成分，筆者認為，對于一些藥效不夠明顯或毒性較大的尚待研究的藥材，可以試著通過生物轉化技術來提高其藥效或降低其毒性，從而避免去尋找其他復雜的路徑或方法，大大地加快了中藥開發(fā)的速度。但是，關于轉化機制的研究尚未成熟，需要努力挖掘其中的關鍵酶及代謝過程，才能搞清楚其轉化的過程及規(guī)律，從而對毒性中藥的持效減毒研究有更為深刻的認識。對于一些經(jīng)體內代謝后才能實現(xiàn)藥效的物

24、質，可以通過生物轉化技術使其先轉化為代謝后的結構，再開發(fā)成藥物，從而避免了體內代謝的損失與耗時。對于一些已經(jīng)或尚待增加水溶性或脂溶性的化學物質，亦可應用生物轉化技術，極有可能實現(xiàn)底物到產(chǎn)物的一步轉化，從而減少了復雜的合成步驟及研發(fā)時間，極大地加快了新藥研發(fā)的速度。相信隨著生物轉化技術在中藥領域的廣泛應用，將為中藥的臨床安全使用提供新的途徑，并促進新型藥物的研發(fā)。參考文獻1Liu J-H，Yu B-Y. Biotransformation of Bioactive NaturalProducts for Pharmaceutical Lead CompoundsJ. Currentorganic

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33、frugiperda Larvae: a structure-activity relation-shi PstudyJ. J Agric Food Chem，2002，50: 6766-6774.32Jung H，Sok DE，Kim Y，et al. Potentiating effect ofobacunone from Dictamnus dasycarpus on cytotoxicity ofmicrotuble inhibitors，vincristine，vinblastine and taxolJPlanta Med，2000，66: 74-76.33楊若林，鄭桂蘭，張榮慶

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37、#183;7·2012 年 2 月 第 14 卷 第 2 期 中國現(xiàn)代中藥 Modern Chinese Medicine Feb. 2012 Vol. 14 No. 2( 3) : 417-314.24Chen S. ，Yao H. ，Han J. ，et al. Validation of the ITS2Region as a novel DNA barcode for identifying medicinalplant species J. PLoS ONE，2010，5( 1) : e8613.25 Koetschan C. ，F(xiàn)rster F. ，Keller A. ，

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39、29張文清，陳秀榕. 五加皮易混品香加皮鑒別J. 海峽藥學，1995，7( 1) :4-5.30文軍，朱昱蘋 . 東南亞地區(qū)五加科植物進化關系的初步研究J. 云南植物研究，2008，30( 4) :391-399.Molecular Identification of Acanthopanacis Cortex Original Plant andIts Adulterants Based on ITS2 DNA BarcodeZENG Xu1，2，LI Qiu-shi1，WANG Qian1，XIE Li-fang4，ZHANG Ya-lan5，LUO Kun1，LIU Zhi-hua1，3

40、( 1. Institute of Medicinal Plants Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，Beijing 100193 China; 2. China Pharmaceutical University，Nanjing 210098 China;3. Nanjing Forestry University，Nanjing 210037 China;4. Information Center，Chinese Academy of Medical Sciences，

41、Beijing 100032 China;5. Development of Pharmaceutical Sciences，Beijing City University，Beijing 100083 China)Abstract Objective: To discriminate Acanthopanacis cortex original plant and its adulterants，and assure theauthenticity and clinical curative effect of this medical material. Methods: Download

42、 the ITS2 barcode sequences ofAcanthopanax gracilistylus and its adulterants from GenBank database. Sequence assembly and consensus sequencegeneration were performed using the CodonCode Aligner. Sequence analyses were carried out by MEGA4.Phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining and Kimura 2-parameter methods. The ITS2 secondarystructure was predicted using the ITS2 database and website found by Schultz et al. Results: In the two clusterdendrograms ，Acanthopanax gracilisty