人源溶菌酶在畢赤酵母中的高效表達(dá)

1、人源溶菌酶在畢赤酵母中的高效表達(dá)人溶菌酶 (hLYZ) 作為一種天然的抑菌活性物質(zhì), 在畜牧、醫(yī)藥及食品等行業(yè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。但由于制備材料來(lái)源有限, 產(chǎn)物分離純化費(fèi)用高等因素 ,hLYZ 的應(yīng)用受到了極大的限制。 本論文旨在利用畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)具有生物活性且易于純化的 hLYZ,以期降低生產(chǎn)成本解決溶菌酶應(yīng)用受限的問(wèn)題。主要研究?jī)?nèi)容如下 :(1) 將 信號(hào)肽和 hLYZ基因作為整體進(jìn)行密碼子優(yōu)化 ,并將其插入 pPICZ A 空載體 , 構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZ-OptF+hLYZ。通過(guò)轉(zhuǎn)化篩選 , 獲得一株穩(wěn)定性較好的重組子K1。 K1 搖瓶表達(dá)發(fā)酵液總蛋白濃度為260mg·

2、;L-1, 總酶活為 12,937 U · mL-1。在 5 L 發(fā)酵罐中培養(yǎng) K1, 細(xì)胞密度達(dá)到 50 g-DCW· L-1 開(kāi)始誘導(dǎo) , 甲醇濃度控制于 5 g·L-1, 最終的總蛋白濃度為 1.71 g·L-1, 總酶活達(dá)到 262,152 U·mL-1。(2) 對(duì) 信號(hào)肽做了進(jìn)一步的優(yōu)化處理 , 新插入 39 個(gè)堿基 , 構(gòu)成包含增長(zhǎng)的信號(hào)肽和 hLYZ基因的新序列將其插入 pPICZA 空載體 , 構(gòu)建得到另一表達(dá)載體pPICZ-Ehn F+hLYZ,通過(guò)轉(zhuǎn)化篩選獲得重組子K4。K4 搖瓶表達(dá)發(fā)酵液總蛋白濃度為 320 mg

3、3;L-1, 總酶活為 16,974 U ·mL-1, 均優(yōu)于 K1。在 5 L 發(fā)酵罐中采用與 K1相同的誘導(dǎo)策略 , 最終發(fā)酵液中的總蛋白濃度可達(dá)到 2.54 g ·L-1, 比 K1 提高 48.5%, 但總酶活為 258,712 U ·mL-1, 比 K1 略低。(3) 考察了 K4 在高細(xì)胞密度 ( 100 g-DCW· L-1) 下起始誘導(dǎo)的 hLYZ 表達(dá)性能。進(jìn)行純甲醇誘導(dǎo) , 并將甲醇濃度控制于 5 g ·L-1, 誘導(dǎo) 54 h 發(fā)酵液中的總蛋白濃度為 3.02 g ·L-1, 但隨后發(fā)生嚴(yán)重降解 , 誘導(dǎo) 68

4、h 后僅剩 2.07 g ·L-1 。采用甲醇 / 山梨醇共混流加策略 , 優(yōu)先將甲醇濃度控制于 5 g·L-1, 不控制溶解氧濃度 , 誘導(dǎo) 68 h 總蛋白濃度可達(dá)到2.88 g ·L-1, 未出現(xiàn)明顯的蛋白降解現(xiàn)象。上述二種誘導(dǎo)策略下最高的總酶活水平分別為324,072 U·mL-1 和 290,438U·mL-1。(4) 利用 Bgl 和 BamH屬于同尾酶的特點(diǎn) , 設(shè)計(jì)多拷貝串聯(lián)hLYZ基因表達(dá)載體 , 并獲得了兩拷貝及四拷貝串聯(lián)hLYZ基因轉(zhuǎn)化重組子 K-2-2 、K-4-2 。搖瓶發(fā)酵條件下 ,K-2-2 和 K-4-2 的最高總蛋白濃度分別為193.0mg·L-1 和185.3 mg ·L-1, 對(duì)應(yīng)的總酶活分別為5,256 U ·mL-1 和 5,424 U ·mL-1。5 L 發(fā)酵罐中 ,K-2-2 低細(xì)胞密度 ( 50 g-DCW· L-1) 誘導(dǎo) 73 h 及高細(xì)胞密度 ( 100g-DCW·L-1) 誘導(dǎo) 65 h 后 , 發(fā)酵液中的總蛋白濃度分別為0.79 g·L-1 和 0.93 g·L-1,總酶活分別為 70,332 U· mL-1 和 71,529 U· mL