【Z】BDFCSCalibur流式細(xì)胞儀操作手冊(cè)413

1、BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀FACS101Handbook本課程推薦表面抗原流式分析有關(guān)之基礎(chǔ)工作原理。如希望進(jìn)一步了解流式細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用，請(qǐng)至本公司網(wǎng)站訂閱FACSinformation電子報(bào).tw/bdb/index.html如需要本課程手冊(cè)，歡迎至本公司網(wǎng)站下載.tw/bdb/10-5-3-1.html。如需要免疫熒光染色方法，請(qǐng)至本公司網(wǎng)站下載.tw/bdb/10-5-4-1.html一、BDFACSCalibur基本結(jié)構(gòu)1.1儀器本體:1 .電源開(kāi)關(guān)：在BDFACSCalibur儀器右側(cè)下方，先啟動(dòng)儀器本體，再打開(kāi)計(jì)算機(jī)。鞘流液液流遇油器2 .光學(xué)系統(tǒng)：BDFACSCalibu

2、r基本配有一支波長(zhǎng)488nm的僦離子雷射以BDFACSCalibur基本型為例FSCDiode只收488nm波長(zhǎng)散射光SSCPMT只收488nm波長(zhǎng)散射光FL1PMT熒光光譜峰值落在綠色范圍（波長(zhǎng)515-545nm）FL2PMT熒光光譜峰值落在橙紅色范圍（波長(zhǎng)564-606nm）FL3PMT熒光光譜峰值落在深紅色范圍（波長(zhǎng)>650nm）產(chǎn)，l#li卡總rtfinclivtif3.LO：樣品流速：12/minMED:樣品流速：35日/minHI：樣品流速：60日/minRTC£JFPFMLPCFSlEBOTHHduiPrm抵itsTOTO-ImPRdlF1WKJCfeil0vii

3、LAJvXt仲R儀器面板：儀器前方面板的右下方有三個(gè)流速控制鍵、及三個(gè)功能控制鍵。流速控制:功能控制:RUN:此時(shí)上樣管加壓，使細(xì)胞懸液從進(jìn)樣針進(jìn)入流動(dòng)室。（正常顯示綠色。黃色時(shí)表示儀器不正常，請(qǐng)檢查是否失壓。） STANDBY:無(wú)樣品或暖機(jī)時(shí)之正常位置，此時(shí)鞘液停止流動(dòng)，雷射功率自動(dòng)降低。 PRIME:去除流動(dòng)室中的氣泡，流動(dòng)室施以反向壓力，將液流從流動(dòng)室沖入樣品管，持續(xù)一定進(jìn)度后，以鞘液回注滿流動(dòng)室。PRIME結(jié)束，儀器恢復(fù)STANDBY狀態(tài)。4.儲(chǔ)液箱抽屜：在主機(jī)左下方之儲(chǔ)液箱抽屜?？上蚯袄_(kāi)，內(nèi)含鞘流液筒、廢液筒、鞘液過(guò)濾器SheathFilter,及空氣濾網(wǎng)Airfilter。請(qǐng)注意

4、氣路減壓閥VENTTOGGLE之位置。 鞘液筒：位于抽屜左側(cè)，容積4升。裝八分滿鞘液筒，儀器可以運(yùn)行大約3小時(shí)。筒上裝有液面感應(yīng)器，鞘液用完時(shí)，儀器軟件上會(huì)有顯示。鞘液筒蓋上有金屬環(huán)扣，保證鞘液筒密閉。 廢液筒：位于抽屜右側(cè)，容積4升。筒上裝有液面感應(yīng)器，廢液盛滿時(shí)，儀器軟件上會(huì)有顯示。注意廢液可能有潛在的生物傳染性。 鞘液過(guò)濾器：0.22Mm過(guò)濾器，去除鞘液中的雜質(zhì)，保證進(jìn)入流動(dòng)室的鞘液是干凈的。 氣路減壓閥：沿箭頭方向移動(dòng)閥門開(kāi)關(guān)，鞘液筒減壓，氣壓恢復(fù)正常。在鞘液筒添加鞘液時(shí)，需要減壓。 空氣過(guò)濾網(wǎng)：用于過(guò)濾冷卻雷射的空氣。5.上樣品區(qū):上棟管支撐架上樣品區(qū)是樣本管的上樣位置。它包括三個(gè)部

5、分，一個(gè)是進(jìn)樣針SampleInjectionTube,將樣本輸入流動(dòng)室，還有就是支撐架TubeSupportArm、和液滴存留系統(tǒng)DropletContainmentSystem。進(jìn)樣針：是一根不銹鋼管，將細(xì)胞從樣本針中吸入流動(dòng)室。進(jìn)樣管外有一套管，是液滴保留系統(tǒng)的一部分。支撐架：用于支撐樣本管、并負(fù)責(zé)啟動(dòng)液滴存留系統(tǒng)。支撐架有三個(gè)位置:位于樣本管之下的中位，樣本管左側(cè)或右側(cè)。液滴存留系統(tǒng)：系統(tǒng)由支撐架、真空幫浦和外套管組成。當(dāng)支撐架位于左側(cè)或右側(cè)位置時(shí)，真空幫浦就會(huì)啟動(dòng)，將液體從外管吸入廢液筒內(nèi)。上樣時(shí)，須注意將支撐架位于中位，以避免過(guò)多樣品被抽吸到廢液筒內(nèi)（當(dāng)支撐架位于中位，真空幫浦停止

6、工作）。更換樣品時(shí)，讓儀器保持RUN勺模式，使得進(jìn)樣針可以反沖。切換到STANDB模式前，確保液路已沖洗徹底以免碎片沈積到流動(dòng)室中。1.2Macintosh計(jì)算機(jī)與打印機(jī):準(zhǔn)備您的細(xì)胞樣品1.2.夢(mèng)想樣品濃度調(diào)至細(xì)胞樣品務(wù)必放至1-10X105cells/ml?一般實(shí)驗(yàn)只需0.5ml的樣品。BDFALCON352052試管中，否則無(wú)法上機(jī)。3.上機(jī)前務(wù)必去除樣品中之細(xì)胞團(tuán)塊，以防止管路堵塞？可使用附濾網(wǎng)BD4.5.二、開(kāi)機(jī)、FALCON試管(Cat.No.352235)或35-55Mm的尼龍篩網(wǎng)。供流式分析的樣品是單細(xì)胞懸浮液，而且大部分樣品都需經(jīng)熒光染色。表面抗原熒光染色的方法大致有兩種：直

7、接免疫熒光、間接免疫熒光染色。研究生可至本公司網(wǎng)站下載染色方法.tw/bdb/10-5-4-1.html直接免疫熒光染色 Lysed-No-WashProcedure Lysed-And-WashProcedure,SimulTEST&HLA-B27 PeripheralBloodMononuclearCellProcedure LeukemiaandLymphomaProcedure1 LeukemiaandLymphomaProcedure2,B-cellClonalityAssay 間接免疫熒光染色 滴定抗體濃度 常用試劑e-mail:.tw。如因特殊因素?zé)o法下載上述實(shí)驗(yàn)方法，請(qǐng)

8、關(guān)機(jī)標(biāo)準(zhǔn)制作2.1 FACSCalibur開(kāi)機(jī)1 .開(kāi)啟細(xì)胞儀電源。2 .開(kāi)啟其它周邊配備電源，如打印機(jī)及MO機(jī)。3 .開(kāi)啟計(jì)算機(jī)。4 .確認(rèn)鞘流液筒有八分滿的FACSFlow,確實(shí)旋緊（鞘液筒容量為4L）。5 .將廢液倒掉，并在廢液筒中加入200ml家用漂白水（廢液筒容量為4L）。6 .將減壓閥方向調(diào)在加壓（Pressurize）位置。7 .排除液流管路與過(guò)濾器中的氣泡。8 .取下樣品管，執(zhí)行PRIME功能兩次。9 .使用1mlPBS,HIGHRUN兩分鐘。10 .可開(kāi)始分析樣品。2.2 FACSCalibur關(guān)機(jī)關(guān)機(jī)前必要?jiǎng)幼鳎呵逑催M(jìn)樣管和外套管，防止進(jìn)樣管堵塞、或有染料殘留。1. 將樣品

9、支持架左移，取2mlFACSClean（10%Bleach）上樣品，讓儀器的真空系統(tǒng)抽取約1ml的液體。2. 將樣品支持架回正，按HIRUN，然后讓FACSClean清洗管路10分鐘。3. 按Standby，取下樣品管，執(zhí)行PRIME功能兩次。4. 取2mldH2O，重復(fù)上述步驟1-3。5. 注意最后只留約1mldH2O在試管中。6. 按STANDBY五分鐘，使風(fēng)扇冷卻雷射后，關(guān)閉細(xì)胞儀（必要?jiǎng)幼?，以保護(hù)雷射光源。）7. 倒掉廢液，并回填200ml漂白水。8. 將減壓閥放在VENT漏氣位置。將鞘流液筒充填至八分滿。9. 退出軟件“File”“Quit”（如有對(duì)話選項(xiàng)，選擇“Dontsave”）

10、。確認(rèn)退出計(jì)算機(jī)中所有BD應(yīng)用軟件，所有數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)已儲(chǔ)存?zhèn)浞荨?0. 關(guān)閉計(jì)算機(jī)?！癝pecial”“Shutdown”。三、上機(jī)分析進(jìn)程安建議首次試機(jī)避免進(jìn)行大量試驗(yàn)，僅需準(zhǔn)備下列樣品。（1）NegativeControl（不加任何抗體）。（ 2） CD3-FITC（FL1單染）。（ 3） CD19-PE（FL2單染）。（ 4） CD3-FITC/CD19-PE（FL1/FL2雙染）。1.1 Calibur開(kāi)機(jī)1. 先開(kāi)啟細(xì)胞儀本體再打開(kāi)計(jì)算機(jī)。*秘技1：如順序相反，儀器和計(jì)算機(jī)之間無(wú)法建立正常通訊，無(wú)法執(zhí)行“connecttocytometer”。解決之道，兩者都關(guān)機(jī)、然后以正確方式重開(kāi)。2

11、. 向前拉開(kāi)儲(chǔ)液箱抽屜，檢查鞘液筒、廢液筒水量，如需充填鞘液，將減壓閥方向調(diào)在VENT位置（箭頭方向）。3. 儀器會(huì)對(duì)鞘流液筒打氣加壓，請(qǐng)確認(rèn)筒蓋確實(shí)旋緊。*秘技2：將減壓閥方向調(diào)在加壓（向前）位置。減壓閥如在VENT（箭頭方向）位置，按RUN功能鍵時(shí)將顯示橙黃色（表示儀器不正常，請(qǐng)檢查是否失壓），正常為綠色顯示。1.2 開(kāi)啟CellQuest軟件、編輯實(shí)驗(yàn)文件4 .在蘋果菜單下點(diǎn)擊CELLQuest啟動(dòng)軟件。桌面會(huì)出現(xiàn)一Untitled'實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的右上角的放大鈕，將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。5 .從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，拖曳對(duì)角線至適當(dāng)大小，然后放開(kāi)

12、鼠標(biāo)。出現(xiàn)散點(diǎn)圖對(duì)話方框。散&四6 .在出現(xiàn)的散點(diǎn)圖對(duì)話方框中點(diǎn)擊PlotSource,選擇Acquisition（收?。?，確認(rèn)X和Y軸參數(shù)預(yù)設(shè)為FSC-H1024、SSC-H1024。在顏色方框中點(diǎn)擊MulticolorGating（收取樣品時(shí)，門內(nèi)細(xì)胞將出現(xiàn)顏色）。點(diǎn)擊OK。此時(shí)實(shí)驗(yàn)文件會(huì)出現(xiàn)FSC/SSC散點(diǎn)圖。7 .說(shuō)明：散點(diǎn)圖（Dotplot）,又稱二維散點(diǎn)圖是流式分析最常用圖譜，它可以顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)的相互關(guān)系。在圖中，橫坐標(biāo)X軸為為熒光1強(qiáng)度的相對(duì)值，單位是道數(shù)，縱坐標(biāo)Y軸則通常表示熒光2或光散射強(qiáng)度的相對(duì)值。儀器使用者可因應(yīng)實(shí)驗(yàn)需求來(lái)修改所有圖譜中顯示之參數(shù)。第一圖X和

13、Y軸參數(shù)分別設(shè)為FSC-H1024、SSC-H1024。第二圖X和丫軸參數(shù)分別設(shè)為FL1-H1024、FL2-H1024。修改動(dòng)作為輕擊圖譜上X和Y軸參數(shù)，并依需要選擇之（FSC:細(xì)胞大小，SSC:細(xì)胞折射率，F(xiàn)L1:FITC綠色熒光，F(xiàn)L2:PE橙色熒光，F(xiàn)L3:PerCP紅色熒光）。8 .從屏幕上方Plots菜單中選擇DotPlot功能，可復(fù)制一個(gè)同樣大小的散點(diǎn)圖，在出現(xiàn)的對(duì)話方框內(nèi)選擇X軸：FL1-H1024,Y軸：FL2-H1024。點(diǎn)擊OK,FL1/FL2的散點(diǎn)圖出現(xiàn)。完成后可將重制圖移至原圖右方。9 .在工具板中選擇四象限工具，在FL1/FL2散點(diǎn)圖上拖動(dòng)Quadrant的中心將它

14、設(shè)定在(x,y)=(101,101)處，這些象限將指定陰性/陽(yáng)性區(qū)域。建立儀器和計(jì)算機(jī)之間通訊10 .從Acquire菜單中選擇ConnecttoCytometer,此時(shí)會(huì)出現(xiàn)AcquisitionControl對(duì)話方框。如果無(wú)法選擇ConnecttoCytometer,參考秘技#1。如果沒(méi)見(jiàn)到AcquisitionControl對(duì)話，可到屏幕上方Windows菜單中選擇ShowAcquisitionControlo口中二：二二正；二二：植ionContTMDFile：HSetup|AcquireRestartAbort儀器設(shè)置文件注意：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量，取決于最適化儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件不能

15、在數(shù)據(jù)收取后再更改，研究人員必須在第一次就使用正確的儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件(Instrumentsettings),含信號(hào)器高壓(Detector/Amps),閾值(Threshold),熒光補(bǔ)償(Compensation)等儀器條件的組合。一般而言，儀器設(shè)定的順序?yàn)镈etector/Amps-Threshold-Compensation。11.檢查現(xiàn)有儀器條件，從Cytometer菜單中選擇Detectors/AmpsDetectors/Amps性放大)，其它拖至空白區(qū)。出現(xiàn)Detectors/Amps窗口。在窗口確認(rèn)FSC與SSC為L(zhǎng)IN(線FL1-3為L(zhǎng)OG(對(duì)數(shù)放大)Cytomet

16、erPlatsGenetecfors/flmpsThreshold妹CompensationStatusInstrumentSetting：SortCountersTime-Del。目Clibr©tak4LJk4'：.：.：Threshold-1-»I-I181-1S-1-S1|7JPrimarySecondaryszgP-rom：®FSC-HS2gjQSSC-KOSSC-Hs.j0FL1-HOFL1-HQFLZ-HOFL2-H5,QFL3-HOFL3-HS26JQFL4-HNone12 .從Cytometer菜單中選擇Threshold,出現(xiàn)Thresh

17、old窗口在Threshold窗口：確認(rèn)FSC為設(shè)閾參數(shù)，初步確認(rèn)預(yù)設(shè)閾值52。將其拖至空白區(qū)。13 .從Cytometer菜單中選擇Compensation,確認(rèn)所有預(yù)設(shè)數(shù)值皆為零。將其拖至空白區(qū)。3.3上樣品、設(shè)置儀器14 .使儀器處于HighRUN,支撐架左移，上陰性對(duì)照管樣品，支撐架回位。確認(rèn)AcquisitionControl窗口中Setup前需打叉或打勾（即不儲(chǔ)存數(shù)據(jù)），點(diǎn)擊Acquire。調(diào)節(jié)FSC/SSC探測(cè)器（電壓）15 .觀察FSC/SSC圖的變化。FSC電壓（Voltage）預(yù)設(shè)為E00,可調(diào)節(jié)AmpGain從1.009.99使主要細(xì)胞群得以清楚顯示（如細(xì)胞較大，將FSC

18、電壓設(shè)置于E-1。較小細(xì)胞，將FSC電壓設(shè)置于E01）。調(diào)節(jié)SSC電壓使主要細(xì)胞群得以清楚呈現(xiàn)。調(diào)節(jié)FSC/SSC圖的原則，在于能得到一獨(dú)立離散的細(xì)胞族群，該細(xì)胞群不與其它族群、細(xì)胞碎片有重迭現(xiàn)象。調(diào)整定位后，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Pause。Gating圈選細(xì)胞檢品中，常含有大小不同、性質(zhì)相異的細(xì)胞群體。我們常用前方散射與側(cè)方散射的二維位圖，即散射光圖譜（ScatterPlot）,來(lái)圈選出不同細(xì)胞群的范圍，選擇性顯示出有意義的細(xì)胞群體，如下圖圈選白血球之淋巴細(xì)胞族群。16 .在工具板中選才i多邊形的Region,在FSC/SSC散點(diǎn)圖上劃定淋巴細(xì)胞R1區(qū)域（如下圖）

19、。分析樣品時(shí)，區(qū)域內(nèi)細(xì)胞應(yīng)會(huì)呈現(xiàn)成紅色，可移動(dòng)或改變形狀來(lái)圈選有意義的細(xì)胞。如果要?jiǎng)h除R1區(qū)域，您可以在工具列中點(diǎn)選GatesRegionFormatdotplot望Gate的FoG1=R1。點(diǎn)擊IOK。量核球淋巴球plo5.5-OJ£17.至i一黑苞性球【圖，從Plots菜單中選擇的對(duì)話方框內(nèi)，將FSCFSC-H255在出現(xiàn)品.二.調(diào)節(jié)FL1、FL2山黃翎能沁擊J睇9/24list,以鼠標(biāo)點(diǎn)選R1,再按Delete鍵刪除R1區(qū)域。刪除R1區(qū)域后,可用繪圖工具板，重畫R1。18 .點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Restart。在Detector/Amps窗口中調(diào)節(jié)F

20、L1、FL2的電壓，使NegativeControl細(xì)胞群著落在所選直方圖或散點(diǎn)圖之100-101處。19 .在Threshold窗口，適當(dāng)?shù)靥岣逨SC閾值52,以去除碎片或低階噪音。唯需注意不要切掉主要細(xì)胞族群。20 .點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Pause、Abort。移去陰性對(duì)照管，關(guān)閉Detector/Amps、Threshold窗口，我們已設(shè)定好有意義細(xì)胞群之自體熒光。調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償說(shuō)明：最適化的最后一步是調(diào)節(jié)光譜重迭。（如是單色熒光實(shí)驗(yàn)可跳過(guò)此步驟）如是2色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié)FL2-%FL1,FL1-%FL2（若3色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié)FL2-%FL1、FL1-%F

21、L2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的補(bǔ)償）。FL2-。礁毒FL1FL3FL3-。姍%FL2FL3-Q創(chuàng)fl密:感：%FL4FL4-%FL3FLI-0.0®鬟FL221 .HighRUN,換上單染CD3-FITC管。點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Acquire。調(diào)節(jié)FL2-%FL1使FITC陽(yáng)性細(xì)胞在FL1/FL2散點(diǎn)圖的右下象限。補(bǔ)償調(diào)節(jié)可通過(guò)點(diǎn)擊J來(lái)選擇或直接拖動(dòng)滑標(biāo)上下移動(dòng)。調(diào)節(jié)完畢，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Pause。22.移去單染CD3,換上單染CD19-PE管。點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Restart。調(diào)

22、節(jié)FL1-%FL2使PE+細(xì)胞在FL1/FL2散點(diǎn)圖的左上象限。調(diào)節(jié)完畢，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Pause。23.最后以CD3-FITC/CD19-PE雙染樣本上機(jī)，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Restart,確定三群細(xì)胞工整垂直。當(dāng)您已完成2色熒光之光譜重迭時(shí)，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Pause、Abort。3Fit-0.3#霽FL2FLZ-36.哪落FL1FL?-o.olfl客FL3FL5-zz.elfl塞fL2FL3-需FL4FL4-立礴%fL3旦:二二”g則廳口51小二二：回CratedonLymphos10

23、6;101103103FL1，H口BLmoL工CN-JIL.10*24.移去樣本管，換上dH2O管，讓儀器暫且處于Standby狀態(tài)。關(guān)閉Compensation窗口。您已完成2色熒光之最適化。3.4收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)決定儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù)25.預(yù)設(shè)之儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù)為10000。如需修改，從Acquire菜單中選擇Acquisition&Storage,并在出現(xiàn)的窗口功，確認(rèn)CollectionCriteria從10000ofAll,再點(diǎn)擊OK。Require|flequisitipnPforageParameterDesEriptionEustomKeyiuardsCountersEditReag

24、entlist,.EditPanels.QuantiQuestDisconnectfromCytom;jevcnls.FACSCalikurC-lI匕通tiuiiCrittriikjeYtnts中乾»iinU4舄w4llvbei>StaraqBGale：PatafinewillctnUln-IEancel1IResoPullion.L-2J1UN4PflirameteFSSaved.gtwIFlowEventCount：Jcvcnt4.26 .找個(gè)檔案匣準(zhǔn)備儲(chǔ)存數(shù)據(jù)。從Acquire菜單中選擇ParameterDescription,出現(xiàn)ParameterDescription

25、對(duì)話方框。點(diǎn)擊Folder,并在隨后出現(xiàn)之對(duì)話方框，選擇YourFolder或新建活頁(yè)夾，點(diǎn)擊此對(duì)話方框的Select'YourFolder'。27 .命名即將儲(chǔ)存之文件名：點(diǎn)擊ParameterDescription對(duì)話方框的File,出現(xiàn)文件名編輯窗口。在CustomPrefix中：輸入文件名20031231，點(diǎn)擊此對(duì)話方框的OK。日期為最常用之文件名系統(tǒng)。28.Optional:如有需要，可選擇或在P1-P5后的空格中輸入相關(guān)參數(shù)名。如P1:Size,P2:Granularity,P3:CD3FITC。輸入?yún)?shù)名會(huì)存入實(shí)驗(yàn)檔案中，顯示在圖譜上。ParameterOescr

26、iption；：目Windov：itniHledFolder：FACStitioirG.eslFolder：.FalderJFHcNamt：Data.ODI|SarapfeID：|PatientIt：.ICornmentsjCDa©©(1)1313口PanelIMK卬.11|拿1ube：；IJLW計(jì)數(shù)器Counters口口三五三;三"三三江五/CQunters江王三常;三不評(píng)二三國(guó)ToUIEvents：38?5vent3/Second:150ResMElapsedTime：0：Oi24'29 .從Acquire菜單中選擇Counters.窗口會(huì)顯示樣品分析

27、速率、與總數(shù)進(jìn)度。收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)30 .你可以開(kāi)始收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)了。HIGHRUN,將第一管樣品放到檢測(cè)區(qū)，在AcquisitionControl窗口中，將Setup改成Setup,此時(shí)CellQuest會(huì)自動(dòng)顯示YourFolder:20031231.001為資料文件名。點(diǎn)擊“Acquire”便可啟動(dòng)樣品之分析測(cè)定與數(shù)據(jù)儲(chǔ)存。當(dāng)計(jì)算機(jī)成功地收取足夠數(shù)據(jù)，會(huì)自動(dòng)儲(chǔ)存數(shù)據(jù)文件20031231.001,并會(huì)以“嘟”聲告知，CellQuest會(huì)自動(dòng)升哥附加檔名成20031231.002。等待下一指示。31 .你可以換上下一管樣品，點(diǎn)擊“Acquire”啟動(dòng)樣品之分析測(cè)定與數(shù)據(jù)儲(chǔ)存。可繼續(xù)分析直到所有檢品

28、都分析完畢。3.5實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之儲(chǔ)存與備份：32 .不建議長(zhǎng)期使用硬盤儲(chǔ)存數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，可考慮以燒光盤(如配有CD-RW)、口袋硬盤(FlashDrive)來(lái)備份大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以免占用原有硬盤的內(nèi)存，影響數(shù)據(jù)處理速度。可將備份后之?dāng)?shù)據(jù)，拿到另一蘋果計(jì)算機(jī)或我PC進(jìn)行離機(jī)分析。33 .確認(rèn)所有檔案皆己備份后，以鼠標(biāo)圈選欲刪除數(shù)據(jù)，將其拖拉至Trash筒。退出軟件34 .檢品分析完畢后，記得從屏幕上方File指令欄選擇SaveAs,儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)文件，以備日后使用，不需每次重新編輯。35 .從屏幕上方Cytometer指令欄，選擇InstrumentSetting,出現(xiàn)InstrumentSetting窗口。點(diǎn)

29、系print打印此次實(shí)驗(yàn)條件，可貼入實(shí)驗(yàn)筆記留底，再點(diǎn)擊Save以儲(chǔ)存此一實(shí)驗(yàn)的儀器條件，供日后再使用。點(diǎn)系SAVE后會(huì)出現(xiàn)文件保存對(duì)話方框，選擇文件目錄及文件名(例：YourFolder:/YourSetting1)，點(diǎn)擊Save。點(diǎn)擊Done。InstrumentSe1tinq$Type：VoltageIE80ISO15H15B158FHC5CQLibtirflapGainI.69A.HB1.SBV.69ft.09*nodeLogLogLogLogLogLinIJH.RevertDisplaying：CurrentStatusPrimUJPmPpn二36 .檢品分析完畢后，用鼠標(biāo)從屏幕上方

30、Acquire指令欄中，選取DisconnecttoCytometer以斷絕計(jì)算機(jī)與儀器間之聯(lián)機(jī)。之后如不分析數(shù)據(jù)，您可退出軟件“File”“Quit”(遇有選項(xiàng)永遠(yuǎn)選擇"Dont'save”)，進(jìn)行關(guān)機(jī)程序。管路清洗37 .以2ml10%漂白水取代樣品，將樣品架置于左位以外管吸除約1ml,再將樣品架置于中位HIRUN十分鐘。改用2mlDIwater。重復(fù)上述程序，樣品架上留約1mlDIwater。按STANDBY五分鐘。關(guān)主機(jī)、關(guān)計(jì)算機(jī)四、數(shù)據(jù)分析FCSlistmode數(shù)據(jù)文件：說(shuō)明：FCSlistmode數(shù)據(jù)文件是流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)格式檔案（FCS2.0）。該文件含有從流式

31、細(xì)胞儀收取的平均10,000個(gè)細(xì)胞數(shù)的資料，含有46個(gè)參數(shù)。一般軟件無(wú)法打開(kāi)listluul01010mode數(shù)據(jù)文件，需藉助如CellQuest,WinList,WinMDI,等Flow分析軟件，才可開(kāi)啟、繪圖、并進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。mil01(11007219g.0014.1 開(kāi)啟一CellQuest實(shí)驗(yàn)文件1 .從屏幕上方File菜單中選擇New。桌面會(huì)出現(xiàn)一Untitled'實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的右上角的放大鈕，將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。4.2 散點(diǎn)圖之統(tǒng)計(jì)分析（雙色）2.從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，然后拖動(dòng)對(duì)角線至適當(dāng)大小。Plot拖曳完成后可以在右方看到Dot

32、Plot對(duì)話框。3 .在DotPlot方框中，PlotSource應(yīng)預(yù)設(shè)為Analysis,可點(diǎn)擊SelectFile鈕，并用隨后之方框來(lái)開(kāi)啟預(yù)存之SampleFiles,它們的路徑位于MacHD:BDApplications:CellQuestFolder:SampleFiles。連續(xù)雙擊鼠標(biāo)來(lái)打開(kāi)次目錄，找到檔案后，點(diǎn)擊Open來(lái)開(kāi)啟NORM001檔案。X與Y參數(shù)項(xiàng)會(huì)出現(xiàn)默認(rèn)值一FSC-H256與SSC-H256，在Color方框中點(diǎn)擊MulticolorGating，確認(rèn)無(wú)誤之后，點(diǎn)擊OK便完成了一個(gè)NORM001的FSC/SSC散點(diǎn)圖。4 .工具板中選擇多角形區(qū)隔工具，將Cursor移

33、至FSC/SSC散點(diǎn)圖上，并沿著淋巴球聚落周邊畫出范圍，連點(diǎn)擊兩次可關(guān)閉該區(qū)域。你已完成R1區(qū)域的界定，我們將以此區(qū)域來(lái)圈選淋巴細(xì)胞。(如果要?jiǎng)h除R1區(qū)域，您可以在工具列中點(diǎn)選GatesRegionlist,以鼠標(biāo)點(diǎn)選R1,再按Delete鍵刪除R1區(qū)域。刪除R1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫R1。)5 .從Plots菜單中選擇DotPlot可復(fù)制一個(gè)同樣大小的散點(diǎn)圖，屏幕上會(huì)出現(xiàn)一DotPlot對(duì)話方框。點(diǎn)擊XParameter鈕來(lái)顯示NORM001檔案中所有的參數(shù)項(xiàng)(FSC,SSC,FL1,FL2)將X參數(shù)項(xiàng)改成FL1-H256Gamma-1,Y參數(shù)項(xiàng)改成FL2-H256Gamma-2。從G

34、ate輸入欄中將NoGate改成G1=R1。6 .點(diǎn)擊OK便完成了一個(gè)以G1圈選的FL1/FL2散點(diǎn)圖，可將復(fù)制圖移至原圖右方。NORM001檔案為本組實(shí)驗(yàn)之陰性對(duì)照組，我們將以之來(lái)界定陰性與陽(yáng)性之界限。7 .從屏幕左列工具板中，選取QuadrantMarker工具，然后在FL1/FL2散點(diǎn)圖中心處點(diǎn)擊并拖曳至定點(diǎn)，一般而言是緊挨著陰性細(xì)胞聚落。8 .FL1/FL2二維散點(diǎn)圖現(xiàn)在被區(qū)隔出四個(gè)象限，欲計(jì)算各象線中細(xì)胞的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，從屏幕上方Stats菜單中選擇QuadrantStats?？梢缘玫皆搱D之四象限統(tǒng)計(jì)結(jié)果。UL:左上象限，UR:右上象限，LL:左下象限，LR:右下象限SlatsBatch

35、Acquire>togramStats<-SSt已l號(hào)”，RegionStatsGmteStatsQuadrantStatsEdit一NswExpressionEditIExpi§s酊onFfeJNonn.Ofta$ampleID:Sample1Tube：CD3O19AcuifltlonD«it;08-Sep-00GatedEvents:2661XPsraneter:CD3FITC(Log)QuadLqg趾ion二1芭12Ou44Ekenis為R觸松舞ToLogDataUnits:LinearYsduesPatientID:Panel:2ColorPwelGm&

36、#171;：Q1TotalEvents:6W0¥Parameter:CD19PE(Log)XMt&nVM&M¥屯MfeimUL29610.354.932.7724227428刈26UR70.240.12168.05192J772的LL4如4魅4g32358IR22M79.1357.7322?.J2215.13"喏1.41打印報(bào)告、輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值9 .從屏幕上方File菜單中選擇PrintOne,可以打印工作中實(shí)驗(yàn)文件。10 .點(diǎn)選四象限統(tǒng)計(jì)表，從屏幕上方File菜單中選擇ExportStatistics可輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值至Excel檔案。在出現(xiàn)方框中命名

37、檔案，并決定欲存放檔案匣，點(diǎn)擊Save。CancelSgueHustin'st-TzoaoatZooFauto.seaCDtoLELLQUESrSaueas:12H5Data.ae4.3開(kāi)啟其它ListModeData11 .如欲接著分析存在同一檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表（文件中所有圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上），接著從Plots菜單選擇NextDataFile,軟件會(huì)自動(dòng)以新檔案來(lái)替換現(xiàn)有檔案，您只要確認(rèn)圈選范圍、與QuadrantMarker的位置是否恰當(dāng)，即可打印報(bào)告、或輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值。12 .對(duì)于存在不同檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有

38、圖表（文件中所有圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上），接著從Plots菜單選擇ChangeDataFiles,并在隨后出現(xiàn)之對(duì)話方框，選擇所在新目錄與欲分析檔案。點(diǎn)擊OPEN。可調(diào)整圈選區(qū)域，QuadrantMarker陰陽(yáng)界限，軟件會(huì)重新計(jì)算、統(tǒng)計(jì)報(bào)告。openaDataFile.bdiE01020300i0031903.001購(gòu)II2S02.00I112702.001.121202d12160213 .常規(guī)使用之實(shí)驗(yàn)文件（內(nèi)含散點(diǎn)圖、圈選區(qū)格、四象限分界、以及統(tǒng)計(jì)報(bào)告），我們建議您將它另存新檔File-SaveAs,以備后需，分析其它檔案便輕而易舉。4.3直方圖之統(tǒng)計(jì)分析（單色）1 .

39、從屏幕上方File菜單中選擇New。桌面會(huì)出現(xiàn)一Untitled'實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的右上角的放大鈕，將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。2 .從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，然后拖曳對(duì)角線至適當(dāng)大小。Plot拖曳完成后可以在右方看到DotPlot對(duì)話框。3 .在DotPlot方框中，PlotSource應(yīng)預(yù)設(shè)為Analysis,可點(diǎn)擊SelectFile鈕，并用隨后之方框來(lái)開(kāi)啟預(yù)存之SampleFiles,它們的路徑位于MacHD:BDApplications:CellQuestFolder:SampleFiles。連續(xù)雙擊鼠標(biāo)來(lái)打開(kāi)次目錄，找到檔案后，點(diǎn)擊Open來(lái)開(kāi)啟NO

40、RM001檔案。X與Y參數(shù)項(xiàng)會(huì)出現(xiàn)默認(rèn)值一FSC-H256與SSC-H256,在Color方框中點(diǎn)擊MulticolorGating,確認(rèn)無(wú)誤之后，點(diǎn)擊OK便完成了一個(gè)NORM001的FSC/SSC散點(diǎn)圖。4 .工具板中選擇多角形區(qū)隔工具，將Cursor移至FSC/SSC散點(diǎn)圖上，并沿著淋巴球聚落周邊畫出范圍，連點(diǎn)擊兩次可關(guān)閉該區(qū)域。你已完成R1區(qū)域的界定，我們將以此區(qū)域來(lái)圈選淋巴細(xì)胞。(如果要?jiǎng)h除R1區(qū)域，您可以在工具列中點(diǎn)選GatesRegionlist,以鼠標(biāo)點(diǎn)選R1,再按Delete鍵刪除R1區(qū)域。刪除R1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫R1。)5 .從Plots菜單中選擇Histogra

41、m,屏幕上會(huì)出現(xiàn)一HistogramFile鈕，再點(diǎn)擊Open來(lái)開(kāi)啟NORM001檔案。對(duì)話方框。點(diǎn)擊Select說(shuō)明：直方圖(Histogram)表明一個(gè)參數(shù)與細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)系，在圖中，橫坐標(biāo)X軸為熒光或光散射強(qiáng)度的相對(duì)值，單位是道數(shù)(channelnumber),縱坐標(biāo)Y軸則通常表示細(xì)胞出現(xiàn)的頻率，即相對(duì)細(xì)胞數(shù)。6 .點(diǎn)擊Parameter鈕來(lái)顯示NORM001檔案中所有的參數(shù)項(xiàng)，將參數(shù)項(xiàng)改成FL2-H256Gamma-2。從Gate輸入欄中將NoGate改成G1=R1，點(diǎn)擊OK便完成了一個(gè)以G1圈選的FL2直方圖，圖形的X軸為橙黃色熒光強(qiáng)度，Y軸為細(xì)胞頻率，NORM001n君后一m口g

42、£55jacnfra-!檔案為本組實(shí)驗(yàn)之陰性對(duì)照組，我們將以之來(lái)界定陰性與陽(yáng)性之界限。7 .從屏幕左列工具板中，選取HistogramMarker工具，然后在圖的左緣處點(diǎn)擊并拖曳至定點(diǎn)，一般而言是陰性信號(hào)的右緣。放開(kāi)鼠標(biāo)后即完成Marker1(M1)。重復(fù)前述步驟以增畫另一Marker,一般而言M2始自M1的右緣，終于圖的右界。8.FL2直方圖現(xiàn)在被區(qū)隔出兩個(gè)區(qū)域，欲計(jì)算各區(qū)域中細(xì)胞的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，可從Stats指令欄中選擇HistogramStats。StatsBatchAcquireK-SStats.RegionStatsGateStatsQuadrantStatsNewExpres

43、sionEditExpressimiG和mxl*rt<reMIteJCt",，1jF(4111(*»曲anSf.N?TpII用；1;xheubinrm工工1ui,n1443WI7I4£/口"也幃*K鼻CitfriCorral*>“,口”Um中：ip,rifuivFLUrtSwTTFrI(JLw網(wǎng)(：帆T:也Emd打印報(bào)告、輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值9 .從屏幕上方File菜單中選擇PrintOne,可以打印工作中實(shí)驗(yàn)文件。10 .點(diǎn)選四象限統(tǒng)計(jì)表，從屏幕上方File菜單中選擇ExportStatistics可輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值至Excel檔案。在出現(xiàn)方框中命名檔

44、案，并決定欲存放檔案匣，點(diǎn)擊Save。|Humin's£|T205Data.D0T12白4.日白2911auto.sea4CDtoCELLQUEST4.3開(kāi)啟其它ListModeData11 .如欲接著分析存在同一檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表（文件中所有圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上），接著從Plots菜單選擇NextDataFile,軟件會(huì)自動(dòng)以新檔案來(lái)替換現(xiàn)有檔案，您只要確認(rèn)圈選范圍、與QuadrantMarker的位置是否恰當(dāng)，即可打印報(bào)告、或輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值。12 .對(duì)于存在不同檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表（文件中所有圖譜的

45、四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上），接著從Plots菜單選擇ChangeopenaDdlaFlitDataFiles,并在隨后出現(xiàn)之對(duì)話方框，選擇所在新目錄與欲分析檔案。點(diǎn)擊OPEN?？烧{(diào)整圈選區(qū)域，Markers界限，軟件會(huì)重新計(jì)算、統(tǒng)計(jì)報(bào)告。E30102030010031903.001QI12502.00I施)112702.001CJ121202d12160213 .常規(guī)使用之實(shí)驗(yàn)文件（內(nèi)含散點(diǎn)圖、圈選區(qū)格、四象限分界、以及統(tǒng)計(jì)報(bào)告），我們建議您將它另存新檔File-SaveAs,以備后需，分析其它檔案便輕而易舉。五、不對(duì)信號(hào)、疑難排除5.1 儀器狀態(tài)(Status)I15«&g

46、t;-"SSJji一>>>«>二：常:：:：力：黑門;副閾HIEStatus：LflserPower：LaserCurrent：SampleVoltage：SheathFluid：WasteTantTestPulses：Standby5JS3.78An|Q310.Z3OKOK在CELLQuest菜單位于Cytometer菜單中。用來(lái)在收取的任何時(shí)候查看流式細(xì)胞儀的運(yùn)行狀態(tài)，以利解決儀器運(yùn)行中出現(xiàn)的問(wèn)題。狀態(tài)：顯示儀器運(yùn)行模式NotReady:激光器正在預(yù)熱、鞘液桶空、廢液桶滿。Ready：樣本管放置在進(jìn)樣區(qū)，且支撐臂位于中位，樣本管加壓，儀器在RUN

47、狀態(tài)。Standby:儀器在Standby狀態(tài)、或儀器在Run狀態(tài)而無(wú)樣本管在進(jìn)樣區(qū)上、或支撐架位于側(cè)位、或樣本管未完全加壓。Standby時(shí)儀器的雷射電源降低。5.2 常見(jiàn)故障排除程序5.2.1 樣品試管上不去誤用不適合的試管。（請(qǐng)用BDFalcon352052）試管支持架需調(diào)整。旋轉(zhuǎn)調(diào)整試管支持架（順時(shí)鐘向下、逆時(shí)鐘向上）。BalSeal磨損。（汰換Balseal）5.2.2 儀器處于N0TREADY狀況檢查以下情況：鞘液筒中的鞘液是否用完。廢液筒中的廢液是否已裝滿。開(kāi)機(jī)需要5分鐘進(jìn)度預(yù)熱。鞘液筒的液面檢測(cè)器連接是否松動(dòng)、或未連接。5.2.3 儀器處于STANDBY狀況（儀器失壓）如果儀器

48、未加壓，上樣管放好后，雖然控制面板處于RUN模式，但儀器仍未能達(dá)到READY狀況，此時(shí)儀器仍處于STANDBY狀況。這可能是由于鞘液筒蓋漏氣、壓力閥未加壓，樣本管不能被加壓等原因造成的壓力問(wèn)題。此時(shí)，樣本不能良好地進(jìn)入流動(dòng)室，無(wú)法檢測(cè)。此時(shí)，檢查以下情況：壓力閥未加壓。鞘液筒是否漏氣（蓋緊鞘液筒蓋）。樣本管是否有破損。上樣針上的Balseal是否己磨損。鞘液筒上的藍(lán)色接頭是否連接好。5.2.4 儀器訊號(hào)噪聲過(guò)高鞘液過(guò)濾器中有氣泡，儀器記錄了氣泡產(chǎn)生的信號(hào)，造成了噪聲數(shù)據(jù)的干擾。氣泡還可以改變樣本流，造成檢測(cè)結(jié)果不夢(mèng)想。此時(shí)，儀器需要做PRIME,排除液路中的氣泡干擾。如果鞘液筒吸干了，應(yīng)該重新

49、裝滿鞘液，然后先取下樣品管進(jìn)行5-10次PRIME,再換上3mldH2O上樣管HIRUN30分鐘，待鞘液流中的氣泡排除之后，再進(jìn)行樣本測(cè)定。5.2.5 計(jì)算機(jī)屏幕上見(jiàn)不到細(xì)胞顯示檢查以下情況：如果儀器一直處于STANDBY狀態(tài)，則檢查SystemStatus。如果STATUS窗日顯示READY,則檢查樣本管中細(xì)胞濃度是否夠，上樣前是否混勻了。檢查實(shí)驗(yàn)的InstrumentSettings是否正確。檢查閾值是否設(shè)置過(guò)高，導(dǎo)致無(wú)法檢測(cè)目標(biāo)細(xì)胞群。檢查CELLQuest軟彳Cytometer目錄下的Status窗口，是否己被更新。如果未更新，說(shuō)明儀器與計(jì)算機(jī)之間的通訊發(fā)生了故障，此時(shí)，應(yīng)關(guān)閉計(jì)算機(jī)和FACSCalibur,重新打開(kāi)儀器，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。PRIME儀器液流，去除流動(dòng)室中可能存在的氣泡。若流動(dòng)室中存在氣泡，可能使樣本流的位置偏離激光