超濾管使用方法和注意事項

1、超濾管使用方法和注意事項超濾管使用方法和注意事項蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD也有其它型號的、不同體積大小和MWCO濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標體積而定?？芍貜褪褂?，使用一次就扔掉太浪費。以下是個人總結(jié)的使用方法和注意事項。1、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO濃縮體積，最常見的是Ultra-15（10kD）。到底選擇多大截留分子量比較合適呢？10kDa5kDa、還是30kDa?通常應截留分子量不應大于目的蛋白分子量的1/3,比如目的蛋白分子量為35kDa,就可以選才¥10

2、kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。認真閱讀使用說明書，注意超濾膜對各種化學物質(zhì)的耐受程度有所不同，表格中有。2、新買來的超濾是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全過膜，冰浴或冰箱里預冷幾分鐘。然后將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂?shù)陌拙€為準。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預冷。3、平衡。質(zhì)量和重心二者都要達到平衡。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾（離心機預冷至4度）。不同離心機的轉(zhuǎn)速rpm換算成g之后，有所不同。具體可參閱附件里的說明書。離心機的加速度調(diào)至最低檔，減小對膜的壓力

3、。注意，一定要等離心機達到目的轉(zhuǎn)速之后，方可離開離心機，否則離心機出問題時，無法第一時間處理，后果不可預測！膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說明書調(diào)整（角轉(zhuǎn)離心機的情況是膜與軸垂直）。在實際使用中，一般轉(zhuǎn)速開的比說明書里的要低，這樣可以延長離心管的使用壽命。4、當濃縮到剩下1ml時，【取50ul國產(chǎn)Bradford溶液，加入10ul流穿，看有沒變藍色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管，用5mg/ml的BSA離心10min,再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測】,繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作，防止蛋白受熱），直到所有濃縮液都加完為止。離

4、心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀，導致堵管。若發(fā)生沉淀，要確定沉淀的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時超濾，降低濃度的辦法解決，后者的方法是換不同的Buffer,直到蛋白不發(fā)生沉淀為止。5、前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer,在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候，輕輕加入新的Buffer（經(jīng)0.22um超濾膜超濾），再濃縮至1ml左右，連續(xù)三次，最后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定，一般不多于500ul,也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達到1000倍以上，基本上可以達到換buffer的目的。6、取出最終蛋白濃縮液

5、的操作在冰上操作，用黃槍頭（200ul）取，輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜，然后吸取濃縮液，每次吸接近200ul,直到吸完。管底剩下的最后一點濃縮液不必吸取，否則難度太大，有可能損壞超濾膜。最后加入MilliQ水到超濾管中，沒過超濾膜,防止膜失水變干。7、以下是處理超濾管，重復利用超濾管的步驟。8、倒出超濾管里的水，用milliQ水輕輕潤洗幾次，【若管底有可見的蛋白沉淀，可以先加入水，然后用槍頭吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀懸起，然后倒掉，不可用自來水猛沖】然后加入0.2M的NaOH§液，室溫放置20min,期間平衡超濾管。再離心10min。倒出殘留

6、的NaOH§液，將管芯浸入MilliQ水的燒杯（1或2L）中,放置幾個小時，再換新的水，放置幾個小時，不斷稀釋NaOH濃度。50ml管和蓋子用自來水洗，內(nèi)壁再用MilliQ水洗干凈。9、取出浸沒的管芯，加至接近滿的MilliQ水，50ml管也加滿MilliQ水，將管芯慢慢放入50ml離心管，排出部分水，然后蓋上蓋子，放4度保存，直到下次使用。一般來說，按照上述步驟和注意事項，每根管用三四年不會壞。實驗室常用儲存液的配置參數(shù)1.30%5烯酰胺溶液【配制方法】將29g丙烯酰胺和1gN,N'-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中。加熱至37c溶解之，補加水至終體積為100ml。

7、用Nalgene濾器（0.45pm孔徑）過濾除菌，查證該溶液的pH值應不大于7.0,置棕色瓶中保存于室溫?！咀⒁狻勘０肪哂泻軓姷纳窠?jīng)毒性并可以通過皮膚吸收，具作用具累積性。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺時應戴手套和面具?？烧J為聚丙烯酰胺無毒，但也應謹慎操作，因為它還可能會含有少量未聚合材料。一些價格較低的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺通常含有一些金屬離子，在丙烯酰胺貯存液中加入大約0.2體積的單床混合樹脂（MB-1Mallinckrodt）,攪拌過夜，然后用Whatmanl號濾紙過濾以純化之。在貯存期間，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺會緩慢轉(zhuǎn)化成丙烯酰和雙丙烯酸。2 .40沏烯酰胺【配制方法】把380g丙烯酰胺

8、（DNAAM序級）和20gN,N'-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為600ml的蒸儲水中。繼續(xù)按上述配制30%5烯酰胺溶液的方法處理，但加熱溶解后應以蒸儲水補足至終體積為1L?！咀⒁狻恳娚鲜雠渲?0沏烯酰胺白說明，40%5烯酰胺溶液用于DNAff列測定。3 .放線菌素D溶液【配制方法】把20mg放線菌素D溶解于4ml100叱醇中，1:10稀釋貯存液，用100叱醇作空白對照讀取OD44C®。放線菌素D（分子量為1255）純品在水溶液中的摩爾消化系數(shù)為21,900,故而1mg/ml的放線菌素D溶液在440nm處的吸光值為0.182,放線菌素D的貯存液應放在包有箔片的試管中，保存于-20

9、C0【注意】放線菌素D是致畸劑和致癌劑，配制該溶液時必須戴手套并在通風櫥內(nèi)操作，而不能在開放在實驗桌面上進行，謹防吸入藥粉或讓其接觸到眼睛或皮膚。藥廠提供的作治療用途的放線菌素D制品常含有糖或鹽等添加劑。只要通過測量貯存液在440nm波長處的光吸收確定放線菌素D的濃度，這類制品便可用于抑制自身引導作用。4.0.1mol/L腺甘三磷酸（ATB溶液【配制方法】在0.8ml水中溶解60mgATP用0.1mol/LNaOH調(diào)至pH值至7.0,用蒸儲水定容1ml,分裝成小份保存于-70C5.10mol/L乙酸酰溶液【配制方法】把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后過濾除菌。6.10%i硫

10、酸俊溶液【配制方法】把1g過硫酸俊溶解于終量為10ml的水溶液中，該溶液可在4c保存數(shù)周。7.BCIP溶液【配制方法】把0.5g的5-溟-4-氯-3-呷咪磷酸二鈉鹽（BCIP）溶解于10ml100%勺二甲基甲酰月5中，保存于4c8.2XBESS沖鹽溶液【配制方法】用總體積90ml的蒸儲水溶解1.07g鹽溶液BESNN-雙（2-羥乙基）-2-氨基乙磺酸、1.6gNaCl和0.027gNa2HPO4室溫下用HCl調(diào)節(jié)該溶液的pH值至6.96、然后加入蒸儲水定容至100ml,用0.22m濾器過濾除菌，分裝成小份，保存于-20C。9. 1mol/LCaCl2溶液【配制方法】在200ml蒸儲水中溶解54

11、gCaCl2?6H20用0.22仙m濾器過濾除菌，分裝成10ml小份貯存于-20C。【注意】制備感受態(tài)細胞時，取出一小份解凍并用蒸儲水稀釋至100ml,用Nalgene濾器（0.45仙m孔徑）過濾除菌，然后驟冷至0C。10. 2.5mol/LCaCl2溶液【配制方法】在20ml蒸儲水中溶解13.5gCaCl2?6H2O,用0.22仙m濾器過濾除菌，分裝成1ml小份貯存于-20C。11. 1mol/L二硫蘇糖醇（DTI）溶液【配制方法】用20ml0.01mol/L乙酸鈉溶液（pH5.2）溶解3.09gDTT,過濾除菌后分裝成1ml小份貯存于-20C?！咀⒁狻緿TT或含有DTT的溶液不能進行高壓處

12、理。12. .脫氧核甘三磷酸（dNTP溶液【配制方法】把每一種dNTP容解于水至濃度各為100mmol/L左右，用微量移液器吸取0.05mol/lTris堿分別調(diào)節(jié)每一dNTP容液的pH值7.0（用pH試紙檢測），把中和后的每種dNTP容液各取一份作適當稀釋，在給出的波長下讀取光密度計算出每種dNTP的實際濃度，然后用水稀釋成終濃度為50mmol/L的dNTP，分裝成小份貯存于-70C。13. 0.5mol/lEDTA（pH8.0）溶液【配制方法】在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na?2H2O,在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOHS節(jié)溶液的pH值至8.0（約需20

13、gNaOH顆粒）然后定容至1L,分裝后高壓滅菌備用?！咀⒁狻縀DTA二鈉鹽需加入NaOH等溶7W勺pH值調(diào)至接近8.0,才能完全溶解。14. 澳化乙錠（10mg/ml溶液）【配制方法】在100ml水中加入1g澳化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時以確保其完全溶解，然后用鋁箔包裹容器或轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，保存于室溫。【注意】小心：澳化乙錠是強誘變劑并有中度毒性，使用含有這種染料的溶液時務必戴上手套，稱量染料時要戴面罩。15. 2XHEPESS沖鹽溶液【配制方法】用總量為90ml的蒸儲水溶解1.6gNaCl、0.074gKCl、0.027gNa2PO4?2H2O0.2g葡聚糖和1gHEPES用0.5mol/lNaO

14、H調(diào)節(jié)pH值至7.05,再用蒸儲水定容至100ml。用0.22pm濾器過濾除菌，分裝成5ml小份，貯存于-20C016.IPTG溶液【配制方法】IPTG為異內(nèi)基硫代-B-D-半乳糖甘（分子量為238.3）,在8ml蒸儲水中溶解2gIPTG后，用蒸儲水定容至10ml,用0.22m濾器過濾除菌，分裝成1ml小份貯存于-20Co17.1mol/L乙酸鎂溶液【配制方法】在800ml水中溶解214.46g四水乙酸鎂，用水定容至1L過濾除菌。18. 1mol/LMgCl2溶液【配制方法】在800ml水中溶解203.4gMgCl2?6H2。用水定容至1L,分裝成小份并高壓滅菌備用?！咀⒁狻縈gCl2極易潮解

15、，應選購小瓶(如100g)試齊:啟用新瓶后勿長期存放。19. B-琉基乙醇(BME溶液【配制方法】一般得到的是14.4mol/L溶液，應裝在棕色瓶中保存于4C?！咀⒁狻緽ME1E含有BME勺溶液不能高壓處理。20. NBT容液【配制方法】把0.5g氯化氮藍四晚溶解于10ml70%的二甲基甲酰胺中，保存于4c。21. 酚/氯仿溶液【配制方法】把酚和氯仿等體積混合后用0.1mol/LTris?HCl(pH7.6)抽提幾次以平衡這一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆蓋等體積的0.01mol/lTris?HCl(pH7.6)液層，保存于4C。【注意】酚腐蝕性很強，并可引起嚴重灼傷，操作時應戴手套及防護鏡，

16、穿防護服。所有操作均應在化學通風櫥中進行。與酚接觸過的部位皮膚應用大量的水清洗，并用肥皂和水洗滌，忌用乙醇。22. 10mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF溶液【配制方法】用異丙醇溶解PMS戚1.74mg/ml(10mmol/L),分裝成小份貯存于-20C。如有必要可配成濃度高達17.4mg/ml的貯存液(100mmol/L)?！咀⒁狻縋MSFT重損害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進或通過皮膚吸收后有致命危險。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF應立即用大量水沖洗之。凡被PMSF污染的衣物應予丟棄。PMSFS水溶液中不穩(wěn)定。應在使用前從貯存液中現(xiàn)用現(xiàn)加于裂解緩沖液中。PMSFE水溶液中的活性喪失速率隨

17、pH值的升高而加快，且25c的失活速率高于4C。pH值為8.0時，20pmmol/lPMS冰溶液的半壽期大約為85min,這表明將PMSF容液調(diào)節(jié)為堿性(pH>8.6)并在室溫放置數(shù)小時后，可安全地予以丟棄。23. 磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液【配制方法】在800ml蒸肥水中溶解8gNaCk0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4加水定容至1L,在15lbf/in2(1034x105Pa)高壓下蒸氣滅菌20min。保存于室溫。24. 1mol/L乙酸鉀(pH7.5)溶液【配制方法】將9.82g乙酸鉀溶解于90ml純水中，用2

18、mol/L乙酸調(diào)節(jié)pH值至7.5后加入純水定容到1L,保存于-2025.乙酸鉀溶液(用于堿裂解)【配制方法】在60ml5mol/L乙酸鉀溶液中加入11.5ml冰乙酸和28.5ml水，即成鉀濃度為3mol/L而乙酸根濃度為5mol/L的溶液。26. 3mol/L乙酸鈉(pH5.2和pH7.0)溶液【配制方法】在80ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2或用稀乙酸調(diào)節(jié)pH值至7.0,加水定容到1L,分裝后高壓滅菌。27. 5mol/LNaCl溶液【配制方法】在800ml水中溶解292.2gNaCl加水定容至1L,分裝后高壓滅菌。28. 10%二烷基硫酸鈉(SDS溶液【配制方

19、法】在900ml水中溶解100g電泳級SDS加熱至68c助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2,加水定容至1L,分裝備用?！咀⒁狻縎DS勺微細晶粒易擴散，因此稱量時要戴面罩，稱量完畢后要清除殘留在稱量工作區(qū)和天平上的SDS10%SDS5液無須滅菌。29. 20XSSC溶液【配制方法】在800ml水中溶解175.3gNaCl和88.2g檸檬酸鈉，加入數(shù)滴10mol/lNaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0,加水定容至1L,分裝后高壓滅菌。30. 20XSSP日容液【配制方法】在800ml水中溶解17.5gNaCl、27.6gNaH2PO4?H2O7.4gEDTA用NaOH§液調(diào)節(jié)pH值至7.4(約需6.5ml10ml/LNaOH),加水定容至1L,分裝后