糖尿病小鼠模型的制備

1、、糖尿病的概念及分類糖尿病已成為全人類繼惡性腫瘤和心腦血管病之后的嚴(yán)重威脅人類健康的第三大非傳染 性疾病。目前我國己成為世界第一糖尿病大國。糖尿病是一類由遺傳、環(huán)境、免疫等因素引起的、具有明顯異質(zhì)性的慢性高血糖癥及其并 發(fā)癥所組成的綜合征，并非單一病因所引起的單一疾?。ǘ嘣蛞鸬木C合癥）。糖尿病分為：i型糖尿病、n型糖尿病和其它特異性糖尿病。i型糖尿病即胰島b細(xì)胞大量破壞，常導(dǎo) 致胰島素絕對性缺乏，以往稱為胰島素依賴型糖尿病、青年發(fā)病型糖尿病，“三多一少”癥狀 明顯。本型病因及發(fā)病是由于胰島B細(xì)胞受到細(xì)胞介導(dǎo)性自身免疫性破壞。n型糖尿病由于胰 島素抵抗并胰島素分泌不足所致，以高血糖高血脂為顯

2、著特點。以往稱為非胰島素依賴型糖尿 病、成年發(fā)病型糖尿病，常伴有明顯的遺傳因素，但遺傳機制尚未闡明。其它特異性糖尿病包括，B細(xì)胞功能的基因缺陷、胰島素作用的基因缺陷、胰腺外分泌疾病、內(nèi)分泌疾病、藥物 或化敏學(xué)制劑所致的糖尿病、感染、非常見型免疫介導(dǎo)性糖尿病以及有時并發(fā)糖尿病的其它遺 傳綜合癥。（糖尿病是無法根治的，現(xiàn)在隨著人們生活水平的提高，飲食習(xí)慣，生活方式的改變糖尿 病的發(fā)病率節(jié)節(jié)攀升，成為威脅人類健康的一大難題。人們曾經(jīng)一度把糖尿病稱為富貴病這也 是有一定道理的。為了提高人們的生活質(zhì)量，近幾年對糖尿病的研究日益加深）二、糖尿病模型的建立近年來，隨著國內(nèi)外對糖尿病治療藥物研究的深入開展，建

3、立比較理想的糖尿病動物模型 顯得尤為重要。目前常用的動物模型有 實驗性動物模型和自發(fā)性動物模型 。自發(fā)性模型應(yīng)用價 值較高，但因價格昂貴，飼養(yǎng)、繁殖條件要求嚴(yán)格，而不能得到廣泛應(yīng)用。實驗性模型則應(yīng)用 比較廣泛，實驗性糖尿病動物模型的建立，是用各種方法損傷動物胰臟或胰島B細(xì)胞導(dǎo)致胰島素的缺乏，或用化學(xué)藥物對抗胰島素作用，導(dǎo)致動物出現(xiàn)高血糖形成糖尿病。實驗性糖尿病動物模型的建立主要有 6 種方法：胰腺切除法致糖尿病、免疫性糖尿病、激素性糖尿病、下丘腦 損傷性糖尿病、化學(xué)性糖尿病、病毒性糖尿病。由于化學(xué)性糖尿病動物模型誘發(fā)簡便、來源 廣， 應(yīng)用較廣泛。目前多采用注射化學(xué)誘導(dǎo)劑 （鏈脲佐菌素或四氧嘧啶

4、 ）的方法，引起短時間內(nèi) 胰島B細(xì)胞大量損害而誘發(fā)糖尿病動物模型的建立。1、糖尿病模型小鼠多采用 6-8周齡雄性小鼠，品系國內(nèi)以昆明小鼠和 ICR 小鼠居多，由于價格便宜且藥物敏 感性高，應(yīng)用較廣泛。此外還有 NODSCID小鼠、CD-1小鼠、C57BL/6小鼠、BALB / c小 鼠、 NMRI 小鼠。2、化學(xué)誘導(dǎo)劑及致病機制目前常用的藥物有鏈脲佐菌素 STZ 和四氧嘧啶 ALX ， 其作用機制都 是選擇性損傷胰腺B細(xì)胞，引起B(yǎng)細(xì)胞壞死，導(dǎo)致血胰島素不同程度下降伴血糖升高，形成胰島素依賴型糖尿 病。 與四氧嘧啶糖尿病不同，鏈脲佐菌素引起的糖尿病高血糖反應(yīng)及酮癥均較緩和，所致糖尿 病模型也更加

5、穩(wěn)定。（1 ）鏈脲佐菌素 STZSTZ 是由致癌物質(zhì) MNU 衍生的一種 2-脫氧-右旋-葡萄糖， STZ 致糖尿病的機制是通過其 本身含有的葡萄糖部分結(jié)構(gòu)被胰島 B細(xì)胞上低親和力的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 （GLUT2）轉(zhuǎn)運，特異性 地作用于胰島B細(xì)胞，引起特殊位點烷基化，進一步導(dǎo)致多聚ADP核糖體激活，胞內(nèi) NAD +和 ATP 耗竭，最終導(dǎo)致大量反應(yīng)性氧簇產(chǎn)生，引起其結(jié)構(gòu)破壞和胰島素分泌功能障礙。此外 還可以通過產(chǎn)生活性氧和 NO 發(fā)揮間接損傷作用。STZ 是從無色鏈霉素分離出來的一種廣譜抗生素，為無色固體，易溶于水，水溶液在室溫下極不穩(wěn)定，可在數(shù)分鐘內(nèi)分解成氣體 ，因此溶液要在 pH4 低溫避光

6、的環(huán)境中保存，且現(xiàn)配 現(xiàn)用。樣品在稱取的過程中要嚴(yán)格保證周圍環(huán)境的干燥，如確實需要多次稱取，要嚴(yán)格按照避免受潮的原則操作和存放。操作方法：操作環(huán)境、盛裝容器、分裝工具都必須 保證干燥。無需冰浴，分裝后用封口膜密封瓶口，用鋁箔紙 （或錫箔，即避光 ）將瓶 子包好，放入干燥罐里（干燥劑，即保持干燥狀態(tài)）， 并2-8C冷藏，可長期保 存。STZ的溶劑一般選用 pH 4.248檸檬酸緩沖液（O.lmol/L）。溶劑配制完成后，用 0.2um的 微孔濾膜過濾滅菌消毒備用。 STZ 配制過程都要在低溫環(huán)境中進行，以保證 STZ 的藥效性， 提高造模的成功率。小鼠注射鏈脲佐菌素后，血糖水平的改變可分為三個時

7、相：早期高血糖相，持續(xù)約12小時，是STZ抑制胰島釋放所致。據(jù)此，一般小鼠注射STZ兩小時后，給予正常進食；低血糖相，持續(xù)約 610小時，可能是由于胰島B細(xì)胞破壞，大量胰島素釋放，致使血糖顯著降低。為防止小鼠出現(xiàn)持續(xù)低血糖而驚厥死亡，在給予飼料的同時喂以5%的葡萄糖水24h;24小時后出現(xiàn)穩(wěn)定的高血糖相即糖尿病階段，此時大部分胰島 B細(xì)胞已呈現(xiàn)不同程度的損傷和破壞。（2）四氧嘧啶（ alloxan）ALX四氧嘧啶對胰島 B細(xì)胞有特異性的毒性作用，可選擇性地?fù)p傷多種動物的胰島細(xì)胞而引 起實驗性糖尿病，它通過產(chǎn)生超氧自由基破壞B細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi) DNA損傷，并激活多 ADP核糖體合成酶的活性，從而使

8、輔酶I含量下降，導(dǎo)致 mRNA功能受損，B細(xì)胞合成前胰島素減少，最終導(dǎo)致胰島素缺乏。這種作用機制與臨床 I 型糖尿病患者的發(fā)病機制相近。四氧嘧啶引起的血糖反應(yīng)也分三個時相，開始血糖升高持續(xù)約2h，繼而因B細(xì)胞殘存的胰島素釋放引起低血糖約 6h ,12h后開始持久的高血糖。四氧嘧啶其水溶性不穩(wěn)定， 應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。 注射速度要快， 這樣成模率較高。配制所需 的溶劑一般為生理鹽水。此外，還有腎上腺素誘導(dǎo)的糖尿病。腎上腺素是強有力的升高血糖的激素，它的作用機制 是與肝和肌細(xì)胞膜的B受體結(jié)合，通過G蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶、增高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，蛋白激酶級聯(lián)激活磷酸化酶、抑制糖原合酶，從而加速糖原分解、抑制

9、糖原合成。屬于胰外性糖 尿病。3、造模的方式方法小鼠造模前一般禁食 12-18小時。對普通飼料喂養(yǎng)的小鼠注射 STZ 前的禁食處理是非常關(guān) 鍵的。禁食的時間越長，鏈脲佐菌素對胰島B細(xì)胞的破壞力越明顯，即藥效越高。所以相對禁 食時間延長，可以降低 鏈脲佐菌素的用量。 。禁食處理之所以與注射 STZ 后血糖變化密切相 關(guān)，推測與禁食處理可以降低血液胰島素和 leptin 水平，并顯著下調(diào)脂肪組織 ob 基因表達(dá)有 關(guān)(Tray-hurn et al., 1995; Mizuno et al ., 1996),為 STZ 進一步損害胰島 B 細(xì)胞提供了有利 的內(nèi)部環(huán)境?；瘜W(xué)誘導(dǎo)劑給藥方式有兩種, 尾

10、靜脈注射給藥法和腹腔注射給藥法 。根據(jù)給藥劑量和給藥 次數(shù)不同,又可將尾靜脈給藥和腹腔給藥分別劃分為大劑量一次給藥法和小劑量多次給藥法。STZ以腹腔注射居多， 大劑量一次性給藥劑量多為 150-200mg/kg ,小劑量多次給藥以 40- 70mg/kg連續(xù)五天較多。 大劑量注射時，由于直接引起胰島B細(xì)胞的廣泛破壞，可造成 1型動物模型；而注射較少量 鏈脲佐菌素時，由于只是破壞一部分胰島B細(xì)胞的功能，造成外周組織對胰島素不敏感,同時給予高熱量飼料喂養(yǎng),兩者結(jié)合便誘導(dǎo)出病理、生理改變都接近于2型 病患的動物模型。ALX多為大劑量一次性給藥，尾靜脈給藥量多為 60-100mg/kg，腹腔注射以10

11、0-200mg/kg 為主。具體的給藥劑量及給藥途徑,還要根據(jù)小鼠自身的特點以及其他多方面綜合考慮,先經(jīng)預(yù) 實驗摸索,以達(dá)到最優(yōu)方法 。 預(yù)實驗很重要。實驗時鏈脲佐菌素的給藥量應(yīng)參照預(yù)實驗的結(jié) 果,盡量不要盲目按照文獻上或他人的給藥量來直接使用,鼠均重和空腹(低糖狀態(tài) )抗藥力、禁食時長、注射選時、以及之前飼養(yǎng)過程、測糖選時注射過程等都不相同,通過預(yù)實驗來確定 符合自己實驗鼠的給藥計量,才是最科學(xué)的。 有文獻在對 ALX 造糖尿病模型發(fā)現(xiàn),隨劑量的 增加 ,小鼠死亡率增高 ;小鼠體重增加 ,死亡率亦增高 ;靜脈注射成模率比腹腔注射高 ;同等劑量分次 給藥 ,死亡率、轉(zhuǎn)陰率均降低,認(rèn)為四氧嘧啶以

12、同等劑量分次給藥小鼠糖尿病成模率高。目前，國內(nèi)造 II 型糖尿病模型，以高脂飲食和化學(xué)誘導(dǎo)劑損傷聯(lián)合造模。通過給予實驗動物少量STZ,破壞一部分胰島B細(xì)胞功能，同時飼以高脂肪飼料造成外周組織對胰島素不敏感兩者結(jié)合誘導(dǎo)出接近人類n型糖尿病的動物模型。此方法所造模型模擬了II型糖尿病的一定的病理現(xiàn)象，但卻很難界定為真正意義上的 II 型糖尿病。因此，國外在研究 II 型糖尿病時， 多采用 Zucker 大鼠、 db/db 小鼠、 ob/ob 小鼠等轉(zhuǎn)基因鼠。三、檢測指標(biāo)（一）一般情況的觀察小鼠外形外觀的觀察，如體重、毛色、反應(yīng)能力等，進食量、進水量、排尿量的觀察。（二）生化指標(biāo)的檢測血糖、糖化血紅

13、蛋白；血清肌酐、尿素氮水平的檢測。（三）病理切片及形態(tài)學(xué)檢查胰腺的損傷于糖尿病造模后一周就可發(fā)生病理改變，可見胰腺外分泌大量灶狀或散在的單核細(xì)胞 ,胰島細(xì)胞空泡變性 ,使胰島呈空虛狀態(tài) ,胰島毛細(xì)血管擴張、充血、胰島細(xì)胞減少。腎臟 損傷第四周可見。糖尿病可使小鼠相對腎重增加，糖尿病腎病早期的基本病理改變?yōu)槟I小球肥 大、基底膜增厚和系膜區(qū)域擴大，進一步發(fā)展，可致腎小球的纖維化硬化。糖尿病是一種常見病、多發(fā)病、其發(fā)病機制也較為復(fù)雜 ,應(yīng)用可控的動物模型可正確分析 其各種發(fā)病機制 ,嚴(yán)格的組織病理、生化和生理觀察均可正確判斷藥物療效情況,不同的動物模型應(yīng)選擇合適的測定指標(biāo)。隨著實驗動物科學(xué)的不斷發(fā)展,將建立更佳的符合臨床發(fā)病機理、更經(jīng)濟、