自我鑒定-菌種鑒定

1、菌種鑒定篇一：菌種鑒定 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 CICC是我國唯一的國家級工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，有近三十年菌種分類鑒定的歷史，擁有先進的生物科學儀器和從事分類鑒定的專業(yè)化人員隊伍。CICC承擔全國工業(yè)微生物菌種的委托鑒定工作，所提供的菌種鑒定與評價技術服務獲得“國家工商總局（SCIC）經(jīng)營許可”，為國內(nèi)科研機構、大專院校和生產(chǎn)企業(yè)等提供微生物菌種鑒定服務，涉及細菌、酵母、放線菌和絲狀真菌等多類微生物。菌種鑒定手段包括形態(tài)學觀察、生理生化特性鑒定、 BIOLOG碳源自動分析鑒定、分子生物學鑒定、API細菌數(shù)值鑒定、功能性分析及功能基因、RAPD、SSCP、TLC薄層層析、全細胞脂肪

2、酸分析鑒定、（GC）mol測定、DNA/DNA同源性測定等。 鑒定項目 序號 服務項目 菌種類別 1 純菌種鑒定（包含形態(tài)、理化、分子） 細菌、酵母、放線菌、絲狀真菌 2 功能基因鑒定（pheS、gryA、atpD等） 乳桿菌、芽胞桿菌、雙歧桿菌 3 產(chǎn)品微生物解析 4 產(chǎn)品污染菌種鑒定 5 菌群分析及純種分離 6 細胞壁化學組分分析（氨基酸） 細菌、放線菌 7 細胞壁化學組分分析（糖） 細菌、放線菌 8 DNA（G+C ）mol含量 細菌、放線菌 9 DNA/DNA雜交 細菌、酵母、放線菌、絲狀真菌 10 脂肪酸分析 細菌、放線菌 11 其它 鑒定手段 （1）常規(guī)鑒定 常規(guī)鑒定內(nèi)容有形態(tài)特征

3、和理化特性。形態(tài)特征包括顯微形態(tài)和培養(yǎng)特征；理化特性包括營養(yǎng)類型、碳氮源利用能力、各種代謝反應、酶反應和血清學反應等。 （2）BIOLOG碳源自動分析鑒定 BIOLOG鑒定系統(tǒng)以微生物對不同碳源的利用情況為基礎，檢測微生物的特征指紋圖譜，建立與微生物種類相對應的數(shù)據(jù)庫。通過軟件將待測微生物與數(shù)據(jù)庫參比，得出鑒定結果。 該系統(tǒng)已獲美國FDA認可，已逐步應用于食品和飲品企業(yè)、環(huán)保、海洋生物/水產(chǎn)品、制藥、農(nóng)業(yè)微生物、生物治理、化妝品、臨床等領域的微生物鑒定試驗中。 CICC擁有國內(nèi)最全的BIOLOG數(shù)據(jù)庫，涉及革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、厭氧菌、酵母、絲狀真菌在內(nèi)近2000種微生物。 （3）分子生

4、物學鑒定 應用分子生物學方法從遺傳進化角度闡明微生物種群之間的分類學關系，是目前微生物分類學研究普遍采用的鑒定方法。CICC擁有微生物菌種分類鑒定的分子生物學實驗室，配有PCR儀、高速冷凍離心機、電泳儀、HPLC、凝膠成像系統(tǒng)、紫外控溫分析系統(tǒng)等先進儀器設備，以及DNAMAN、BIOEDIT、 CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析軟件。目前CICC可采用核酸序列分析法 分析細菌16S rDNA/16S-23S rDNA區(qū)間序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及絲狀真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科學的鑒定結果。 （4）API細菌

5、數(shù)值鑒定系統(tǒng) API鑒定系統(tǒng)涵蓋15個鑒定系列，約有1000種生化反應，目前已可鑒定超過600種的細菌。鑒定過程中，可根據(jù)細菌所屬類群選擇適當?shù)纳砩b定系列，通過軟件將待測細菌與數(shù)據(jù)庫參比，得出鑒定結果。 CICC目前可應用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列對乳酸桿菌（Lactobacillus sp.）和相關細菌、芽孢桿菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌屬 （Staphylococcus sp.）、微球菌屬（Micrococcus sp.）和庫克菌屬（Locuria sp.）進行鑒定。 （5）功能性分析及功能基因 CICC不斷致力于工業(yè)微生物資源的功

6、能及其功能基因研究，目前通過木聚糖酶、纖維素酶、葡萄糖異構酶、-甘露聚糖酶等功能基因的克隆進行菌種產(chǎn)酶的功能性分析。應用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌種鑒定，在某些種、亞種、株間有較好的分辨效果。 （6）RAPD、SSCP技術 隨著微生物菌種應用的進一步發(fā)展，在食品安全管理、生物產(chǎn)品出口認證、知識產(chǎn)權保護等行業(yè)需求日益增加，微生物菌種株水平的鑒別技術成為一個迫切需要解決的問題。 CICC采用隨機擴增多態(tài)性DNA（Randomly amplified polymorphism DNA，RAPD）技術和單鏈構象多態(tài)性(Single Strand Conformation Poly

7、morphism，SSCP）技術對微生物菌株進行鑒別。如采用RAPD技術能夠?qū)ν痪N原始菌株與誘變菌株進行鑒別，對誘變菌株知識產(chǎn)權保護具有重要意義；采用SSCP技術進行工業(yè)酒精酵母菌株的鑒別，此技術結合菌株發(fā)酵特性，在酒類生產(chǎn)的質(zhì)量控制方面起到積極作用。 （7）TLC薄層層析 CICC將TLC薄層層析技術應用于微生物菌種鑒定，進行細菌、放線菌細胞壁化學組分分析（氨基酸、糖），作為劃分屬特征的重要鑒定技術手段，起到了良好的輔助作用。 （8）全細胞脂肪酸分析鑒定系統(tǒng) 采用Sherlock全自動細菌鑒定系統(tǒng)，通過對不同菌株的脂肪酸圖譜進行分析，并與標準數(shù)據(jù)庫進行比對，來鑒定細菌及酵母。該技術是細菌

8、或酵母種水平鑒定的有效手段之一。 （9）（GC）mol及DNA/DNA雜交 CICC通過采用DU800核酸蛋白分析儀測定Tm值，從而得到微生物菌株的（GC）mol，并與模式菌株進行DNA/DNA同源性分析，該鑒定技術手段是多相鑒定的重要組成部分。 （10）其他手段 CICC可根據(jù)客戶的特殊要求，為您量身定做，提供相應的技術服務，具體事宜請來電咨詢。 菌種鑒定一般就只要提取基因組DNA，然后PCR擴增16srDNA片段，上GeneBank或者Eztaxon對比即可。一般序列相似度在97%以上就可以認為是同種細菌（當然也有例外，DNA序列僅僅是一個參考指標）。 篇二：菌種鑒定的分子生物學方法 菌種

9、鑒定的分子生物學方法 16S rDNA測序鑒定菌種 一 原理 細菌中包括有三種核糖體RNA，分別為5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。5S rRNA雖易分析，但核苷酸太少，沒有足夠的遺傳信息用于分類研究；23S rRNA含有的核苷酸數(shù)幾乎是16S rRNA的兩倍，分析較困難。而16S rRNA相對分子量適中，又具有保守性和存在的普遍性等特點，序列變化與進化距離相適應，序列分析的重現(xiàn)性極高，因此，現(xiàn)在一般普遍采用16S rRNA作為序列分析對象對微生物進行測序分析。16S rRNA對應于基因組DNA上的一段基因序列稱為16S rDNA，rRNA基因由保守區(qū)和可變區(qū)組成。在細菌的1

10、6SrDNA中有多個區(qū)段保守性，根據(jù)這些保守區(qū)可以設計出細菌通用物，可以擴增出所有細菌的16SrDNA片段，并且這些引物僅對細菌是特異性的，也就是說這些引物不會與非細菌的DNA互補，而細菌的16S rDNA可變區(qū)的差異可以用來區(qū)分不同的菌。因此，16SrDNA可以作為細菌群落結構分析最常用的系統(tǒng)進化標記分子。隨著核酸測序技術的發(fā)展，越來越多的微生物的16S rDNA序列被測定并收入國際基因數(shù)據(jù)庫中，只要將基因序列放入基因數(shù)據(jù)庫進行對比，便可快速的鑒定所測定的細菌種屬，這樣用16Sr DNA作目的序列進行微生物群落結構分析更為快捷方便。 二 技術路線 該方法包括細菌基因組DNA提取、16S rD

11、NA特異引物PCR擴增、擴增產(chǎn)物純化、DNA測序、序列比對等步驟。具體技術路線如下： 三 方法步驟 （一）細菌基因組DNA提?。附夥ǎ?1. 挑取單菌落接種到10 mL LB培養(yǎng)基中37振蕩過夜培養(yǎng)。 2. 取2 mL培養(yǎng)液到2 mLEP管中，8000 rpm離心2分鐘后倒掉上清液。 3. 加140 LTE打散細菌，再加入60 L 10 mg/ml的溶菌酶。37放置10分鐘。 4. 加入400 L Digestion Buffer，混勻。再加入3 L 蛋白酶K，混勻，55溫育5分鐘。 5. 加入260 L乙醇，混勻，全部轉入UNIQ-10柱中。10000 rpm離心1分鐘，倒去收集管內(nèi)的液體

12、。 6. 加入500 L 70乙醇（Wash Solution），10000 rpm離心0.5分鐘。 7. 重復第六步。 8. 再10000 rpm離心2分鐘徹底甩干乙醇。吸附柱轉移到一個新的1.5mL的離心管。 9. 加入50L預熱(60)的洗脫緩沖液，室溫放置3分鐘。12000 rpm離心2分鐘，流下的液體即為基因組DNA。 10. 電泳。取3L溶液電泳檢測質(zhì)量。 注：如果待測菌為乳酸菌等不產(chǎn)生芽孢的菌類，且菌種非常純凈單一，則可以用直接煮沸法。 （二）PCR擴增 1. 根據(jù)16S rDNA序列設計保守的擴增引物。 27 F： 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 1492 R

13、： 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 2. PCR擴增體系： 按下表加入引物、模板、Mix和ddH2O，建立PCR擴增體系（50L） 3. PCR將EP管放入PCR儀，蓋好蓋子，調(diào)好擴增條件。擴增程序如下為： 4. PCR拿出EP管，從中取出5 L反應產(chǎn)物，加入1 L上樣緩沖液。點入預先制備好的1%的瓊脂糖凝膠中。電泳30 min。在紫外燈下檢測擴增結果。 （三）擴增片段的回收 根據(jù)上步實驗結果，如果擴增產(chǎn)物為唯一條帶，可直接回收產(chǎn)物。否則從瓊脂糖凝膠中切 割核酸條帶，并回收目的片段。 1. 稱量一2mL的EP管質(zhì)量，記錄。 2. 在紫外燈下切割含目的條帶的凝膠，放入2 mL的P

14、管內(nèi)，稱量。計算凝膠質(zhì)量。 3每100 mg凝膠加入100 L Binding Buffer，混勻。60溫育至凝膠融化。 4全部轉入UNIQ-10柱中。10000 rpm離心1分鐘，倒去收集管內(nèi)的液體。 5加入500 LBinding Buffer，10000 rpm離心1分鐘，倒去收集管內(nèi)的液體。 6加入70乙醇（Wash Solution），10000 rpm離心0.5分鐘。 7再10000 rpm離心2分鐘徹底甩干乙醇。吸附柱轉移到一個新的1.5ml的離心管。 8加入30L預熱的洗脫緩沖液，室溫放置3分鐘。12000 rpm離心2分鐘，流下的液體即為回收的DNA片段。 （四）DNA片段測

15、序 將回收的片段送至生物公司測序，測序引物為16S PCR引物。 （五）序列比對 將測序的結果在NCBI上進行序列比對，根據(jù)比對結果得出鑒定菌種。 *主要儀器： 1. PCR儀（用于進行PCR擴增反應，一般國產(chǎn)價格在2-3萬元，最低也要1.8萬左右） 2.電泳儀（用于瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，一般國產(chǎn)幾個在3000左右） 附錄：實驗試劑表。 篇三：菌種鑒定實驗過程 一、儀器與試劑 1 1. 二、實驗過程 1、基因組DNA提取 按SK8255（細菌）、 SK8259（真菌）、 SK8257（酵母）試劑盒操作。 2、PCR擴增 2.2 PCR反應體系： 2.3 PCR循環(huán)條件： 3、凝膠電泳 1

16、瓊脂糖電泳，150V、100mA 20min電泳觀察（見電泳圖DNA Ladder Mix make）。16SrDNA18SrDNAITS 26S 4、純化回收 PCR產(chǎn)物電泳條帶切割所需DNA目的條帶，純化方式見附見說明書（SK8131 ），PCR產(chǎn)物用PCR引物直接測序。 如需要做克隆測序需要進行下面的步驟： 5、連接 ? 按Takara pMD18-T Vector 連接試劑盒操作。 6、感受態(tài)細胞的制備：（氯化鈣法） 6.1 從于37培養(yǎng)16小時的新鮮平板中挑取一個單菌落，轉到一個含有100 ml LB培養(yǎng)基的1 L燒瓶中。于37劇烈振搖培養(yǎng)3小時(旋轉搖床，300轉分)。 冰上放置1

17、0分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至 0。 6.3 于 4 , 以4000轉分離心10分鐘，回收細胞。 6.4 倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘,使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。 6.5 以10 ml用冰預冷的 0.1 molL CaCl2重懸每份沉淀，放置于冰浴上。 6.6 于 4,，以4000 轉分離心10分鐘，回收細胞。 6.7 倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘,使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。 6.8 每50ml 初始培養(yǎng)物用 2 ml 用冰預冷的0.1 mol/L CaCl2(含20%甘油)重懸每份細胞沉淀。 6.9 將細胞分裝成小份(100l/支)，放于-70凍存。 7、連接產(chǎn)物轉化 7.1 取100?l感受態(tài)細胞

18、，置于冰上，完全解凍后輕輕將細胞均勻懸浮。 7.2 加入10?l連接液，輕輕混勻。冰上放置30分鐘。 7.3 42水浴熱激90秒。冰上放置1520分鐘。 7.4 加400?l LB培養(yǎng)基，37 200250 rpm振蕩培養(yǎng)1小時。 7.5 用槍頭吸取200 ?l培養(yǎng)菌液，涂布在預先用20?l 100 mM IPTG和100?l 20 mg/ml X-gal 涂布的氨芐青霉素平板上。 7.6 平板在37下正向放置1小時以吸收過多的液體，然后倒置培養(yǎng)過夜。 8、藍白斑篩選 當外源DNA片段插入到pUC57中后，由于外源DNA的核酸序列存在改變了LacZ基因的編碼，從而影響了其產(chǎn)物?半乳糖苷酶?片段

19、的活性，因此重組克隆在X-gal/IPTG平板上呈現(xiàn)為白色，而非重組克隆呈藍色，選擇在IPTG/X-gal平板上生長的白色菌落， 9、質(zhì)粒提取與測序 用M13+_引物擴增（體系如上）。.M13+/-引物測序 三、測序結果分析 16SrDNA 序列在核糖體數(shù)據(jù)庫 上比對； 比對結果范例： domain Bacteria (0/20/1186838) （界） phylum “Actinobacteria” (0/20/176308)（門） class Actinobacteria (0/20/176308) （綱） subclass Actinobacteridae (0/20/167455) （