丙型肝炎病毒細(xì)胞和動物模型的研究進(jìn)展

1、丙型肝炎病毒細(xì)胞和動物模型的研究進(jìn)展摘要：丙型肝炎病毒hepatitis C virus, HCV是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一，目前全世界約有1.7億人感染HCV。由于缺少有效的HCV細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和小動物模型，人們對其生活周期、作用機(jī)制等仍不是很清楚，從而嚴(yán)重阻礙了HCV疫苗及治療藥物的開發(fā)與研制。本文就近幾年在HCV細(xì)胞和動物模型方面的進(jìn)展作一綜述。關(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒細(xì)胞模型動物模型Progress in Establishment of HCV Cell and Animal Model Abstract: Hepatitis C virus(HCV) is a major

2、 cause of chronic liver disease, such as chronic hepatitis, hepatic cirrhosis, hepatocelhlar carcinoma, with over 170 million persistently infected individuals worldwide. Lack of proper study models has brought difficulties in the study of the mechanism of viral infection, life cycle and pathogenic

3、mechanism of HCV and also become the major obstacles in the development of efficient vaccine and new drugs for hepatitis C. Here the advances on establishment of HCV infectious cell and animal models were reviewed.Key Words: Hepatitis C virus(HCV); cell model; animal model丙型肝炎是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生難題，目前全球約有1.7億

4、人感染HCV，我國進(jìn)行的全國HCV血清流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國一般人群抗-HCV陽性率約為3.2%，全國共約4000萬人感染HCV，HCV是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一。約50-80的HCV感染者會轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿腥净颊撸蠹s20的患者會在20年內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不?。一旦轉(zhuǎn)為肝硬化，每年將會有15的病人開展成為肝癌，嚴(yán)重地威脅著人類的健康。長期以來，缺少適宜的研究模型一直是HCV研究的瓶頸，近年來HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)的建立使其相關(guān)研究提供了強(qiáng)有力的工具，為從根本上認(rèn)識HCV奠定了根底。本文概述了近年來HCV研究模型的開發(fā)進(jìn)展。1 HCV的根本分子生物學(xué)特征HCV屬黃病毒科丙型肝炎病毒屬，為單股

5、正鏈RNA病毒，基因組全長9.6 kb，含有一個開放的編碼區(qū)，可編碼一個多聚蛋白前體，此多聚蛋白前體由宿主和病毒的信號肽酶剪接成3個結(jié)構(gòu)蛋ElCore、E1、E2和7個非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。HCV C蛋白由191個氨基酸殘基組成，是HCV基因組中較為保守的結(jié)構(gòu)區(qū)域。5UTR區(qū)最為保守，而3UTR對于HCV RNA的正常復(fù)制是不可缺少的圖11。圖1 HCV基因組結(jié)構(gòu)2 HCV的細(xì)胞模型2.1 感染模型 感染是建立HCV細(xì)胞模型最簡單直接的方法，是用HCV陽性血清直接和HCV敏感細(xì)胞共同培養(yǎng)使細(xì)胞感染。早在1992年，Shimizu等2報(bào)道用鼠逆

6、轉(zhuǎn)錄病毒感染人T淋巴細(xì)胞系MOLT-4Ma和HPB-Ma，再用可連續(xù)感染大猩猩的病毒株和上述細(xì)胞共培養(yǎng)，24 d后仍可在細(xì)胞內(nèi)檢測到病毒RNA的存在。隨后用人淋巴細(xì)胞白血病病毒HTLV-I預(yù)處理MT-2細(xì)胞系后再用HCV感染也得到類似的結(jié)果。研究人員分別在HPB-Ma、PBMC、Huh-7、Hep-G2和其他SV-40 T抗原永生化肝臟細(xì)胞系上也建立了HCV持續(xù)感染系統(tǒng)，同時觀察到此感染效率與病毒體內(nèi)滴度密切相關(guān)，并可被相應(yīng)抗體中和和干擾素抑制持續(xù)復(fù)制的病毒直徑約為50 nm，采用RT-PCR方法可間隙性檢測出。Iacovacci 等3那么選用人胎肝細(xì)胞作為培養(yǎng)HCV的靶細(xì)胞，用競爭性PCR定

7、量檢測病毒RNA 分子，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)后30d 到達(dá)HCV復(fù)制水平的最高值。他們還發(fā)現(xiàn)血清中病毒顆粒的蔗糖梯度密度為1.181.36g/cm3，而細(xì)胞和上清中檢測到的病毒顆粒密度有上下兩種高：1.181.36 g/cm3；低：1.051.105 g/cm3。Rumin等4用HCV陽性血清和人肝細(xì)胞共同培養(yǎng)，觀察4個月，發(fā)現(xiàn)這些感染細(xì)胞在10d 后可檢測到正鏈RNA，而培養(yǎng)上清中的RNA 滴度在3個月中也有了升高。而Yoshikura H等5用HCV患者血清感染細(xì)胞時，也發(fā)現(xiàn)了病毒顆粒密度有上下兩局部，密度高的局部感染性低，低密度的感染性高。對于這種現(xiàn)象，他們認(rèn)為可能是HCV顆粒結(jié)合了抗HCV抗體，導(dǎo)

8、致了密度的增加，同時干擾了HCV對細(xì)胞的吸附及在細(xì)胞中的復(fù)制，使HCV對細(xì)胞的感染性降低。用抗人免疫球蛋白對這種血清進(jìn)行免疫檢測，證實(shí)了低感染性高密度HCV確實(shí)結(jié)合有IgG抗體。用陽性血清感染細(xì)胞方便快捷，缺點(diǎn)但病毒復(fù)制產(chǎn)量較低，且不能長期傳代培養(yǎng)。2.2 轉(zhuǎn)染模型具體做法是利用RT-PCR方法獲得的全長HCV cDNA，采用各種方法將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入易感細(xì)胞，通過胞內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄可產(chǎn)生和病毒相同的RNA轉(zhuǎn)錄本，從而模擬病毒的感染過程。相對于HCV病毒直接感染的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，克隆的病毒基因組轉(zhuǎn)染模型保證了用于感染細(xì)胞的基因組的同源性，且能夠在體外大量合成。Kishine等6從感染細(xì)胞提取HCV RNA，逆

9、轉(zhuǎn)錄出cDNA，將其改造后 剔除結(jié)構(gòu)基因，保存與復(fù)制有關(guān)的非結(jié)構(gòu)基因和3NCR、5NCR，以保證不影響復(fù)制整合入pBR322MC中，并插入抗Huh-7 基因、ECMV-IRES，構(gòu)建重組質(zhì)粒pNNR22RU，轉(zhuǎn)染Huh-7 細(xì)胞培養(yǎng)，再從中選擇抗G418的Huh-7 細(xì)胞進(jìn)行亞克隆。最后從這些細(xì)胞克隆中檢測到病毒產(chǎn)物 非結(jié)構(gòu)蛋白和亞基因RNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明HCV 亞基因復(fù)制子能在一些細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中有效復(fù)制，并維持較長的時間，有利于將來進(jìn)一步研究丙肝病毒復(fù)制機(jī)制及新藥篩選。Pietschmann等7把構(gòu)建好的選擇性全長HCV基因轉(zhuǎn)入Huh-7 中，并進(jìn)行3 個突變來加強(qiáng)在細(xì)胞中的復(fù)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能

10、在細(xì)胞中持續(xù)檢測到該基因達(dá)6個月，結(jié)構(gòu)蛋白穩(wěn)定表達(dá)。Lohmann等8在研究HCV 在細(xì)胞中復(fù)制時，發(fā)現(xiàn)Huh-7 是較好的病毒培養(yǎng)的細(xì)胞系統(tǒng)。選擇性亞基因復(fù)制子也需要核苷酸突變來加強(qiáng)病毒復(fù)制，NS3的突變對復(fù)制作用小，但在聯(lián)合高適應(yīng)性突變時能加強(qiáng)病毒復(fù)制；而NS5、NS4B 的適應(yīng)性突變作用可直接加強(qiáng)復(fù)制。另外也發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞在RNA有效復(fù)制時也起了非常重要的作用，他們檢測了相同Huh-7 細(xì)胞系的幾代，發(fā)現(xiàn)不同代次的Huh-7在支持復(fù)制子擴(kuò)增的能力相差100倍。這些數(shù)據(jù)資料說明在細(xì)胞培養(yǎng)中HCV 的復(fù)制有效性很大可能是由病毒序列和宿主細(xì)胞本身共同決定的。3 動物模型3.1黑猩猩黑猩猩是公認(rèn)的

11、最好的HCV感染實(shí)驗(yàn)動物。已經(jīng)證實(shí)HCV在黑猩猩體內(nèi)復(fù)制，黑猩猩對HCV的應(yīng)答過程與人類相似。Shimizu等2研究發(fā)現(xiàn)，黑猩猩接種HCV后3-4天即可于血清中檢測出HCV RNA，7天時HCV RNA水平到達(dá)峰值，為107-108CID/L，同時血清ALT水平最高。感染后3天，肝細(xì)胞活檢可檢測到HCV RNA。同人類一樣，感染HCV的黑猩猩中有很大比例40%由于機(jī)體免疫系統(tǒng)不能去除病毒，而開展成持續(xù)性感染。人與黑猩猩在HCV 轉(zhuǎn)為慢性感染的比例上的差異，可能是因?yàn)橛性S多患者急性期臨床表現(xiàn)不明顯而未能發(fā)現(xiàn)。但HCV在宿主體內(nèi)是如何逃防止疫監(jiān)視而開展為慢性感染的機(jī)理仍不清楚。病理學(xué)研究說明，黑猩

12、猩的肝臟損害沒有人類嚴(yán)重，觀察不到肝纖維樣變性和肝硬化，但在組織形態(tài)學(xué)和壞死性炎癥病變方面與人相似?？偟膩碚f，在人和黑猩猩身上所觀察到的臨床參數(shù)比擬接近，用黑猩猩來研究病毒在體內(nèi)復(fù)制情況和發(fā)病機(jī)理及篩選HCV疫苗都是非常有價(jià)值的。但由于黑猩猩作為丙肝模型缺乏慢性肝病的表現(xiàn)，使得在肝硬化和肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)理的研究方面受到限制9。此外，費(fèi)用等問題也限制了它的應(yīng)用范圍。3.2 猴GBV-B是近年來發(fā)現(xiàn)的黃熱病毒屬中的一員，是一種單股正鏈RNA病毒，在所有的動物病毒中，GBV-B與HCV有高度核酸同源性，其多聚蛋白在氨基酸水平上有2530的同源性，因此推想治療HCV感染的抗病毒化合物同樣會對GBV-B有

13、作用，使得GBV-B作為HCV的替代病毒建立感染模型成為可能。GBV-B可以感染絨猴，GBV-B感染絨猴40-60 d后可到達(dá)108109拷貝，60-80 d后病毒逐漸被去除。原代培養(yǎng)的絨猴肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中及細(xì)胞中也成功地檢測到了GBV-B的感染。用HCV蛋白酶抑制劑可以有效降低體外培養(yǎng)絨猴肝細(xì)胞上清中及絨猴體內(nèi)的病毒含量。Martin等10用合成的GBV-B RNA直接注射入小絹猴的肝臟，可誘使其產(chǎn)生持續(xù)性GBV-B感染，兩個感染動物中有一個感染后病毒血癥超過2年，且出現(xiàn)了門靜脈周圍單核細(xì)胞浸潤、線粒體結(jié)構(gòu)改變及脂肪變性等慢性肝炎的組織病理學(xué)改變11。近年有關(guān)猴作為HCV感染模型的報(bào)道不多，

14、其作為可供研究HCV使用模型的可能性有待驗(yàn)證。3.3 樹鼩樹鼩是一種與靈長類親緣關(guān)系較近的哺乳動物，對多種人類病毒，包括甲、乙和丁型肝炎病毒易感。Xie等12對樹鼩進(jìn)行病原接種發(fā)現(xiàn)，僅有1/4能感染HCV，在體內(nèi)檢測到短暫或間歇的低效價(jià)病毒血癥。 假設(shè)樹鼩接受cGy750照射后再進(jìn)行病原接種，HCV感染效率、病毒血癥及抗體效價(jià)均明顯提高。但由于樹鼩是野生動物，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)困難，廣泛應(yīng)用受到限制。3.4 小鼠3.4.1 轉(zhuǎn)基因小鼠模型小鼠主要有轉(zhuǎn)基因小鼠模型、質(zhì)料轉(zhuǎn)染鼠模型和人鼠嵌合體肝移植鼠模型。轉(zhuǎn)基因技術(shù)自1980年代初開展起來現(xiàn)已成為生命科學(xué)領(lǐng)域中普遍應(yīng)用的常規(guī)技術(shù)手段，HCV轉(zhuǎn)基因小鼠主要

15、為結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)基因小鼠，在病毒導(dǎo)致肝炎、肝脂肪及肝癌的致病機(jī)制方面的研究起了很大的作用。Pasquinelli等13將編碼HCV結(jié)構(gòu)蛋白的C、E基因分別插入到鼠主尿蛋白下游，建立攜有HCV基因片段的轉(zhuǎn)基因小鼠。這種對T細(xì)胞免疫應(yīng)答功能的抑制可能是由于HCV感染增強(qiáng)了T 淋巴細(xì)胞對Fas-介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性，HCV核心蛋白可能是通過促進(jìn)Fas-介導(dǎo)的T 淋巴細(xì)胞凋亡以及肝臟的T 淋巴細(xì)胞浸潤而導(dǎo)致肝損傷。HCV各組成蛋白的致癌機(jī)制也是以HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型進(jìn)行研究的，Kato等14發(fā)現(xiàn)在飼養(yǎng)了1824個月后，HCV核心基因轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟內(nèi)均未出現(xiàn)腫瘤，但是經(jīng)四氯化碳處理后可發(fā)生肝細(xì)胞癌，因此

16、認(rèn)為HCV核心蛋白導(dǎo)致的肝細(xì)胞再生速率的提高可能是增強(qiáng)肝臟發(fā)生癌變機(jī)率的機(jī)制之一。成軍等15發(fā)現(xiàn)約80%的HCV結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型發(fā)生肝臟等內(nèi)臟的脂肪變，為研究HCV慢性感染引起的脂肪變奠定了根底。Kamegaya等16將HCV E1蛋白、E2蛋白和核心蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠用DEN處理后于第32周處死，然后檢測細(xì)胞的增殖和凋亡情況，發(fā)現(xiàn)兩組小鼠與正常小鼠間的細(xì)胞增殖沒有顯著差異，但核心-E1-E2 轉(zhuǎn)基因小鼠的較大，而凋亡指數(shù)卻小于核心基因轉(zhuǎn)基因小鼠，因而認(rèn)為HCV結(jié)構(gòu)蛋白促進(jìn)腫瘤生成的原因可能是由于抑制肝細(xì)胞凋亡而并不是促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。雖然轉(zhuǎn)基因小鼠作為HCV感染模型的報(bào)道較多，但各方研究

17、不盡相同，且存在很多問題，轉(zhuǎn)基因小鼠處于免疫耐受狀態(tài)，對HCV導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的原因，究竟是病毒的直接作用還是病毒與機(jī)體免疫系統(tǒng)的相互作用尚有爭議，并難以用于疫苗的研發(fā)。3.4.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠模型 由于HCV病毒不能直接感染小鼠，因此人們嘗試用含有HCV的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞或體內(nèi)轉(zhuǎn)染的方法表達(dá)HCV蛋白。詹林盛等17用含內(nèi)部核糖體起始位點(diǎn)IRES的HCV 5NCR及局部多聚蛋白起始區(qū)序列與熒光素酶基因融合，然后插入含CMV啟動子的Pci-neo質(zhì)粒中，得到真核表達(dá)質(zhì)粒Phcv-neo4，進(jìn)一步采用水動力轉(zhuǎn)染法將pHCV-neo4表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到小鼠體內(nèi)，在小鼠肝臟檢測到熒光素酶的高水平表達(dá)，同時H

18、CV IRES介導(dǎo)的熒光素酶在小鼠心、脾、腎臟組織中也得到表達(dá)，但表達(dá)量僅為肝臟的1100l1 000，可以作為體內(nèi)瞬時評價(jià)以HCV IRES為靶位的抗HCV藥物活性的小鼠模型。3.4.3 人鼠嵌合體肝移植鼠模型此方法是在免疫缺陷小鼠體內(nèi)移植人肝細(xì)胞，通過肝門靜脈或脾髓注射，使小鼠感染HCV。Brown等19利用原代或無限增殖的人肝細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果說明所建立的HCV小鼠模型可用于HCV的體內(nèi)研究。Mercer等20通過在纖維蛋白溶酶原激活蛋白轉(zhuǎn)基因的SCID小鼠肝臟內(nèi)植入正常人肝組織，然后接種HCV患者血清建立了一種HCV嵌合感染的小鼠模型，該小鼠的肝臟中能檢測到病毒RNA的復(fù)制。其體內(nèi)病毒

19、滴度最高能到達(dá)1:1950，而且這種感染能連續(xù)傳遞三代。Galun等21采用的方法是給免疫缺陷小鼠BNX以放射性照射，然后用免疫缺陷小鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行重建，再把感染了HCV患者的肝碎片移植到用前述方法所制備的小鼠腎被膜下。這種三聯(lián)體小鼠在移植后1015天內(nèi)，有50%以上用RT-PCR法可以檢測到HCV RNA。Ilan等22報(bào)道三聯(lián)體HCV小鼠感染率為85%，且可以用抗病毒藥物減輕小鼠的病毒血癥，但這種方法由于免疫排斥，肝存活時間較短，且病毒血癥水平較低，而影響該鼠對人肝細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受。4 結(jié)語近幾年，在建立HCV動物模型技術(shù)上有了很大突破。新的動物模型根本上都是在人鼠嵌合體轉(zhuǎn)基因小鼠根底上

20、建立的，必將為HCV的研究帶來新的突破。鼠的免疫缺陷恰恰能滿足異種動物成分的介入，從而擴(kuò)大了HCV模型的應(yīng)用。但是還有待于進(jìn)一步研究更加方便、精確的小動物模型，進(jìn)行有關(guān)發(fā)病機(jī)制、藥物以及疫苗方面的研究。參考文獻(xiàn)1. Ciesek S, Steinmann E, Wedemeyer H, et al. Cyclosporine A inhibits hepatitis C virus nonstructural protein 2 through cyclophilin A. Hepatology. 2021, 50(5): 1638-1645.2. Shimizu YK, Lwamoto A，

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