副豬嗜血桿菌PCR鑒定方法的建立

1、26豬業(yè)科學(xué)SWINEINDUSTRYSCIENCE2007年第12期F E A T U R E主題策劃副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis ,HPS引起豬的多發(fā)性漿膜炎,又稱為革拉澤氏病(GlassersDisease,臨床表現(xiàn)以呼吸道癥狀、跛行、胸膜炎、心包炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等為特征。1材料1.1菌株副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)株NR4、S W 124、S W 140、S W 114北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所惠贈。疑似副豬嗜血桿菌國內(nèi)分離株Q D W F 株、N J I N G 株、X X 株、XS 株、P Z 株、FS 株、JUNQ株、NJJQ株、HNDY株、JAS1株。

2、傳染性胸膜肺炎放線菌、巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供抗原培養(yǎng)物。1.2PCR引物序列以HPS 的16SrRNA中的基因序列設(shè)計引物,由上海生工生物工程有限公司合成,序列如下:上游引物5GTGATGAGGAAGGGTGGTGT3,下游引物5GGCTTCGTCACCCTCTGT3。2方法2.1菌體培養(yǎng)將副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)株:NR4、SW124、SW140、S W 114,疑似副豬嗜血桿菌國內(nèi)分離株:Q D W F 株、N J I N G株、X X 株、X S 株、P Z 株、F S 株、J U N Q株、N J J Q株、H N D Y株、J A S 1株,傳副豬嗜血桿菌PC

3、R鑒定方法的建立周勇岐1,2,劉茂軍1,蘇國東1,朱曉瑋2,丁美娟2,邵國青1(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所江蘇南京210014;2.南京天邦生物科技有限公司江蘇南京211102摘要:以HPS的16SrRNA中的基因序列設(shè)計合成引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,標(biāo)準(zhǔn)菌株NR4、SW124、SW114、SW140和分離株XX、FS在預(yù)計的821bp位置上擴(kuò)增出特異性條帶,NJING株、胸膜肺炎(APP等沒有特異性條帶產(chǎn)生。這證明P C R 檢測副豬嗜血桿菌具有較高的特異性和敏感性。關(guān)鍵詞:副豬嗜血桿菌;P C R染性胸膜肺炎放線菌XM9株等菌株分別接種于改良巧克力瓊脂平板,37培養(yǎng)48h。觀察菌落形態(tài),染

4、色鏡檢,如有雜菌污染要挑取單個菌落進(jìn)行亞克隆接種培養(yǎng),至菌落形態(tài)單一。每個平板加入pH7.0的沖洗液,然后5000r/min離心5min ,棄上清再加PBS液10mL離心,如此重復(fù)3次,最后沉淀加純水20mL ,4備用。2.2DNA模板的制備將每個菌液樣品分別取1.5mL加入Effendorf管中,煮沸10min,煮沸后,在15800r/min離心5min,取上清液加入適量EDTA緩沖液置4保存,作為PCR模板備用。2.3PCR擴(kuò)增將2個P C R 引物和15株待檢菌株的模板D N A 進(jìn)行擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系為:10×PCRbuffer5L,25mmolMg 2+2.5L,2.5m

5、moldNTPs4l,25mol上游引物2.5L,25mol下游引物2.5L,Taq酶0.5L ,ddH 2O30L,模板DNA3L。PCR反應(yīng)條件為:952min,9430s,5030s,721min,35cycle,726min進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳,在紫外燈光下觀察結(jié)果。3結(jié)果與討論3.1分離株的擴(kuò)增用上述10個分離株、1個胸膜肺炎放線桿菌株和4個HPS 標(biāo)準(zhǔn)株同時進(jìn)行P C R 擴(kuò)增,標(biāo)準(zhǔn)株N R 4、S W 124、S W 140、SW114及分離株XX、FS在821bp的位置上擴(kuò)增出特異性條帶;分離株Q D W F、N J I N G、X S 、P Z

6、、J U N Q 、N J J Q 、H N D Y、J A S 1、XM9等在該位置擴(kuò)增條帶沒有出現(xiàn)(見圖1。說明以該方法檢基金項(xiàng)目:本項(xiàng)目受江蘇省科技成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)資金(BA2004032和江蘇省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(BK2007711資助。F E A T U R E主題策劃2007年第12期SWINEINDUSTRYSCIENCE豬業(yè)科學(xué)27參考文獻(xiàn):1張培君,孫惠玲,苗得園,龔玉梅,PatBlackall.豬胸膜肺炎放線桿菌和副豬嗜血桿菌的鑒別診斷及血清型鑒定J .中國獸藥雜志.2002,36(10:18-20.2RafrieeM,BaraM,SrephensCP,BlackallPJ.

7、ApplicationofERIC-PCRforthecomparisonofisolatesofHaemophilus parasuis J.AustVetJ.2000,78(12:846-849.3HillCE,MetcalfDS,MacInnesJI.AsearchforvirulencegenesofHaemophilusparasuisusingdifferentialdisplayRT-PCRJ.VetMicrobiol,2003,96(2:189-202.4Puente-RedondoVA,BlancoNG.Gutierrez-MartinDetectionandsubtypin

8、gofActinobacilluspleuropneumoniaestrainsby PCR-RFLPanalysisofthetbpAandtbpBgenesJ.ResMicrobiol.2000,151(8:669-681.5AmanoH,ShibataM,KajioN,Morozumi.Pathologicobservationsofpigsintranasallyinoculatedwithserovar1,4and5of Haemophilusparasuis usingimmunoperoxidasemethodJ.J VetMedSci,1994,56(4:639-644.6Ju

9、ngK.ChaeC.HybridizationforthedetectionofHaemophilusparasuisinnaturallyinfectedpigsJ.JCompPathol,2004,130(4:294-298.(收稿日期:2007-11-28MMarker;1NR410-1;2NR410-2;3NR410-3;4FS10-1;5FS10-2;6FS10-3圖3敏感性測定MMarker;1NR4;2SW124;3SW140;4SW114;5FS;6XX;7QDW;8NJING;9XS;10PZ;11JUNQ;12NJJQ;13HNDY;14JAS1;15XM9圖1分離株P(guān)CR

10、電泳圖MMarker;1NR4;2SW124;3SW140;4SW114;5XM9;6巴氏桿菌;7副雞嗜血桿菌圖2PCR的特異性電泳圖測分離株XX 、FS為副豬嗜血桿菌陽性。3.2PCR的特異性以副豬嗜血桿菌4個標(biāo)準(zhǔn)型與傳染性胸膜肺炎放線菌、巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌做特異性比較。由圖2可見,PCR可從副豬嗜血桿菌4個標(biāo)準(zhǔn)型擴(kuò)增出目的條帶,不能從傳染性胸膜肺炎放線菌、巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌中擴(kuò)增到條帶。3.3PCR的敏感性從含有109CFU/mL放置了18h的HPS培養(yǎng)物,提取的模板進(jìn)行10倍稀釋的系列濃度用來做PCR敏感性的檢測。10-1、10-2、10-3模板濃度均擴(kuò)增出特異性條帶,隨著稀釋倍數(shù)的增加,條帶略顯減弱趨勢(見圖3。說明該方法具有較高的敏感性。4結(jié)語PCR特異性的關(guān)鍵首先取決于所選靶序列的特異性。本實(shí)驗(yàn)的引物序列,選用HPS的16S小的亞單位RNA基因序列與基因庫中使用BBS的所有基因序列比較。從51個序列(包含從豬的組織中分離出的相關(guān)組織和細(xì)菌,被挑選出來,與HPS的M75065基因序列混合,然后辨別HPS的特定基因區(qū)域篩選,具有極高的特異性(MRAFIEE、MBARA等。引物序列在靶DNA上的專一性、以及引物