BRET技術(shù)在G蛋白偶聯(lián)受體和β-+arrestins相互作用

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。BRET技術(shù)在G蛋白偶聯(lián)受體和-+arrestins相互作用BRET技術(shù)在G蛋白偶聯(lián)受體和-+arrestins相互作用BRET技術(shù)在G蛋白偶聯(lián)受體和- arrestins相互作用研究中的應(yīng)用進展 杜輝 基金項目 國家自然科學(xué)基金( 30870932)；國家自然科學(xué)基金(30971081)；山東省自然科學(xué)基金（ZR2009D2004）Supported by National Natural Science Foundation of China (30870932), National Natural

2、 Science Foundation of China (30971081)，Shan Dong provence Natural Science Foundation(ZR2009D2004).通訊作者(Corresponding author). Tel: E-mail：bbai作者簡介 杜輝, 在讀博士，講師. E-mail：hdu834100, 2，白波3* ，陳京11. 泰山醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)研究所，泰安271000；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院， 泰安271000； 3. 濟寧醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)研究所，濟寧272000 摘要 G蛋白偶聯(lián)受體（G prote

3、in-coupled receptor, GPCR）是一個重要的細胞膜受體超家族。-arrestin1和2是廣泛存在于細胞內(nèi)的調(diào)配器和支架蛋白質(zhì),它們在G蛋白偶聯(lián)受體的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脫敏、內(nèi)化、復(fù)敏以及G蛋白非依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用。最近在生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）技術(shù)的發(fā)展能夠?qū)崟r監(jiān)測活細胞內(nèi)GPCRs和-arrestins的相互作用，可進一步闡明-arrestin調(diào)節(jié)GPCRs的功能，有助于開發(fā)新一代影響GPCRs功能活動的藥物。 關(guān)鍵詞 - arrestin； G 蛋白偶聯(lián)受體；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移；BRET中圖分類號 R329.10 文獻標(biāo)識碼 A Progr

4、ess of research on the interaction between G protein-coupled receptor and - arrestins using BRETtechnologyDU-Hui 1 ,2 , BAI- Bo3*, CHEN- Jing31. Department of Neurobiology,Tai shan Medical University,Taian,271000,China 2Department of Life Science,Shandong Agricultural University,Taian,271000，China 3

5、Department of Neurobiology, Ji ning Medical University, Jining, 272000，China Abstract G Protein-coupled receptors constitute a super family of cell surface proteins. -arrestin 1 and 2 are widely expressed intracellular adaptor and scaffolding proteins that play important roles in G protein-coupled r

6、eceptor desensitization, internalization, intracellular trafcking and G Protein-independent signalling. Recent developments in bioluminescence resonance energy transfer （BRET）technology enable monitor the GPCR-arrestin complexes in live cells and real time. In concert with a range of experimental to

7、ols, investigators can elucidate the ever-expanding roles of -arrestins in mediating GPCR function, which will be benefit for developing new generation drugs targeting GPCRs. Key words -arrestin; G protein-coupled receptor; signaling transduction; bioluminescence resonance energy transfer; BRETG蛋白偶聯(lián)

8、受體(G protein-coupled receptor, GPCR) 是目前所知最大的細胞表面受體家族,由占人類基因組3的基因編碼的1000多個成員組成，是藥物研發(fā)中最廣泛應(yīng)用的藥物靶點，約50市售的藥物直接作用于GPCRs。傳統(tǒng)的GPCR響應(yīng)無數(shù)胞外信號分子的刺激被激活，暴露與G蛋白的結(jié)合位點，活化的G蛋白亞基調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶、磷脂酶和離子通道等,放大和傳遞細胞內(nèi)信號。GPCR和G蛋白、GRK(G-protein-coupled receptor kinases, GRKs)以及- Arrestin的相互作用很大程度決定信號傳導(dǎo)的效率和選擇性。-arrestin作為磷酸化活化的GPCR主

9、要結(jié)合配體，與G蛋白偶聯(lián)受體激酶聯(lián)合作用,可以使GPCR發(fā)生脫敏反應(yīng),調(diào)節(jié)受體內(nèi)吞、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等調(diào)節(jié)受體的功能1。大量研究表明, -arrestin可以在G蛋白不被激活的情況下,從活化的受體上直接啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本文主要對應(yīng)用生物發(fā)光能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(bioluminescence resonance energy transfer，BRET) 研究G蛋白偶聯(lián)受體和- arrestin相互作用的進展進行綜述。 1 - arrestin與 GPCR的相互作用 G蛋白偶聯(lián)受體通過與配體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的G蛋白或- Arrestin，從而激活不同的細胞內(nèi)信號通路，產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)2。根據(jù)- Arrest

10、in在GPCR的信號通路中的作用分析二者的關(guān)系。 1.1 脫敏 脫敏是指受體受到連續(xù)刺激后失去反應(yīng)性的現(xiàn)象。絕大部分GPCR都發(fā)現(xiàn)了受體脫敏現(xiàn)象。GPCRs脫敏的主要機制之一為：GRKs磷酸化激動劑激活的受體絲氨酸/蘇氨酸殘基，然后-arrestin被招募到磷酸化的受體上。-arrestin與GPCRs結(jié)合形成三聚體,使GPCRs與G蛋白異聚體解偶聯(lián), 從而導(dǎo)致G蛋白依賴性信號的大大減少或可以誘發(fā)受體內(nèi)化，此過程稱為脫敏。在新紋狀體神經(jīng)元中，研究攜帶綠色熒光蛋白的D2受體與-arrestin的相互作用時發(fā)現(xiàn)：激動劑誘導(dǎo)的D2受體/ -arrestin1相互作用具有優(yōu)先選擇性，優(yōu)先的選擇內(nèi)源性的

11、-arrestin1，-arrestin1、2與D2受體的第二、三胞內(nèi)環(huán)和羧基末端結(jié)合3。1.2 -arrestin與G蛋白偶聯(lián)受體的內(nèi)化和循環(huán)關(guān)系 受體脫敏、活化的受體去磷酸化和復(fù)敏必需受體的胞吞作用。GRK的磷酸化和-arrestin的結(jié)合促進了受體的內(nèi)吞。GPCRs的內(nèi)吞是多途徑的過程，大多數(shù)的GPCRs與-arrestin結(jié)合后,通過網(wǎng)格蛋白包被小體完成內(nèi)吞，-arrestin成為受體內(nèi)吞過程中的一個重要連接蛋白。被內(nèi)吞受體的胞內(nèi)運輸模式與受體內(nèi)吞區(qū)域的序列、磷酸化部位的構(gòu)型和-arrestin的結(jié)合有關(guān)。最近的研究發(fā)現(xiàn)-arrestin可以調(diào)節(jié)內(nèi)吞后GPCRs的運輸模式，在GPCRs

12、的膜運輸中起到了特別的作用。根據(jù)GPCRs與-arrestin結(jié)合的關(guān)系可將GPCRs分A、B兩型(表1)。“A”型受體以2腎上腺素受體（2AR）為例，其羧基端含不豐富的絲/蘇氨酸群，它們瞬間募集-arrestin2運輸?shù)骄W(wǎng)格蛋白包被的小凹，內(nèi)化后快速返回到胞瞙，A型受體被激活后短暫、快速的與-arrestin結(jié)合（以-arrestin2為主），且親和力低。B型受體以血管緊張素1受體（AT1AR）為典型，受體同時募集-arrestin1和-arrestin2，并且與- arrestins結(jié)合力量強，結(jié)合時間更長，然后B型受體與網(wǎng)格蛋白包被小凹、- arrestins入內(nèi)吞囊泡，受體循環(huán)到細胞表

13、面比A型受體慢的多 4。近來研究發(fā)現(xiàn)某些受體不完全符合這種分類方法，如利用酶聯(lián)免疫吸附試驗，共聚焦定位，BRET劑量反應(yīng)試驗的研究表明，兩種食欲素（Orexins）受體與arrestin蛋白以B類受體特點內(nèi)化、并迅速的返回質(zhì)膜（具有A型受體特點）5。值得注意的是，配體激活相應(yīng)受體后形成的受體-arrestins復(fù)合物的性質(zhì)和穩(wěn)定性反映了-arrestins的作用大小和受體未來的命運。Dennis KE等6利用激光共聚焦顯微鏡觀察顯示：apelin受體在內(nèi)源性配體apelin-13的激動下受體內(nèi)化后快速返回到細胞膜，apelin-36誘導(dǎo)的受體與-arrestin 1結(jié)合內(nèi)吞卻長時間被滯留于在胞

14、質(zhì)內(nèi)。 目前的研究發(fā)現(xiàn),-arrestin的泛素化和去泛素化與受體運輸模式有關(guān)。Perroy J等7利用BRET技術(shù)在活細胞中實時檢測到-arrestins的泛素化。刺激A類受體導(dǎo)致短暫的-arrestins泛素化。與此相反，刺激B型受體后，-arrestins被招募到細胞膜，隨后受體-arrestins復(fù)合物內(nèi)吞到內(nèi)涵體，導(dǎo)致持續(xù)的-arrestins泛素化。因此arrestin泛素化狀態(tài)對于闡明arrestin與GPCRs的相互關(guān)系或內(nèi)化機制可能起著關(guān)鍵作用。表1 GPCRs 的A型和B型受體的特征區(qū)別特征代表分子結(jié)構(gòu)特征arrestin結(jié)合胞內(nèi)循環(huán)A 2腎上腺素受體C-端沒有豐富的絲/蘇

15、氨酸群短暫、快速，低親和力的結(jié)合-arrestin（以-arrestin2為主）短暫-Arrestins泛素化，快B血管緊張素1受體C-端含豐富的絲/蘇氨酸群結(jié)合力量強和結(jié)合時間更長，同時募集-arrestin1和-arrestin2持續(xù)-Arrestins泛素化，慢1.3 -arrestin在GPCR的G蛋白非依賴信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用 盡管-arrestin是在減弱受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的背景中發(fā)現(xiàn)的，但近年的研究提示，-arrestin可以從其要“脫敏”的特定受體上直接啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而不依賴G蛋白的激活。-arrestin成為Src家族酪氨酸激酶的調(diào)節(jié)因子,也是一些細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-Jun

16、氨基端激酶(JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的支架蛋白,對GPCRs的功能活動進行調(diào)節(jié)8。G蛋白依賴信號和-arrestin引發(fā)的效應(yīng)的交互作用很大程度決定了以GPCRs為靶點藥物的細胞內(nèi)療效。最近的研究9表明偏愛-arrestin的配體（biased ligands）能夠選擇性激活G蛋白或-arrestin，從而引起顯著的生物學(xué)反應(yīng)。利用敲除-arrestin基因，小分子干擾RNA技術(shù)以及受體突變的研究方法發(fā)現(xiàn)許多的GPCRs如µ-阿片受體、血管緊張素II1型受體、ß2-腎上腺素受體、甲狀旁腺激素受體1型等都可以在無G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的情況下激活-arresti

17、n而發(fā)揮效用。Ahn 等10的研究顯示：AT1AR激活ERK1/2的機制是通過G（q）蛋白或-arrestin2完全不同的兩個途徑。Jonathan等 11利用BRET方法發(fā)現(xiàn)ß2AR的三種激動劑：乙基去甲腎上腺素、去甲腎上腺素和乙基異丙腎上腺素都具有明顯的-arrestin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的高親和力，結(jié)構(gòu)分析顯示三者都具有兒茶酚胺-碳乙基化序列，而其它的相關(guān)配體并不具備此序列。現(xiàn)在最有效治療心力衰竭藥物的作用靶點是-腎上腺素能受體（1AR和2AR）和血管緊張素型1A受體（AT1aR）,這些受體的配體不僅能阻止導(dǎo)致心力衰竭的有害的G蛋白介導(dǎo)的途徑，同時能通過招募-arrestin引起G蛋白非

18、依賴的信號途徑而保護心臟，所以-arrestin成為治療心力衰竭藥物的潛在治療靶點12。評價-arrestin的信號效應(yīng)和功能的研究方法很少。-arrestin效應(yīng)的檢測方法最單一的是測量-arrestin轉(zhuǎn)位到受體上, 研究者通過利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光標(biāo)記的-arrestin轉(zhuǎn)位到激活的受體上和利用BRET的方法檢測-arrestin與受體的相互作用發(fā)現(xiàn)：-arrestin偏愛的配體可能為-arrestin作為治療靶點提供重要的理論依據(jù)。-arrestin偏愛配體的闡明以及-arrestin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的證實也將使-arrestin偏愛的配體成為藥物研發(fā)中的活躍領(lǐng)域。2 BRET 技術(shù)及其

19、在G蛋白偶聯(lián)受體和- arrestin相互作用研究中的應(yīng)用傳統(tǒng)的檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)有：酵母雙雜交、免疫共定位，免疫共沉淀以及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶牽出試驗等，這些方法步驟繁多，多數(shù)只能在體外進行，有可能會改變蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的自然狀態(tài)。BRET技術(shù)是近幾年來出現(xiàn)的一種新的檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。它克服了傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)相互作用檢測方法對蛋白具有損害性的特點并能使在活細胞內(nèi)實時、動態(tài)開展試驗成為可能，大大提高了信息的獲得量，而且可驗證新的假說和理論。BRET技術(shù)的原理是建立在非輻射能量轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)上，在一個發(fā)光或熒光供體發(fā)光酶和一個熒光受體（如綠色熒光蛋白的突變體eYFP）

20、之間會發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。供體發(fā)光酶在相應(yīng)的底物存在時發(fā)射光波。能量受體是熒光蛋白，在一定波長范圍內(nèi)吸收光波，并在一定的波長范圍內(nèi)發(fā)射光波。能量供體（發(fā)光酶）和能量受體（熒光基團）之間能量轉(zhuǎn)移發(fā)生在供體的發(fā)射光譜必需與受體的激發(fā)波長相重疊(圖1A)；供體和受體的空間距離接近（d10nm），一般可以發(fā)生能量的轉(zhuǎn)移，兩個目的蛋白之間距離足夠近并發(fā)生相互作用，即可檢測到BRET信號(圖1B示)。BRET 種類很多，研究者可根據(jù)幾種BRET 的特點選擇適合研究特定蛋白質(zhì)之間相互作用的BRET方法。最早的BRET1實驗中，使用海腎熒光素酶(Renilla luciferase, Rluc)和加強型YFP（eY

21、FP）,以h- coelente -razine作為熒光素酶的底物,通過一個熒光素酶反應(yīng)作為激發(fā)受體分子的能量來源。然而，熒光素酶產(chǎn)生的光譜以及eYFP的發(fā)射光譜是連續(xù)的，造成背景值較高，需要進行仔細的空白對照實驗。最近兩年來，人們開始使用BRET2,該技術(shù)使用另一種熒光素酶底物DeepBlueC。DeepBlueC氧化產(chǎn)生的光譜與改進型的GFP2發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，并且能把GFP發(fā)射光譜與DeepBlueC氧化產(chǎn)生的光譜區(qū)分開來，大大提高了BRET的信噪比。延長型BRET（extended BRET）又稱eBRET可在底物熒光素底物前體EnduRen存在下，連續(xù)幾個小時適時檢測某個特定的相互作用或

22、高通量篩選多個樣品而不需要頻繁加入底物13。以上幾種BRET技術(shù)都需要：構(gòu)建供體發(fā)光酶與興趣蛋白、受體熒光素與興趣蛋白融合體并通過試劑分析、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分析、共定位等技術(shù)證明蛋白融合沒有改變興趣蛋白的功能；細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染；BRET信號檢測和數(shù)據(jù)分析等步驟。雖然BRET技術(shù)比熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)對能量轉(zhuǎn)移信號更敏感14，但是單獨利用BRET技術(shù)不能確定相互作用蛋白的細胞內(nèi)定位，通過結(jié)合免疫熒光激光共聚焦技術(shù)可以彌補其不足。BRET技術(shù)應(yīng)用日益廣泛。首先是被應(yīng)用于研究活細胞中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。利用BRET技術(shù)進行的研究約50%集中于研究細胞膜上GPCRs之間的相互作用，如研究GPCR

23、s的同源和異源二聚化、受體激活和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑15-18。從理論上講如果將- arrestin蛋白標(biāo)記上熒光蛋白，在GPCR的C端標(biāo)記上能量的供體，可以檢測- arrestin從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞膜的運輸過程。實踐證明將供體或受體連接到GPCRs的胞質(zhì)C-端，將- arrestin的N-端或C-端連接供體熒光酶或受體熒光素都能夠成功得到BRET信號。Qiu等19用BRET技術(shù)研究了HEK293細胞中- arrestin與GPCR之間的相互作用，結(jié)果顯示，激動劑激活的DOR不發(fā)生磷酸化時其第三個胞內(nèi)環(huán)和羧基末端與- arrestin1和- arrestin2結(jié)合。Klewe等通過BRET方法證明，多

24、數(shù)抗精神病藥不能刺激- arrestin與多巴胺D2 受體的結(jié)合20。Bernard Masri 21利用生物發(fā)光能量轉(zhuǎn)移方法結(jié)合激光聚焦顯微鏡結(jié)果顯示：氟哌啶、氯氮平、阿里哌唑、冬眠靈、喹硫平、奧氮平、利哌酮、齊拉西酮等一系列的抗精神分裂癥的藥物有一個共同的分子機制是抑制D2LR/-arrestin介導(dǎo)的信號而不是D2LR/Gi/o途徑，因此選擇性以D2LR/-arrestin 2的相互作用和相關(guān)的信號途徑將為抗精神病藥物的開發(fā)提供廣闊前景。BRET技術(shù)的最大優(yōu)勢是能在活細胞中實時、動態(tài)地進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究，更適合細胞內(nèi)生理條件下生物化學(xué)反應(yīng)的實際，本實驗室進行的BRET實驗選

25、用多功能熒光發(fā)光分析儀（FLUOstar OPTIMA,BMG LABTECH公司），它可用于對96孔和384孔微量板進行高通量檢測，本所已經(jīng)對Apelin受體(APJ)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進行了研究，取得了一些進展22?，F(xiàn)在正利用BRET 技術(shù)對Apelin受體與其它GPCRs之間的相互作用進行檢測，其目的是探討血管活性肽與此相關(guān)GPCR之間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)關(guān)系，對APJ及其突變體與- arrestin之間的相互作用進行研究，以進一步理解GPCR的病理生理過程并有助于新藥開發(fā)。3 結(jié) 語BRET技術(shù)為我們提供了在生理活細胞實時、動態(tài)檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的途徑。GPCRs作為主要的藥物作用靶點，其功能的

26、調(diào)節(jié)是一個非常復(fù)雜的過程。GPCR與-arrestin的相互作用持續(xù)時間比GPCRs與G蛋白相互作用的持續(xù)時間長，特別是B型GPCR 的受體與-arrestin的結(jié)合、分離、重新結(jié)合的時效關(guān)系依賴循環(huán)機制和溶酶體的降解程度需要長時間的GPCR與-arrestin相互作用的檢測。隨著人們對-arrestin調(diào)節(jié)功能認識的增加，特別是-arrestin介導(dǎo)信號傳導(dǎo)途徑研究的深入，有必要長時間實時、動態(tài)的檢測激動劑刺激后GPCRs與-arrestins的相互作用。進一步闡明-arrestin在調(diào)解G蛋白偶聯(lián)受體的功能，對于開發(fā)新一代影響GPCRs的藥物具有重要應(yīng)用價值。參 考 文 獻1 Gurevi

27、chVV, Gurevich EV. The structural basis of arrestin mediated regulation of G protein coupled receptorsJ. Pharmacol Ther. 2006Jun, 110（3）: 465502. 2 TaraA.Macey,VsevolodV. Gurevich,KimA.Neve.Preferential Interaction between the Dopamine D2Receptor and Arrestin2 in Neostriatal Neurons J. Mol Pharmacol

28、, 2004Dec，66（6）：1635-42.3 EricReiter，Robert J.Lefkowitz. GRKs and -arrestins:roles in receptor silencing,trafficking and signalingJ. Trends in Endocrinology and Metabolism.2006 May-Jun, 17(4):159165. 4 Oakley RH, Laporte SA, Holt JA, Barak LS, Caron MG., Molecular determinants underlying the formati

29、on of stable intracellular G protein-coupled receptorarrestin complexes after receptor endocytosisJ. Biol Chem ,2001 Jun, 276:1945219460. 5 Pfleger KD, Dalrymple MB, Dromey JR, Eidne KA.Monitoring interactions between G-protein-coupled receptors and -arrestinsJ.Biochem Soc Trans. 2007 Aug,35(Pt 4):7

30、64-6.6 Dennis KE. Lee, S tephen S.G. Ferguson, Susan R. George, O'Dowd BF. The fate of the internalized apelin receptor is determined by different isoforms of apelin mediating differential interaction with -arrestinJ. Biochemical and Biophysical Research Communications. Biochem Biophys Res Commu

31、n. 2010 Apr, 30;395(2):185-9. 7 Perroy J, Pontier S, Charest PG, Aubry M, Bouvier M. Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRETJ. Nat Methods. 2004 Dec,1(3):203-8. 8 Scott MG, Pierotti V, Storez H, Lindberg E, Thuret A, Muntaner O, et al. Cooperative regulation of extracellular s

32、ignal-regulated kinase activation and cell shape change by filamin A and -arrestinsJ. Mol Cell Biol. 2006 May, 26(9):3432-45 . 9 Jonathan D. Violin and Robert J. Lefkowitz, ß-Arrestin-biased ligands at seven-transmembrane receptors J. Trends Pharmacol Sci. 2007 Aug, 28(8):416-22.10 Ahn S, Sheno

33、y SK, Wei H, Lefkowitz RJ. Differential kinetic and spatial patterns of beta-arrestin and G protein-mediated ERK activation by the angiotensin II receptor J. Biol Chem. 2004, 279（34）：3551835525.11 Drake MT, Violin JD, Whalen EJ, Wisler JW, Shenoy SK, Lefkowitz RJ. -Arrestin-biased Agonism at the 2-A

34、drenergic ReceptorJ. Biol Chem. 2008 Feb, 29 , 283(9):5669-76. 12 Noor N, Patel CB, Rockman HA. -Arrestin: A signaling molecule and potential therapeutic target for heart failure.J Mol Cell Cardial（2010）,doi:10.1016/j.yjmcc.2010.11.00513 Pfleger KD, Dromey JR, Dalrymple MB, Lim EM, Thomas WG, Eidne

35、KA. Extended bioluminescence energy transfer (eBRET) for mornitoring prolonged proteinprotein interaction in live cellsJ.Cell signal,2006 Oct,18 (10): 1664-1670.14 Dacres H, Dumancic MM, Horne I, Trowell SC. Direct comparison of fluorescence- and bioluminescence-based resonance energy transfer metho

36、ds for real-time monitoring of thrombin-catalysed proteolytic cleavageJ. Biosens Bioelectron. 2009 Jan 1;24(5):1164-70.15 Roda A, Guardigli M, Pasini P, Mirasoli M .Bioluminescence and Chemiluminescence in Drug screening J. Anal Bioanal Chem. 2003 Nov, 377(5):826-33.16 Bacart J, Corbel C, Jockers R, Bach S, Couturier C.The BRET technology and its appolication to screening assays J.Biotechnol ,2008,3(3):311-324 .17 Borroto-Escuela DO, Romero-Fernandez W, Tarakanov AO, Marcellino D, Ciruela F, Agnati LF, Fuxe K. Dopamine D2 and 5-